Name: ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ成人皮膚線維芽細胞から誘導神経細胞を高収率で作製するベクター法。25日間で患者特異的神経モデルを構築し、神経疾患の病態解明と創薬スクリーニングに応用可能です。

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テクニカル サポートありがとうマリー persson さん Vejgården。これらの結果につながる研究は、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムの下で欧州研究評議会ニューヨーク幹細胞財団から資金を受けている: FP/2007-2013 神経幹細胞修復 (号 602278) し ERC 助成契約なし。30971、スウェーデン研究評議会 (許諾契約 2016-00873 521-2012-5624 と 70862601/Bagadilico)、スウェーデンのパーキンソン財団 (Parkinsonfonden) とルンド大学 Multipark (で学際的な研究に戦略的研究分野パーキンソン病)。ジャネル Drouin Ouellet はカナダの協会の健康研究 (機構) フェローシップ (#358492) によってサポートされ、ロジャー ・ バーカーがサポートされている、大学のケンブリッジ/アデンブの病院に NIHR バイオメディカル研究センター助成金によって。マリン Parmar がニューヨーク幹細胞財団ロバートソン捜査官です。シェルビー シュリグレー マリー キュリー スクウォドフスカ革新的なトレーニング ネットワークと付与契約第 676408 の下で欧州連合の地平線 2020 プログラム (H2020 MSCA ITN 2015) によって資金を供給します。

成人皮膚線維芽細胞は脳修復 (ケンブリッジ、イギリス) のジョン ・ ヴァン ・ Geest センターで研究パーキンソン病やハンチントン病の診療所から得られ、ローカル倫理的な承認 (REC 09/H0311/88) の下で使用されます。皮膚生検の手順の詳細については、参照8を参照してください。
1. 皮膚線維芽細胞のプログラムし直すための準備
<ol><li>システムまたは 37 ° C の水浴を融解自動セルを使用して、大人のひと皮膚繊維芽細胞 (aHDFs) を解凍し、線維芽細胞培地 10 mL に T75 フラスコ (自動化された細胞カウンターの数) あたりの 200,000 のプレート (表 1参照) で 5% CO237 ° C。</li>
	<li>次の日に線維芽細胞培地で完全な中型の変更を実行します。</li>
	<li>線維芽細胞培地ごとに 3-4 日、電池が 95% の confluency に達するまでを変更します。 注: 1 つの合流フラスコ約 1,000,000 セルが含まれます。細胞株 (セクション 2) の株式または (セクション 3) をプログラムし直すための直接再メッキの準備を構築する、aHDFs を固定できます。</li>
</ol>2. 皮膚線維芽細胞の凍結
<ol><li>4 ° C で冷蔵庫、アイス ボックスに速度制御凍結コンテナーを配置します。</li>
	<li>3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。</li>
	<li>線維芽細胞培地 (ウシ胎児血清 (FBS) を含む) トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集するを追加します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターの値を使用してセルをカウントします。(推奨) の凍結バイアルあたり約 500,000 aHDFs。</li>
	<li>5 分間 400 x g で細胞をスピンします。</li>
	<li>凍結培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します (表 1参照) や極低温の管に転送。速度制御の冷凍コンテナーに直接チューブを配置します。</li>
	<li>-80 ° c の装置を一晩凍結制御率を格納します。次の日は-140 ° C のフリーザーにチューブを転送し、必要になるまでを格納します。</li>
</ol>3. (日 − 1) をプログラムし直すためのめっき
短期的実験 (最大 30 日) にゼラチン コーティングを使用する勧めします注意。また、長期実験のためポリ L-オルニチン、フィブロネクチン、ラミニン (PFL) コーティングを開始する勧めします。
<ol><li>ため、aHDFs をめっきする前に 60 分 0.1% ゼラチン (250 μ L/ウェル) で 24 ウェル プレートをコートし、37 ° c. で孵化させなさい</li>
	<li>線維芽細胞、aHDFs 培地を吸引します。DPBS で一度洗います。3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。</li>
	<li>トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集する線維芽細胞培地を追加します。</li>
	<li>スピン ・ ダウン 5 分破棄上清の 400 x g で細胞と線維芽細胞培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>(染色トリパン ブルー色素の 90% 以上は細胞質の良い変換チェックできるように) 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>完全な 24 ウェル プレート 1,320,000 13.2 mL 中の 100,000 セル/mL の懸濁液 (または 550 μ L 必要な井戸の数を掛けた線維芽細胞培地で細胞/ウェル 55,000) を達成するために線維芽細胞中の細胞の懸濁液を準備します。</li>
	<li>プレートからゼラチンを吸引し、DPBS で 2 回洗ってください。各ウェルに、細胞懸濁液 500 μ L を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩インキュベートします。</li>
</ol>4. ウイルス伝達 (0 日)
注: カテゴリ 2 装置およびウイルスを中和するためにエージェントが使用にレンチ ウイルス粒子の操作が必要です。ダブル ペア手袋の身に着けていることを強くお勧めします。
<ol><li>ウォーム アップ 13.2 mL 37 ° c. に線維芽細胞中の</li>
	<li>転写因子Ascl1 Brn2 2 つ短いヘアピン Rna (shRNA) を室温で残りをターゲットを含むレンチウイルスベクターを解凍します。 注:8; を参照を参照してください。プラスミドのリポジトリで利用可能です。レンチを生成する手順の詳細については9を参照を参照してください。</li>
	<li>20 の任意の伝達の増強物のない媒体にレンチ ウイルス感染 (MOI) の多様性で aHDFs に感染するために必要な量を追加します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56904/56904eq1v2.jpg">
</li>
	<li>線維芽細胞培レンチウイルスベクター (500 μ L/ウェル) 24 ウェル プレートの中に置き換えるし、5% CO2の 37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>次の日は、レンチウイルスベクターせず新鮮な線維芽細胞培地で井戸の中を置き換えます。 注: 媒体は感染 7 日間と次のウイルスの伝達の最初の週の間に十分な保護と処理手順の使用など。</li>
</ol>5. 変換細胞の維持
注: 変換が開始されるとセルが持ち上げるに敏感プレートをチップアップし、1,000 μ L ピペットを使用してデタッチ細胞を避けるためにメディアを削除するときに注意してください。
<ol><li>3 日目、線維芽細胞培地を取り除き、早期神経変換中を 500 μ l 添加 (表 1参照)。</li>
	<li>週に 2 ~ 3 回は 225 の井戸から古い媒体の μ L と新鮮な初期神経変換中の追加の 250 μ L を取る。</li>
	<li>18 日に各ウェルから媒体をすべてを削除し、後半神経変換中の 500 μ L に置き換えます (表 1参照)。</li>
	<li>後期神経変換中と上のとして媒体の半分の 25 日目または実験エンドポイント (図 1 a) まで 2-3 日を変更していきます。 注: セルは実験のためのすべてのよくないメッキパーツされた場合、は、媒体の明白な蒸発を防ぐため、井戸の間の変動を最小限に抑えるために、PBS または水で空井戸を記入します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>作業濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">線維芽細胞培地</td>
		</tr>
<tr>
<td>基礎培地</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">凍結中</td>
		</tr>
<tr>
<td>線維芽細胞培地</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">初期神経変換中 (ENM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>神経分化培地</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB 431542</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>酒を飲むこと</td>
			<td>100 μ g/mL</td>
			<td>0.5 μ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDN 1931189</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>バルプロ酸</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM 22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>20 μ G/ml</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>10 μ G/ml</td>
			<td>10 ng/μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>db キャンプ</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">後期神経変換中 (LNM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>神経分化培地</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM 22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>20 μ G/ml</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>10 μ G/ml</td>
			<td>10 ng/μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>db キャンプ</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">FACS バッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS 1 x [- カルシウム、- マグネシウム - フェノールレッド]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNAase</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 使用異なる培地の組成します。線維芽細胞培地を含む、媒体、初期神経変換中、後期の神経変換中、FACS バッファーを凍結このプロトコルで必要なすべてのメディア構成の完全な説明。
6. ガラス Coverslips 電気生理学的記録
注: 白衣、ゴーグルを着用、手袋をダブル、ヒューム フードの仕事のすべてを完了することをお勧めします。このプロトコルは10から適応です。
<ol><li>重複なしのガラス皿の底にガラス coverslips を配置します。</li>
	<li>掃除用洗剤 (約 30 mL) を振動中に危険にさらすオーバーフローなし coverslips のすべてが水没する一般的なラボを追加します。2 h の遅い速度で軌道シェーカーの上に置きます。</li>
	<li>脱イオン水をオートクレーブで 6 回 (各 30 分) を洗ってください。</li>
	<li>95% のエタノールの 2 h を追加します。</li>
	<li>エタノールを取り外して coverslips が乾くまで待ちます。</li>
	<li>一度乾燥、ガラス ビーカー、coverslips に転送し、coverslips が水中に沈むまでに 70% の硝酸を追加します。</li>
	<li>60 分間の超音波発生装置浴にガラス ビーカーを配置します。</li>
	<li>硝酸を取り外してオートクレーブ脱イオン水にて 3 回洗浄します。 注意: は、暴力的な反応につながるよう常に酸と水、周りの他の方法ではないに追加します。</li>
	<li>できるだけビーカーから同様に多くの水を削除し、coverslips が水中に沈む; まで濃塩酸 (塩酸) を追加ビーカーとパラフィン フィルムでカバーを旋回します。</li>
	<li>60 分間超音波 (50-60 Hz、30 W)。</li>
	<li>可能であり、場所として coverslips から適切なゴミ箱に限り HCI を削除します。2 回オートクレーブ脱イオン水ですすいでください。</li>
	<li>フードから coverslips を取り出して、HCI のすべてが削除されるまで、20 回 (またはそれ以上) に脱イオン水をオートクレーブですすいでください。</li>
	<li>一度乾燥、滅菌 24 ウェル プレート coverslips に配置。</li>
	<li>Uv (紫外線) を受ける板を配置一晩光。次の日、coverslips を使用する準備ができています。 注: ガラス coverslips が使用されている場合は、PFL コーティングを使用する推奨です。単純に (滅菌鉗子を使用して) 24 ウェル プレートの各ウェルに 1 つ coverslip を配置し、以下のプロトコルに従います。</li>
</ol>7. PFL 長期的文化のコーティング
<ol><li>ポリ-L-オルニチン (500 μ L/ウェル) と 24 ウェル プレートをコート、5% CO2の 37 ° C で一晩置いておきます。</li>
	<li>ポリ L-オルニチンを吸引し、フォーム滴上十分乾燥しているまで待ちます。</li>
	<li>ドロップ (約 60 μ L) それぞれの中心でラミニンのよくし、カバーガラスの表面全体をカバーを確認します。5% CO2の 37 ° C で 2 時間 45 分を残します。</li>
	<li>DPBS 3 回洗います。</li>
	<li>フィブロネクチン (500 μ L/ウェル) を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩おきます。</li>
	<li>セルを追加する前に DPBS で一度洗う。 注: PFL コーティングは進歩的な細胞死は 30 日から予想されることですが、プラグイン (100 日以上) の長い言葉文化に使用できます。</li>
</ol>8. FACS
注: 再 FACS 後細胞をプレートに並べ替え PFL コーティング プレート 48 h で事前準備します。細胞は伝達次以降 20 日目から神経細胞接着分子 NCAM 抗体を使用して並べ替えることができます。
<ol><li>1,000 μ L ピペットでメディアを削除 (細胞分離を避けるためには洗浄しないでください)。</li>
	<li>解離エージェント (250 μ L/ウェル) セルを追加、単一セルとして細胞リフトとフロートまで 10-20 分間おきます。</li>
	<li>この時間の間に FACS バッファーを準備します。</li>
	<li>1,000 μ L ピペットで軽くカップを刻んだ。いくつかの塊が残っている場合はもう少し、インキュベートします。</li>
	<li>単一細胞懸濁液を取得すると、井戸からそれを削除し、1.5 mL チューブに配置。</li>
	<li>同じ 1.5 mL チューブに後期神経変換中と場所でうまく 2 回フラッシュします。</li>
	<li>5 分間 400 x g でスピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。</li>
	<li>FACS バッファーを 200 μ l 添加の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>スピン ・ ダウン 5 分 400 x g でセルと上澄みを廃棄します。</li>
	<li>8.8、8.9 の手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>1:50 15 分間氷の上の濃度でひと CD56 (NCAM) 抗体を含む FACS バッファーの 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。光から保護します。</li>
	<li>5 分間 400 x g で細胞をスピンします。</li>
	<li>200 μ L FACS バッファーを洗浄し、5 分の 400 x g で細胞をスピンで再懸濁します。</li>
	<li>8.13 のステップを繰り返します。</li>
	<li>Propidium ヨウ化 (PI; 10 μ G/ml) を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。NCAM 正 (iNs) および PI 否定的な (ライブ) 細胞の FACS を用いたゲート NCAM 抗体または PI 染色しないコントロール サンプルの蛍光強度レベルに基づいて並べ替えます。</li>
	<li>後期神経変換媒体を含んでいる管における NCAM の陽性細胞を収集します。</li>
	<li>PFL コーティング皿に後期神経変換中高密度 (50,000 セル/cm2) でセル自動化された細胞カウンターと再プレートを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>培地の半分に実験エンドポイント (図 1 a) まで後期神経変換中週 2-3 回を変更していきます。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

メソッドをプログラムし直すこの一ステップ/1 つのベクトルは、大人の線維芽細胞からプラグインを取得する効率的な方法を提供します。大人の線維芽細胞は、以前報告の約 5-1012,13効率限られた研究胎児線維芽細胞よりも隠密に通常はるかに困難。ただし、この新しいプロトコルでは、約 508神経の収量 (MAP2 + 細胞として測定) を達成するために不可能です。さらに、我々 のプロトコルは、変換効率を失うことがなく複数回を継が真皮の繊維芽細胞で使用できます。これまで変換効率の低下を検出することがなく最大 14 回の継代細胞を使用しています。また、52 と 87 歳のドナーから線維芽細胞と私たちの手で効率をリプログラミングに違いはありません。年齢や他の細胞をこのコンス トラクターを使用してテストの病気の詳細については、参照8を参照してください。他の研究はまた報告ない 0 から 89 年4ドナーとレンチ ウイルス ベースおよび小さい分子が強化されたプロトコルを使用して変換効率の違い。さらに、0 から 86 年間7間ドナーとのすべての年齢層の線維芽細胞神経細胞リプログラミングの miRNA ベースの一貫した適用を報告されています。このルートを通じて成熟したニューロンは約 12-15 週間生体外でまたは生体内移植8に続く約 8 週間で取得できます。それは病気と患者の双方にアクセスを与えるので、これは便利ですが簡単にアクセスできる組織から特定の人間を。このプロトコルは効率的、100% 神経収量を生成しないこと、例えば FACS を用いた浄化手順が必要なようです。
このプロトコルの中で最も重要なステップは、ウイルス伝達 (プロトコル セクション 4) です。ウイルス価は正確には、変換のための aHDFs の正確な数を持つメッキに加えてが重要です。このプロトコルで使用する推奨価は 4 × 108 ~ 4 × 10 の9です。1 x 10 の8の下に何の価を使用して大量のウイルスが細胞に有毒であるを追加する推奨されませんでしょう。また、繊維芽細胞を開始するプラグインに隠密はより壊れやすく、持ち上げやすいをなります。セルを十分すぎるほど邪魔をしないようにメディアを変更するときに優しくなることが欠かせません。これは、1,000 μ L ピペットをゆっくりと液体を削除することによって行うことができます。最後に、(プロトコル セクション 3) をプログラムし直すためにめっきするときは; 実験を開始する前に健康な線維芽細胞の人口を確保することが重要これは、トリパン ブルー染色で 90% 以上の細胞生存率で示されます。AHDFs は 95% の confluency に達する前に継代常にする必要があります。
ウイルス伝達の前に顕著な細胞死がある場合は、変換を開始しないでください: 細胞生存率が 90% 以上で、プレートのコーティングの問題がなかったことを再確認。それウイルス伝達の細胞死の少量が期待できる、ただし、これはいない重要なする必要があります。この場合、50,000 aHDFs/ウェルの正確な播種を確認し、ウイルス力価を確認します。変換中に井戸の間顕著な矛盾があると、まず各ウェルにメディアの同じ量が含まれていて、(存在する場合は、必要な余分なメディアは、エッジの井戸に追加できます) あからさまな蒸発が端で発生していないを確認します。または、4.4、ステップをチェックし、伝達するとき、均一な懸濁液の適切な混合を確実します。井戸にこれを追加する前に、まず、媒体に、レンチ ウイルスを追加することが重要です。井戸にレンチ ウイルスを直接追加する坑変動を増加する、また細胞に有害である可能性が高い。最後に、媒体は 37 ° c のセルに追加する前に温めて、常にチェックします。
このプロトコルには、iNs と神経細胞の純度を高めるため並べ替え FACS の長い言葉の文化の塗装条件について省略可能セクションが含まれています。アドインの機能特性を調査する希望の実験用ガラス coverslips の電気生理学のための準備のためのプロトコルも含まれています。ここで変換プロトコルが設定されている、24 ウェル プレートでの使用これは 6-、12-、48 - 変更することができます希望する場合 96 ウェル プレートやフラスコ。この場合、プレートや活用フラスコの表面領域にすべてのボリュームを調整してください。
このプロトコルはパン神経の表現型のプラグインを生成するのに残り打撃との組み合わせでAscl1とBrn2強制式をすべてのパッケージ化された 1 つ 1 つのベクトル8 を使用します。この方法では、任意のグリア細胞のサブタイプの発生ただしが評価されていません。このメソッドはこうしてサブタイプの特定のニューロンを取得するその他の初期化因子で使用するために変更する必要があります。直接リプログラミング以前運動ニューロン、ニューロン、視細胞、線条体中型のとげだらけニューロン、ドーパミン作動性ニューロンの10、14を生成する可能性を示しています。どの特定の神経細胞サブタイプが優先的に影響を受けるで、例パーキンソン病とドーパミン作動性ニューロンの神経疾患を調査する場合に有益になります。
ごく最近まで直接神経リプログラミング技術を許可していないプラグインの生産標準化された効率的な方法で-毒物学および薬剤のスクリーニングの大規模なアッセイに必要なレベルに。この新しいメソッドは非常に効率的でし、今これらの制限を削除し、人間の神経系のみならず患者の特定をすることができますシステム研究の広大な配列を開くように、何度も継代されている線維芽細胞に使用することができます。この方法のシンプルさは、社内同様の研究を実行するすべてのグループのアクセスの技術をレンダリングし、簡単に使えるだけでなく大規模な医用、薬剤のスクリーニングおよび毒性アッセイなどもサポートするにはデータは、動物モデルやひと死後組織サンプルから派生します。

神経疾患の効果的な治療法の開発は、解明および機能アッセイを実行する人間の脳細胞へのアクセスの制限によって妨げられています。一昔前は、このような状況は、根本的に誘導多能性幹細胞 (Ips) 技術1,2の開発に変更。普通の人間開発中に発生した神経分化メカニズムの理解を深めると共に、これは患者と疾患の特定材料から定義され、多様な神経細胞の生成を可能にします。そのような材料だ今神経疾患とそれらの病理学的特徴3を軽減するためにさまざまな化合物の潜在的な細胞内メカニズムを研究することが可能。
Ips は、神経科学の分野に革命的なされている、これらの細胞の 1 つの主要な欠点は若返ったニューロンが脆弱性に関連付けられているを保持しないことそのような方法でプログラムし直すプロセス中に、高齢化の署名を消去、4,5,6高齢化。生成されるニューロンのこの特定の機能は、老後が重要なリスク要因と、病気の場合は特に、細胞内病原性カスケードの多くの側面の概説のために重大であることを終わる可能性があります。
直接に体細胞を変換して直接技術は、神経のリプログラミングで、多能性を経由せず中間段階。これにより、急速な世代の人間ニューロンの in vitro患者と特定疾患の両方にすることができます。直接リプログラミングの顕著な特性の 1 つは、ドナー細胞の開始年齢を維持、老化の過程などへの脆弱性は酸化ストレス4,7の生産を増加します。その結果、神経疾患患者からアドインに関連付けられている高齢化など、アルツハイマー病やパーキンソン病、疾患モデリング、薬剤のスクリーニングの試金、及び毒性学を含む医療アプリケーションの広い範囲に適しています.
広く使用されている神経変性疾患患者からの iNs を妨げている主な注意点は、彼らを再プログラムする簡単ではありませんこれ繊維芽細胞の拡大をさらにもっと困難になることです。その結果、これらの種類のアプリケーションに必要な量のセルの世代ばかり8まで達成されていません。非常に効率的な方法であらゆる年齢層のドナーから線維芽細胞をプログラムし直すための簡単な方法を開発しました。このメソッドは、リプレッサー蛋白質 re1 トランスクリプション要因 (残り) 1 つのベクトルを使用してのノックダウンと神経細胞の転写因子Ascl1 Brn2の強制発現を兼ね備えています。ここでは、我々 は皮膚線維芽細胞高齢者ドナーから生検から変換アドインの世代につながる別の手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成体ヒト皮膚線維芽細胞&nbsp;</td><td></td><td></td><td>[C2 passage #7] ドナーは67歳の女性でした。パーキンソン病から得られた細胞病気の研究とハンチントン」ジョン・ヴァン・ギースト脳修復センター(英国ケンブリッジ)の疾患クリニック。</td></tr><tr><td>Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA [0.5%]</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>DPBSで0.05%に希釈します。</td></tr><tr><td>Virkon (ウイルスを中和するために使用される薬剤)</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td>温水で1%溶液に希釈します。</td></tr><tr><td>ミリQウォーター</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>基礎ミディアム</ストロング> - ダルベッコ's Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン [10,000 U/mL]</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS&reg;&nbsp;ジメチルスルホキシド (DMSO) 10</td><td>Miltenyi</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Neural differentiation medium - NDiff 227</td><td>Takara-Clontech</td><td>Y40002</td><td></td></tr><tr><td>LM-22A4&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>4607</td><td>10 mg を 1450 & micro で希釈します。L DMSO。ストック濃度:20 mM.</td></tr><tr><td>グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)[組換えヒト]</td><td>R&Dシステム</td><td>212-GD-0101050</td>&<td>microで10μgを希釈します。L 0.1% BSAのDPBS中。ストック濃度:20 &g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>NT3 [組換えヒト]</td><td>R&Dシステム</td><td>267-N3-025</td><td>希釈25&micro;gを2.5mLに0.1%BSA溶液溶液で溶解した。ストック濃度:10 &g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>db-cAMP&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0627</td> 1 <td>gを40.7 mL Milli-Q水で希釈します。フィルタリングして500&microを作成します。Lアリコートまたは10mLのストックチューブ。<ストロング>ストック濃度:50 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>Dilute 2 &micro;429,8 &microのg;L DMSO。<ストロング>ストック濃度:10 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Axon</td><td>1661</td> 5 <td>mg を 595 &micro で希釈します。L DMSO。<ストロング>ストック濃度:20 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>Noggin [組換えヒト]</td><td>Miltenyi</td><td>130-103-456</td><td>希釈 100 & マイクロ;100&microのg;ミリQ水のL + 900 & マイクロ;L 0.1% BSAのDPBS中。<ストロング>ストック濃度:100&マイクロ;g/mL.</strong</td></tr><tr><td>>LDN-193189</td><td>Axon</td><td>1509</td> 2 <td>mg を 360 &micro;L DMSO。ストック濃度:10 mM.</td></tr><tr><td>バルプロ酸ナトリウム塩(VPA)</td><td>Merck Millipore</td><td>676380</td><td>Milli-Q水で5 gを希釈して、1 Mのストック濃度を達成します注意:摂取、皮膚との接触、および呼吸粉塵の形成を避けてください。</td></tr><tr><td>コーティング用試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Milli-Q 水で 0.1% に希釈します。</td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Milli-Q 水に溶解します。<ストロング>15&micro;g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>2 mL Milli-Q 水 + 70 & micro;L 0,25 M NaOHです。5&microで使用します。g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>-80°Cで保存します。氷上で解凍し、冷やしてアリコートします 30 μL. 5 & micro;g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-カルシウム、-マグネシウム、-フェノールレッド]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175-046</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>SigmaAldrich</td><td>A2153</td><td>Anti-Human CD56(NCAM)には1%濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN-25</td><td>0.05%濃度で使用します。</td></tr><tr><td>抗ヒト CD56 (NCAM) 抗体 [マウス]</td><td>BD Pharmingen</td><td>555518</td><td>1 : 50.</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td>PBSで1mg / mLに希釈し、無菌状態に保ちます。 <強い> 1:1000で使用して10μの濃度を達成します。ガラス</td></tr><tr><td>カバース></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><リップ用試薬 g/mL.試薬 アル<tr><td>コノックス洗剤 シ</td><td>グマ アルドリッチ</td><td></td> Z273228 <td></td></tr><tr><td>エタノール95%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>シ</td><td>グマ アルドリッチ</td><td>438073-M</td><td>注意:濃硝酸は非常に腐食性が高く、その蒸気は潜在的に有害です。</td></tr><tr><td>濃塩酸(HCI)</td><td></td><td></td><td>注意:濃塩酸は腐食性が高く、その蒸気は潜在的に有害です。</td></tr><tr><td>免疫細胞化学用の試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td>4%の濃度で使用してください。注意: PFAは強力な固定剤です。摂取や皮膚との接触を避け</td></tr>てください <tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td>0.1%の濃度で使用してください。.</td></tr><tr><td>血清 [Donkey]</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2抗体 [Chicken]</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>1 : 5,000 の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>Tau HT7 モノクローナル抗体 [マウス]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MN1000</td><td>1 : 500 の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>Cy3 抗ニワトリ抗体 [Donkey]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-165-155</td><td>1 : 400 の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 抗マウス抗体 [Donkey]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>1 : 400 の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジン-2&prime;-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>Milli-Q水中の粉末を1 mg / mLに再構成します。アリコートと-20°Cで保管します。C、<強>光感知</強>。1:500の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ [Nunclon Delta Surface]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate [Nunc]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL ポリプロピレンチューブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>15 mL falcon tube&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>CryoPureチューブ 1.6 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td></td><td></td><td>ピペッティング用容量 1-25 mL。</td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット:5、10、25 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001、86.1254.001、86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>調整可能な容量ピペッター:5、20、200、および1,000 &micro;L&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td></td><td></td><td>0.5 - 1,000 μlのピペッティング容量用。</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-1.5-oz</td><td>#1.5厚さ、直径12mm、0.5オンス、CE認定、24ウェルプレートに適合。</td></tr><tr><td>ガラス皿</td><td></td><td></td><td>直径約150mm。</td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td></td><td></td><td>ソニケーターバスに適したサイズのビーカーが利用可能であることを確認してください。ソニケーターバスからの水はガラスビーカーに溢れてはいけません。</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThawSTAR 自動セル解凍システム</td><td>BioCision</td><td>BCS-601</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自動セルカウンター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングチャンバー [50スライド] とトリパンブルー [0.4%]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Countess II 自動セルカウンターと併用します。</td></tr><tr><td>CoolCell Cell LX 制御速度凍結容器</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿 5% CO2 37 &deg;Cインキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td>1、5、15、50mLのチューブに適しています。</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター - ブランソニックモデルB200クリーナー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z305359</td><td>周波数 = 50-60Hz、振幅 = 30ワット</td></tr><tr><td>FACS Aria III細胞選別機</td><td>BDファーミンゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>位相コントラスト顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr></tbody></table>

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

誘導ニューロン (iNs)、ニューロンに直接変換体細胞の製品は、簡単にアクセスできる組織から患者由来の神経細胞を取得する方法です。このルートを通じて成熟したニューロンは、数週間の問題で取得できます。ここでは、大人の人間のドナーから生検によって得られた真皮線維芽細胞からプラグインを取得するための簡単かつ迅速なワンステップ プロトコルについて述べる。我々 は皮膚の線維芽細胞株の株式を構築する凍結の手順の維持を含むプロセスの各ステップを説明する変換処理中に、プログラムし直すための細胞と培養条件の播種します。さらに、電気生理学的記録、長期コーティング条件、および蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えのためガラス coverslips の準備について述べる。また予想される結果の例を示します。ここで説明したプロトコルが容易に行えるし、できる人間に適用される線維芽細胞に由来する様々 な別の診断と年齢患者の皮膚生検。このプロトコルは、バイオメディカル、疾患モデル作製、薬物スクリーニング、ターゲットの検証などの広い配列を使用ことができる iNs の十分な量を生成します。

細胞の形態の明確な変化が一日 5 以降 (図 1 b) から表示されます。いくつかの細胞の死はウイルス伝達後予想されるがあからさまにしません。24 ウェル プレートの各ウェルから 25、うち約半分はニューロンをなっているはずの日で 20,000-40,000 セルの合計セル収量を期待すべき。細胞間でだけでなく、病気の状態とウイルスのバッチと収量、純度が異なることに注意することが重要です。
細胞は、成熟した神経細胞形態の展示に加えて、25 日 MAP2 とタウ (図 1) を含む最も標準的な神経細胞マーカーを表明します。NCAM マーカーに基づく FACS により純粋な人口を得ることは可能です (を参照してください8,11を参照)。細胞その後めっきすることがどちらか再 PFL トリプル コーティングに (参照10参照) または直接生体分子解析用冷凍します。
セルが並べ替えられていない場合蛍光ラベリング MAP2 とタウが正常に変換されたセルを識別するために実行されますでされ、共同ラベル興味の蛋白質。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56904/56904fig1.jpg"> 図 1: 時系列の変換の進化します。(A) 実験と大人ひと真皮線維芽細胞をプログラムし直すためのレンチ ウイルスのパッケージ構築の地図の年表それぞれの黒い矢印は、中型の変更を表します。(B) 代表的な位相コントラストの画像 (各パネルの右上隅に示されている) として 22 日に 0 日間の変換処理中に細胞の形態の変化を描いたします。対物レンズ 10 倍を使用して位相差顕微鏡で撮影を行った。(C)、タウと MAP2 重染め色の 35 日後伝達で蛍光イメージ。セル 4% パラホルムアルデヒドで固定され、グリセリン 0.1 分セルの DPBS でトリトン DPBS で 5% 血清溶液中 30 分間ブロックされていた。抗体がソリューションをブロックで薄くなり、4 ° C で一晩に適用蛍光標識二次抗体がソリューションをブロックで希釈し、2 h. セルされた 3 洗浄 DPBS と続く 15 分の DAPI で counterstained のための適用。画像は、20 × 対物を用いた倒立蛍光顕微鏡で撮影されました。スケール バー = 100 μ m (B、C)。略語: ENM: 初期神経媒体;LNM: 後期神経中。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56904/56904fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル ベースの方法をについて説明します。

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

本プロトコルの全体的な目的は、ヒト成人の皮膚線維芽細胞から高収量の誘導ニューロン培養系を構築することです。この手法は、細胞の年齢を維持したまま患者由来の神経系の変性を再現できるため、神経疾患分野における重要な課題の解明に寄与します。本手法の主な利点は、あらゆる年齢層の人々から、非常に標準化された効率的な方法で、わずか25日間で誘導ニューロンを生成できる点にあります。これにより、疾患モデリング、毒性学、診断、および非常に大規模な薬剤スクリーニングアッセイを含む、幅広い生物医学的応用が可能になります。本手順のデモンストレーションを行うのは、brain train所属の博士課程学生であるShelbyと、当研究室のKarloniaです。まず、自動細胞解凍システムを用いて、成人ヒト皮膚線維芽細胞を解凍します。自動細胞計数器で細胞数をカウントした後、10 mLの線維芽細胞培地を含むT-75フラスコに200,000個の細胞を播種します。37 °C、5% 二酸化炭素条件下で維持します。翌日、古い培地を新しい線維芽細胞培地に交換します。細胞が95%コンフルエントになるまで、3〜4日ごとに線維芽細胞培地を交換し続けます。リプログラミング用の成人ヒト真皮線維芽細胞を播種する1時間前に、24ウェルプレートの各ウェルに0.1%ゼラチンを250 microlitersでコーティングします。プレートを37 degrees Celsiusでインキュベートします。フラスコから線維芽細胞培地を吸引し、Dulbecco's Phosphate-Buffered Salineで1回洗浄します。洗浄後、T-75フラスコあたり1.5 millilitersの0.05%trypsinを用い、37 degrees Celsiusで3分間細胞を溶解します。その後、trypsin溶液を中和させるため、線維芽細胞培地を3 milliliters加えます。フラスコ内の細胞を2回洗浄して15 milliliterチューブに回収し、遊離した細胞を冷却します。次に、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを1 milliliterの線維芽細胞培地で再懸濁します。次に、線維芽細胞培地 13.2 milliliters 中に 1,320,000 個の細胞を含む細胞懸濁液を調製し、培地 1 milliliter あたり 100,000 個の細胞濃度にします。プレートからゼラチンを吸引除去した後、Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline でプレートを2回洗浄します。その後、各ウェルに細胞懸濁液 500 microliters を加え、37 degrees Celsius で一晩インキュベートします。線維芽細胞用培地 13.2 milliliters を 37 degrees celsius に温めます。次に、ラミナーフローフード内でレンチウイルスベクターを室温で融解させます。導入促進剤を添加しない培地に、成人ヒト真皮線維芽細胞を感染させるために必要な量（感染多重度 20）のレンチウイルスを添加します。次に、培地をレンチウイルスベクターを添加した500 µLの線維芽細胞用培地に交換します。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、レンチウイルスを含む培地を、レンチウイルスベクターを含まない新鮮な線維芽細胞用培地に交換します。ウイルス導入後3日目に、線維芽細胞培地を除去し、500 µLの初期神経分化誘導培地を添加します。週に2〜3回、各ウェルの古くなった培地225 µLを、新鮮な初期神経分化誘導培地250 µLに交換します。ウイルス導入後18日目に、初期神経分化誘導培地を除去し、500 µLの後期神経分化誘導培地に交換します。これまでと同様に、25日目または実験の終了時点まで、2〜3日ごとに培地を交換し続けます。1000 µL ピペットを使用して培地を除去します。次に、各ウェルに細胞解離剤を 250 µL ずつ2回添加し、細胞が剥離して単一細胞として浮遊するまで、10〜20分間インキュベーター内に放置します。その間に、FACSバッファーを調製します。1000 µLピペットでトリチュレーション（攪拌）を行います。細胞の凝集が残っている場合は、さらにしばらくインキュベートしてください。得られた単一細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。ウェルを後期神経変換培地で2回洗浄し、同じ1.5 mLチューブに回収します。その後、400 Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、細胞ペレットを200 µLのFACSバッファーで再懸濁します。再度、細胞を400 Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞をFACSバッファーで再懸濁し、遠心分離します。この操作をさらに2回繰り返します。次に、1:50に希釈したヒトCD56抗体を含む50 µLのFACSバッファーに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で遮光した状態で15分間置きます。細胞を400 Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを200 µLのFACSバッファーに溶解して細胞を洗浄します。再度、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。FACSバッファーで2回洗浄し、その都度遠心分離を行います。最後に、10 µg/mLのプロピジウムヨードを含む200 µLのFACSバッファーに再懸濁します。NCAM陽性かつプロピジウムヨウ化物陰性の細胞を、NCAM抗体またはプロピジウムヨウ化物で染色していないコントロールサンプルの蛍光強度に基づいてゲーティングを行い、分取します。自動細胞計数機を用いて細胞数を測定し、Poly-L-ornithine、フィブロネクチン、およびラミニンでコーティングしたプレートに、後期神経分化培地を用いて1 cm²あたり50,000個の細胞を播種します。実験のエンドポイントまで、週に2〜3回、培地の半分を後期神経分化培地と交換し続けます。代表的な位相差顕微鏡像は、変換期間中における細胞の形態学的変化を示しています。5日目から細胞形態に顕著な変化が見られます。22日目までには、約半数の細胞がニューロンへと変換されています。代表的なアミノ蛍光画像は、細胞内に標準的な神経マーカーが存在することを示しています。25日目までに、細胞は神経細胞の形態を獲得し、MAP2やTAUなどの神経マーカーを発現します。核はDAPIで染色されています。このビデオを視聴することで、成人のヒト線維芽細胞から誘導ニューロンを生成する方法について深く理解することができます。これには、リプログラミングのための細胞播種、ウイルス導入、細胞の維持、および精製のためのFACSソーティングが含まれます。この技術の開発により、神経疾患分野の研究者が、疾患に関連するさまざまな特徴や潜在的な治療法を研究する道が開かれます。そしてそれは、単なるヒト神経系だけでなく、患者および疾患の両方に特異的なシステムを用いて行うことが可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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このビデオは、成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞(iNPC)を単離する技術を示しています。本稿では、iNPCコロニーを単離し、iNPC集団の継続的な増殖と拡大を促進する適切な培地の存在下で、ラミニン被覆マルチウェルプレートウェルで培養する手順を概説しています。...

成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

このビデオは、成人のヒト皮膚線維芽細胞(aHDF)からのニューロンの生成を示しています。aHDFは、ニューロン転写因子とショートヘアピンRNA(shRNA)の遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターを使用して再プログラムされます。shRNAはニューロンの転写抑制因子の発現を阻害し、ニューロンの転写因子は遺伝子を活性化してaHDFをニューロンに分化します。これらの再プログラムされたaHDFは、成熟したニューロンを生成するために、初期および後期のニューロン変換媒体で培養されます。...

ヒト真皮線維芽細胞のリプログラミングによるニューロンの生成

このビデオでは、神経幹細胞の接着と成長を促進するために、ポリオルニチンとラミニンでコーティングされたガラスカバースリップを準備する方法を説明しています。この手法には、シーケンシャルインキュベーションと洗浄が含まれ、ニューロンに見られる構造を模倣して、ニューロン細胞の成長と分化を促進する支持マトリックスの形成を促進します。...

ヒト神経幹細胞からの皮質錐体ニューロンの生成

私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。...

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。...

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

学ぶ成人皮膚線維芽細胞から誘導神経細胞を高収率で作製するベクター法。25日間で患者特異的神経モデルを構築し、神経疾患の病態解明と創薬スクリーニングに応用可能です。

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

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