Name: キイロショウジョウバエにおけるプリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達を監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶ プリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達をDrosophila melanogasterを用いて生体内で可視化する方法。神経変性疾患における病態進行メカニズムの解明と治療法開発への応用が期待されます。

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これらのメソッドの開発の間に多くの役に立つ議論の Kopito、羅、ピアースのラボのメンバーに感謝いたします。我々 はまた、この原稿の批判的読解のブライアン Temsamrit を感謝します。この作品は、大学科学大戦スミスの公益信託からの資金によって支えられました。

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神経変性疾患の患者数は増加し続けているより良い治療法を開発することができますので、これらの疾患の病態の理解を高めるための緊急の必要性があります。ここでは、監視モデル生物、ショウジョウバエの異なる細胞型の間の病原性タンパク質凝集体のプリオンのような通信を可能にする方法をについて説明します。最近、突然変異体 Htt 集計生体内でのプリオンのような伝送を実証してグリア27にニューロンからこれらの凝集体の普及を仲介する貪食受容体を識別するためにこの方法を利用させていただきました。我々 のアプローチは、ショウジョウバエを使用して人間の遺伝病を研究するいくつかの利点を悪用: そのライフ サイクルは短いと広大な遺伝的ツールセットにより、治療に関連する基本的な生物学的情報の発見を加速することができます。
ここで述べる方法他の既存の動物 2 つの主要な利点を提供して培養細胞モデル プリオンのような伝送のため: (1) 集計する病原体 (例えば、突然変異体 Htt) はそのままの組織...

プリオン仮説では、感染性病原体 (例えばヒトのクロイツ フェルト ・ ヤコブ病、スクレイピー羊、鹿、ヘラジカ、慢性消耗性疾患や牛の「狂牛病」の伝達性海綿状脳症を担当) 蛋白質と核酸1を欠いているだけで構成されています。プリオン病の細胞プリオンタンパク質 (PrPC) ではネイティブではない、安定した倍 (PrPSc) 高ベータ版シートが豊富な自己に変換し、安定したアミロイドに単量体の PrPC分子を募集を反映することを前提としています集計します。PrPSc集合体は、生物に異なる細胞の間とも個々 の生物2を広げるためこの自己複製機構を使用します。
タンパクはまたほとんどの神経変性疾患 (アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、(HD)、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)) の中央特徴3。これらの疾患の内、または極細胞集計タンパク質複合体の形成は時間5,細胞毒性4と脳を高い再現性で疾患固有のパスに沿って進行と密接に関連6。 普及のこれらのパターンはプリオンのような性質があるこれらの疾患に関連付けられている病原性の骨材をお勧めします。広告に関連付けられている集計のプリオンのような伝達のための強力なサポートが今存在する PD、HD、および ALS - 彼らは細胞間およびテンプレート以前影響を受けない細胞7、同じ蛋白質の単量体の形態の構造変化から広がる 8。
集計は、ナイーブ細胞の細胞質に転送場所細胞外スペースから、またはから別のセルの哺乳類の細胞培養モデルを使用して実行された日付にタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを調査し、研究の大半細胞質9,10、11,12,13,14,15、または骨材含有材料をマウスの脳に注入し、監視インジェクション サイト16,17,18,19,20,21,22,の外の出現を集計23. 最近では、トランスジェニック動物の細胞内凝集体は、そのまま脳24,25,26,27、内の他のセルに広がったことを示すに使用されています。 28,29,30。ここでは、ショウジョウバエのまま脳の個々 のセルの間の転送の直接可視化の手法について述べる。HD/ポリグルタミン (polyQ) 症ショウジョウバエモデル最初ほぼ二十年前に開発された31,32これらの疾患の根底にある病原性のメカニズムに多くの非常に貴重な洞察力を提供しています。33. HD はタンパク質 huntingtin (Htt)34をコードする遺伝子の常染色体の優性突然変異によって引き起こされる継承した神経変性疾患。この突然変異の結果、polyQ ストレッチの病原性のしきい値を超えて Htt の N 末端付近の展開 〜 37 glutamines、ミスフォールドタンパクし集計35,36タンパク質を引き起こしています。野生型 Htt 蛋白質を含む < このストレッチで 37 glutamines そのネイティブの倍を実現するに誘導することができます、Htt 集計「シード」12,27,37直接物理的な接触時に集計。このエネルギーは、プリオンのような転送用読み出しとして野生型 Htt の核の集約と変異 Htt 集計元の他のセルの細胞内のエントリを利用します。
プリオンのような集計でメカニズムを決定する細胞間の旅行は難治性神経変性疾患の新たな治療標的の同定に します。我々 は、迅速なライフ サイクルの利点は、使いやすさと変異 Htt 集計の細胞間伝播の分子メカニズムを定義するショウジョウバエの遺伝学的トレーサビリティを取る。私たちの実験的戦略では、ショウジョウバエ、老舗 Gal4 固有上流活性化シーケンス (Gal4 UAS) システム38および最近開発された QF 擬システム39で利用可能な 2 つの二項式システムを採用しています。これらの 2 つの独立したシステムを結合には、同じフライ40内の異なる細胞集団に突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の表現を制限することができます。このアプローチを使用して、集約の状態に前もって形成された変異体 Htt と物理的に接触の直接の結果、通常拡散反射光の可溶性の状態から細胞質の野生型 Htt の再分配を監視することによって変異体 Htt の広がっているプリオンのようなを調べた「seed」を集計生化学的変異 Htt 野生型 Htt の転換を確認ことができますまたは蛍光共鳴エネルギーなどの蛋白質蛋白質の相互作用の報告生物物理技術移転 (FRET)9,27,41.
重要なは、我々 も多数の遺伝子やタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを仲介する経路を識別するためにショウジョウバエの遺伝的ツールにアクセスできます。我々 は最近細胞表面のスカベン ジャー受容体、ドレーパー42,43,ショウジョウバエ中心部の近くに貪食グリアに神経細胞の軸索から突然変異体 Htt 集計を転送するのに重要な役割を明らかにするのにこのアプローチを使用しています。神経系 (CNS)27。したがって、ここで述べる遺伝とイメージング ベースのアプローチは、使用する簡単な強力なモデル生物、ショウジョウバエが病気に関連する現象についての重要な基本的な生物学的情報を表示できます。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10X、pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>希釈して 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>LampireBiological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquot and freeze upon receipt チキン</td></tr><tr><td>抗GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>1:500希釈で使用</td></tr><tr><td>ウサギ抗DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>1:2000希釈で使用; DsRedベースの蛍光タンパク質(例:mCherry、mStrawberry、tdTomatoなど)を認識できます。</td></tr><tr><td>マウス抗Bruchpilot</td><td>開発研究ハイハイドーマバンク</td><td>nc82</td><td>1:100希釈で使用;ハエの脳FITC</td></tr><tr><td>抗チキン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SA1-7200</td><td>1:250希釈で使用</td></tr><tr><td>アレクサフロー568アンチウサギ</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA11011</td><td>1:250希釈で使用</td></tr><tr><td>アレクサフロー647抗マウス抗体</td><td>ライフ技術</td><td>A21235</td><td>1:250 希釈で使用</td></tr><tr><td>Slowfade Gold 退色防止試薬</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド (25 x 75 x 1.0 mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (22 x 22 mm)</td><td>グローブサイエンティフィック</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>デュモン生物学グレード鉗子、スタイル 3</td><td>テッドペラ</td><td>503</td><td>非利き手で使用</td></tr><tr><td>デュモン生物学グレードの鉗子、スタイル5</td>テッド<td>ペラ</td><td>505</td><td>利き手LAS</td></tr><tr><td>X画像解析ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イマリス画像解析ソフトウェア</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr>で使用</tbody></table>

キイロショウジョウバエにおけるプリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達を監視

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

ほとんどの神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの中枢機能が蛋白質の集計です。異常な蛋白質の集合、通常生体のホメオスタシスを混乱させる正確なメカニズムは知られていないが、タンパク質凝集体が密接に関連付けられてこれらの疾患の神経病理学。データを新たな広告、PD、HD でその病原性骨材仮説のための強力なサポートを提供し、ALS プリオンは、タンパク質だけ感染性病原体伝染性海綿状脳症の責任は、多くの類似点があります。プリオンは自己テンプレートによって集約表現の広がりを引き起こす同じ蛋白質のネイティブに折り返されているバージョンの変換を複製します。どのようにプリオンとプリオン様タンパク質の広告、PD、HD、および ALS 1 つのセルから別への移行が強烈な調査の領域では現在。ここでは、HD に関連する変異ハンチンチン (Htt) 集計のプリオンのような細胞間伝達の監視を許可するショウジョウバエモデルを説明します。このモデルは多くの異なるショウジョウバエのティッシュの遺伝子発現を操作するための強力なツールを活用して、直接変異 Htt 骨材のプリオンのような転送を報告する蛍光タグ細胞質蛋白質を利用しています。重要なは、我々 はここで説明するアプローチは、新規遺伝子および蛋白質集積体はさまざまな細胞のタイプの生体間の広がりを仲介する経路を識別するために使用できます。これらの研究から得られる情報は、神経変性疾患の根底にある、治療的介入のための新しい機会を明らかにする病原性のメカニズムの限られた理解を拡大します。

ここで説明する方法は、そのままフライ中枢神経系内の別の 1 つのセルの人口から Htt タンパク質凝集体のプリオンのような転送を示す堅牢なデータを生成します。点状に拡散反射光から野生型 Htt の変換は、この YFP 融合タンパク質の直接蛍光 HttQ91 mCherry ドナー ORNs (A ~ Cの図 2と図 4A, B) に式の結果として受信者のグリア細胞で観察されます。これら 2 つの細胞集団間のプリオンのような転送イベントの正確な報告トランスジェニック ハエや間に重なることがなく突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の強い表現レベルを生成する Gal4/QF ドライバーの慎重な選択が必要です。開発または成人期に。さらに、蛍光タンパク質 Htt 融合遺伝子の考え抜かれた設計は、強力なダウン ストリーム解析を有効にできます。変異体と野生型 Htt 集計をすることができますたとえば、...

病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

この手順の全体的な目標は、in vivoでのタンパク質凝集体のプリオン様拡散を監視することです。単離された細胞集団において、同じタンパク質の可溶性バージョンで凝集しやすいタンパク質を発現するトランスジェニックフライを使用します。この方法は、タンパク質凝集体神話やその他の物質が脳内の細胞から細胞へとどのように移動するかなど、神経変性分野の細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の中枢神経系で1つの細胞部位のオポッサムから別の細胞部位に広がるタンパク質凝集体のイメージングを可能にすることです。この技術の意味は、ハンチントン病やその他のプリオン様神経変性疾患の治療にまで及びます。凝集体の拡散は、これらの致命的な障害の進行の根底にある一般的なメカニズムであるように見えるためです。標準的な培養条件を使用して、組織特異的なGal4またはQFドライバーを含むトランスジェニックショウジョウバエメラノガスターラインを作製します。また、Gal4-UASまたはQF-QUASの下流に野生型または変異型のハンチンチントランス遺伝子を含む系統も同様です。欲望の遺伝子型の子孫を収集し、解剖する準備ができるまでそれらを老化させます。脳の解剖の準備として、必要な溶液を集め、ガラス製のマルチウェル皿、ピペットチップ、1組の鉗子とともに氷の上で冷やします。次に、成虫のハエに二酸化炭素を用いて麻酔をかけ、ガラス皿の井戸に移した。次に、約半ミリリットルのPBSTをハエのいる井戸と隣接する井戸に加えます。次に、解剖顕微鏡で1匹のフライに焦点を合わせ、グースネックライトで両側から照らします。次に、折りたたんだティッシュを皿の下に置き、解剖ツールをクリーニングします。次に、非利き手で3番の鉗子を使用して、PBSTを含むウェルに1匹のフライを移します。腹側を上にして腹部をつかんでハエを固定し、ハエを完全に沈めます。次に、キューティクルの下の吻に隣接する小さなスペースに5番の鉗子の1つの尖叉を挿入します。次に、目を両側からつまんでヘッドのグリップを固定し、鉗子を引き離してヘッドを取り外します。ハエの体を折りたたまれた組織の上に置き、頭をPBSTに沈めたままにします。次に、吻の反対側の同じスペースに3番の鉗子の尖咬を挿入し、頭のキューティクルをそっと引き離して脳を露出させます。先に進む前に、実験組織に残ったキューティクルを捨ててください。キューティクルを切除する際は、鉗子で脳を傷つけないように、直接脳に触れないようにしましょう。次に、付着した気管をつかむか、毛細管現象を使用して鉗子の先端の間のスペースに吸引することにより、解剖した脳をPBSTから取り出します。次に、ハエの脳を氷上の固定溶液が入った微量遠心チューブに移します。鉗子から脳が放出されるのを注意深く観察してください。すべての脳を解剖したら、収集チューブを室温のニューテーターに移し、約5分間包みます。固定期間終了後、p1000ピペットを使用して固定液の大部分を取り出し、脳をチューブ内に残すように細心の注意を払いながら廃棄します。これには、穏やかな吸引と慎重な観察が必要です。次に、脳に1ミリリットルの新鮮なPBSTを追加します。チューブを覆い、ニューテーターで約1分間揺らして、残りの固定剤を洗い流します。次に、溶液を取り出し、この短い洗浄手順を繰り返します。その後、5分間の洗顔を1回、次に20分の洗濯を3回、最後に1時間の洗濯を1回と、短い洗濯を2回行います。最後の洗浄後、PBSTの大部分を慎重に除去し、脳を30マイクロリットルのグリセロールベースの退色防止試薬に浸します。次に、脳を摂氏4度で暗闇の中で動かずに1〜24時間インキュベートします。その後、鈍いピペットチップを使用して採取チューブから脳を取り出し、顕微鏡スライドに移します。次に、鉗子を使用してイメージングするために、必要に応じて脳を穏やかに向けます。複数のサンプルを同じスライドに別々の列に取り付けることができます。次に、折りたたまれたラボ組織の角を使用して、スライドから余分な退色防止試薬を取り除きます。組織を脳に接触させないでください。次に、サンプルを5〜10分間暗闇に置き、脳をスライドに接着させます。次に、割れたカバーガラスの小さな破片を取り、約19平方ミリメートルの領域を覆う脳の周りに配置してから、22平方ミリメートルのカバーガラスを脳とガラスのモザイクの上に静かに下げてブリッジマウントを作ります。次に、新しい色あせ防止試薬をカバースリップの下にゆっくりと分注し、空きスペースを埋めます。これは、脳とガラスが所定の位置に留まるように、非常に慎重に行ってください。次に、カバースリップをマニキュアで密封します。まず、角に塗るだけです。角の軽くたたいて乾かしてから、端に沿ってシールを完成させます。脳はできるだけ早く画像化する必要があります。40Xまたは63Xオイル対物レンズを装備した共焦点顕微鏡を使用して、装着された脳を画像化し、トランス遺伝子が発現する脳の領域のZスライスを収集します。次に、個々の Z スライスの puncta を定量化するか、スライスを 3 次元でレンダリングした後でデータを分析します。十分に分離され、バックグラウンドシグナルがほとんどない変異型ハンチンチン凝集体を定量するには、3D表示モードで共焦点Zシリーズを開きます。次に、解析ウィザードを使用して、選択的なチャネル内の個々のスポットを特定します。設定で、しきい値とフィルターを調整して、異種サイズのすべての集計を画像内の個々のオブジェクトとして正確に表します。次に、バイナリ処理プレフィルターでオブジェクトの分割を有効にして、密接に関連付けられた集計を分離します。ソフトウェアによって識別されたオブジェクトに関する定量的情報は、測定の下で報告されます。プンクタを数えた後、画像解析ソフトウェアでさらにそれらを特徴付けます。たとえば、スポットや表面の適切な測定を行って、骨材の直径、体積、または強度の情報を取得します。一部の野生型ハンチンチン凝集体は、Zスタックを手動で移動し、周囲の拡散シグナルと区別できる緑色のプンクタをカウントすることで定量化できます。1 つのアグリゲートが複数のスライスに出現する場合は、2 回カウントしないように注意してください。また、ハンチンチンQ25-YFPとハンチンチンQ91-mCherry凝集体との間の共局在の頻度を決定することも興味深い解析です。これを行うには、共焦点Zスタックをスライスごとに移動することにより、手動カウントを使用します。遺伝的ドライバーと蛍光タンパク質トランス遺伝子融合を慎重に選択することで、重複しない細胞集団における変異型および野生型ハンチンチンタンパク質を明確に検出することができます。野生型ハンチンチンの拡散型から点状への変換は、ドナー嗅覚受容体ニューロンにおけるハンチンチンQ91-mCherry発現の結果として、レシピエントグリアにおけるYFP融合タンパク質の直接蛍光によって観察されます。遺伝的ドライバーと蛍光タンパク質トランス遺伝子融合を慎重に選択することで、重複しない細胞集団における変異型および野生型ハンチンチンタンパク質を明確に検出することができます。変異体および野生型のハンチンチン凝集体は、手動または画像解析ソフトウェアを使用して、点状オブジェクトとして定量化できます。凝集体は、集団として、およびそれらの共局在化の頻度についてさらに測定および特徴付けることができます。Co局在点は、蛍光エネルギー共鳴移動またはFRETによってさらに分析し、蛍光タンパク質融合の近接性を実証できます。一度習得すれば、脳の解剖とイメージングは、適切に行われれば、最初から最後まで8時間未満で行うことができます。この手順を試行する際は、適切なコントロールを使用して、点状凝集体を同じ組織内の他の蛍光構造と慎重に区別することを覚えておくことが重要です。この手順は、異なる細胞タイプ間の凝集体移動の分子メカニズムを決定するために、遺伝子ノックダウンなどの他の方法を含むように変更することができる。あなたの実験に感謝し、幸運を祈ります。

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ここでは、すぐに精製することにより腹腔内接種に従い、蛍光して注射部位からの彼らの取り込みと動きを監視し、これらのイベントを媒介する細胞を特徴づける感染脳材料から集約されたプリオンロッドを標識する免疫細胞によるプリオンの取り込みと人身売買を監視するための新たなアッセイを説明します。...

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

このビデオは、赤色蛍光タンパク質でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現するC.エレガンスのin...

トランスジェニック線虫におけるプリオン様タンパク質の細胞間拡散をモニタリングするためのタイムラプスイメージング

このビデオでは、遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量を示しています。脳を固定し、洗浄し、埋込前に退色防止剤で処理します。画像は共焦点顕微鏡を使用して取得され、定量化されて変異タンパク質凝集体の伝達を観察します。...

遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

プリオン様のタンパク質凝集体の伝播は、最近、多くの神経変性疾患に関与していることが明らかになりました。このプロトコルの目標は、線虫C.エレガンスをモデルシステムとして使用して、タンパク質の拡散を監視し、プリオン様現象を調査する方法を説明することです。...

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。...

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ...

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。...

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ...

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

ここでは、てんかん様活性をモニターするために、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex...

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

学ぶ プリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達をDrosophila melanogasterを用いて生体内で可視化する方法。神経変性疾患における病態進行メカニズムの解明と治療法開発への応用が期待されます。

キイロショウジョウバエにおけるプリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達を監視

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