ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

このプロトコルの全体的な目標は、ヒト成体皮膚線維芽細胞から誘導されたニューロンの高収率培養物を生成することです。この方法は、細胞の年齢を維持する患者ベースの神経システムの変性を可能にするため、神経疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、あらゆる年齢の人々から誘導されたニューロンを、わずか25日間で非常に標準化され効率的な方法で生成できることです。

これにより、疾患モデリング、毒物学、診断、非常に大規模な薬物スクリーニングアッセイなど、幅広い生物医学的応用が可能になります。その手順を実演するのは、脳トレを行うユニットの博士課程の学生であるシェルビーと、私たちの研究室のカルロニアです。まず、自動細胞解凍システムを使用して、成体のヒト真皮線維芽細胞を解凍します。

自動セルカウンターで細胞数をカウントした後、10ミリリットルの線維芽細胞培地を含むT-75フラスコあたり20万個の細胞を播種します。摂氏37度と二酸化炭素5%に維持します。翌日、古い培地を新しい線維芽細胞培地と交換します。

細胞が95%の密度に達するまで、線維芽細胞培地を3〜4日ごとに交換し続けます。リプログラミングから成体ヒト真皮線維芽細胞をプレーティングする1時間前に、24ウェルプレートの各ウェルに250マイクロリットルの0.1%ゼラチンをコーティングします。プレートを摂氏37度でインキュベートします。

フラスコから線維芽細胞培地を吸引し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄します。洗浄後、T-75フラスコあたり1.5ミリリットルの0.05%トリプシンで細胞を摂氏37度で3分間溶解します。次に、トリプシン溶液を中和するために3ミリリットルの線維芽細胞培地を追加します。

フラスコ内の細胞を2回洗い流すことにより、15ミリリットルのチューブ内で分離した細胞を冷却します。次に、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。上清を排出し、細胞ペレットを1ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁します。

次に、13.2ミリリットルの線維芽細胞培地に1,320,000個の細胞の細胞懸濁液を調製して、培地1ミリリットルあたり100,000個の細胞を達成します。プレートからゼラチンを吸引した後、プレートをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄します。次に、500マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。

13.2ミリリットルの線維芽細胞を中程度から摂氏37度まで温めます。次に、レンチウイルスベクターを層流フード内の室温で解凍します。成体のヒト真皮線維芽細胞に感染するために必要なレンチウイルスを、トランスダクションエンハンサーなしで培地に20回の感染の多重度で追加します。

次に、培地を500マイクロリットルの線維芽細胞培地に交換し、レンチウイルスベクターを添加します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、レンチウイルスを含む培地をレンチウイルスベクターを含まない新鮮な線維芽細胞培地と交換します。

ウイルス形質導入後3日目に、線維芽細胞培地を取り出し、500マイクロリットルの初期ニューロン変換培地を追加します。週に2回または3回、各ウェルから225マイクロリットルの古い培地を250マイクロリットルの新鮮な初期ニューロン変換培地と交換します。ウイルス形質導入後18日目に、早期ニューロン変換培地を取り出し、500マイクロリットルの後期ニューロン変換培地と交換します。

以前と同様に、25日目または実験エンドポイントまで2〜3日ごとに培地を交換し続けます。1000マイクロリットルのピペットを使用して、培地を取り出します。次に、250マイクロリットルの細胞解離剤を2つ各ウェルに加え、細胞が剥離して単一細胞として浮遊するまで、プレートをインキュベーターに10〜20分間放置します。

その間に、FACSバッファを準備してください。1000マイクロリットルのピペットで回転させます。細胞の塊が残っている場合は、もう少し長くインキュベートします。

得られた単細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。後期神経変換培地でウェルを2回洗い流し、同じ1.5ミリリットルチューブに移します。その後、400 Gで5分間遠心分離し、スーパーナテントを廃棄します。

次に、細胞ペレットを200マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。再度、細胞を400 Gで5分間スピンダウンし、スーパーナテントを廃棄します。細胞をFACSバッファーに再懸濁し、遠心分離します。

さらに 2 回繰り返します。次いで、ヒトCD56抗体を含有する50マイクロリットルのFACS緩衝液に細胞ペレットを1〜50の濃度で氷上で15分間、光から離れて再懸濁する。細胞を400Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを200マイクロリットルのFACS緩衝液に溶解して細胞を洗浄します。

再度、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。FACSバッファーで2回洗浄した後、遠心分離を行います。最後に、ヨウ化プロピジウム1ミリリットルあたり10マイクログラムを含む200マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。

NCAM抗体またはヨウ化プロピジウムで染色されていない対照サンプルの蛍光強度レベルに基づくゲーティングを使用して、NCAM陽性細胞およびヨウ化プロピジウム陰性細胞を選別します。自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントし、ポリ-L-オルニチンフィブロネクチンとラミニンコーティングプレートに50, 000細胞/センチメートル四方の播種を遅発ニューロン変換培地で行います。実験のエンドポイントまで、後期ニューロン変換培地を使用して、培地の半分を週に2〜3回交換し続けます。

代表的な位相コントラスト画像は、変換期間中の細胞の形態学的変化を示しています。細胞形態の大きな変化は、5日目から見られます。22日目までに、細胞の約半分がニューロンに変換されます。

代表的なアミノ蛍光画像は、細胞内の標準的なニューロンマーカーの存在を示しています。25日目までに、細胞はニューロンの形態を取得し、MAP2やTAUなどのニューロンマーカーを発現します。核はDAPIで染色されます。

このビデオを見れば、成体ヒトの線維芽細胞から誘導ニューロンを生成する方法についてよく理解できるはずです。これには、リプログラミング、ウイルス形質導入、細胞維持、精製のためのFACSソーティングのための細胞のプレーティングが含まれます。この技術の開発は、神経疾患の分野の研究者が、この疾患に関連するさまざまな特徴や潜在的な治療法を研究する道を開きます。

そして、それは人間の神経系であるだけでなく、患者と疾患の両方に固有のシステムでも行うことができます。