Name: 洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶ、洗剤を使わずに膜タンパク質を脂質二重層に超高速で再構成する方法。融合ペプチドを用いたプロテオリポソーム技術により、生化学・合成生物学における複雑な膜系の構築が可能となる。

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著者は、感謝してイリノイ大学アーバナ ・ シャンペーン校からロバート ・ Gennis、クリストフ ・ フォン ・ Ballmoos ベルン大学からプラスミドとボー3を表現するひずみを提供する-酸化酵素。プロジェクトは、BBSRC によって支えられた付与 BB/L01985X/1 r. i. と r. b.

<ol><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Liposomes%2C+Pt+B%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31(2013).</li>
<li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li>
<li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/BFb0116295">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3750497/">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li>
<li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li>
<li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303(2014).</li>
<li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li>
<li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025(2016).</li>
<li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li>
<li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li>
<li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li>
<li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304(2013).</li>
<li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894(2014).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4083487">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li>
<li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li>
<li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+inactive%2C+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li>
<li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F%280%29+complexes+of+ATP+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li>
<li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+%26%2334%3Bwindow%26%2334%3B+between+gel+and+non-lamellar+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &#34;window&#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li>
<li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li>
<li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9624424">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li>
<li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li>
<li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayer+mixing%2C+fusion%2C+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li>
<li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li>
<li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+%28II%29%3A+a+method+of+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li>
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次のこの実験的アプローチの成功のために考慮する必要があるいくつかの問題。
プロテオリポソームとターゲット膜の脂質充電の選択:カチオン性脂質がアニオン性脂質が生体膜、たとえば、~ 25、35 と大腸菌、酵母細胞膜とミトコンドリア内膜の内膜で 20% に達し、豊かな自然の中で見つかりません多くの種は、それぞれ27,28,29。PL+の膜蛋白質の機能は、カチオン性脂質、膜および外部イオンの相対的なコンテンツに依存すると二重層の正電荷の強さによって影響されるかもしれないことを期待するは無理だろう強度。したがって、どの程度興味の膜蛋白質の機能はカチオン性脂質環境の電荷に依存する実験的に対処することが重要です。ここでは、我々 はことを示す両方 F1Fo ATP 合成酵素とボー3-オキシダーゼ カチオン性脂質環境に敏感であるが、調節して最初+の PL に蛋白質を配置し、それらを渡すことによってこの効果を逆にできたアニオン膜を受け入れ、融合後の反応中のイオン強度を増加が完成しました。
特定のカチオン性脂質の選択:ほとんどの市販のカチオンの脂質は、非 triacylglyceride 自然;したがって興味の膜蛋白質との互換性のため潜在的な候補者の脂質をテストする必要があります。以前は本研究で使用される ATP のシンターゼ エチル - pc の DOTAP (非 triacylglyceride で、自然な triacylglyceride 脂質に高い構造類似性を持って形成された PL+で、最高のパフォーマンスを示した15 を発見します。脂質) PL+このタンパク質は活発だった。
小胞融合の試金:小胞の混合水溶液にコンテンツなしで互いに付着が容易にそれらの外部または両方の脂質の内容をミックスに中間の半融合状態から区別されるべき必要がある真の小胞の融合 (とき小液体内容・ ミックス)30ををリーフレットします。最適な脂質混合物または特定の条件の場合小胞はまた融合31中顕著な液体コンテンツ漏洩をデモンストレーションします。各脂質種を実験的に見つけることが必要は荷電脂質真の融合を有効に融合ペプチド混合物の最小濃度ですが 10% 未満で膜が脂質表示非融合性32を請求することが一般的に、分られます。
多価イオンの存在下で膜融合 SUV を形成しながら、これらのイオンによって即時凝集と脂質の凝集を引き起こす可能性がありますこの帯電コンポーネントを混在させることが重要です。たとえば、コバルト カルセイン EDTA メソッドの SUV を準備中、周辺固定支持コンポーネントによってポリカーボネート フィルターの目詰まりを防ぐために EDTA とカチオン性脂質混合物の混合を避けるために重要です。
また、コバルト カルセイン EDTA 法ながら非常に敏感とリアルタイムの融合を監視するのに便利なことがありますまだ過小評価すること 1 による核融合の範囲に言及することが重要です) 内無料カルセインの蛍光消光postfusion 小胞、自己クエンチングのしきい値は約 20 μ M33、および 2 と報告されている間 1 mM に達すると予想される) 表面結合コバルト-カルセイン、ゲル濾過樹脂を通過した後もそのまま SUV+にバインドして色しますは明るいオレンジ色に小胞 SUV0が淡いオレンジ色。また、EDTA 存在下で洗剤トリトン X-100 の添加によってバインドされたコバルト カルセインのリリースが SUV+ (図 3、赤のトレース) SUV0 (グレー トレース) よりはるかに強力な信号を生成することに注意してください。
視点: 我々 はここで説明した高速のアプローチが大幅に促進し、合成生物学アプリケーションを新興国のニーズに複合体膜の組み立てのスピードアップを期待します。当社膜タンパク質再構成プロトコルこの膜融合のアプローチは提供する 5-10 分だけ、長い透析ベースの再構成手法を重視する知られている壊れやすい大規模な膜タンパク質の再構成の半分だけ時間がかかる大規模な脂質二重膜に蛋白質はそのような。ここでは、大腸菌F1の Fo ATP シンターゼ、壊れやすいタンパク質の例であるを操作することによってこれらのアプローチの利点を示しています。それが 23 サブユニットで、これらの手順で使用されている、タンパク質を示しますプロトン ポンプで高い再現性をもって活動中/後の可溶化、最適条件 (たとえば、熱) にさらされた場合の整合性を容易に失うことがわかっています。

人工脂質膜タンパク質の機能化、膜モデル システムのアセンブリの重要なステップです。(30-200 nm の直径) 成っている最も簡単なモデル (PL) プロテオリポソーム ベシクル (また呼ばれるリポソーム SUV)、蛋白質の膜に統合します。PL が伝統的に形成される 2 つのステップ1。まず、前もって形成された SUV の関心とその臨界ミセル濃度 (CMC) 上記濃度の洗剤膜蛋白質と混在しています。第二に、様々 な透析、「バイオ ビーズ」やゲルろ過技術、膜タンパク質を残してと洗剤が削除されます。後者のアプローチは多く高速 (~ 30 分1) はそのため壊れやすく、敏感な膜タンパク質の再構成のために望ましい洗剤除去速度を多くの時間を受け取り、原因によって最初の 2 つのアプローチが限定的に、活動と蛋白質の構造の整合性の損失のかなりの損失。大きいの小胞 (ベシクル、マブラヴ、1 μ m の直径まで) このアプローチは難しく、小胞として縮小を取得します洗剤除去後、巨大リポソームは不可能 (GUV、> 1 μ m)、彼らは、洗剤 (しかし見なさいジョンソンらの不安定2遅い 2次元結晶膜タンパク質大規模な膜のため)。GUV 膜機能化3,4、5の代替的なアプローチは存在するが骨の折れる、時間がかかりをおよび CMC 以下の低濃度でいくつかの洗剤をまだ必要とします。複雑なまたは壊れやすい脂質モデル (たとえば、液滴ハイドロゲル膜6および 3 D 印刷可能な液滴インターフェイス層人工組織7) は、洗剤を容認できません。すぐに浮上して合成生物学アプリケーション8,9,10は、批判的にそのような複雑な膜構造物の高機能化に依存します。したがって、ターゲットの壊れやすい膜に膜タンパク質の迅速かつ穏やかな配信を許可する簡単かつ堅牢な方法高度分野で求められています。
代わりに、タンパク質の洗剤無料配信方法は小胞の融合、相互作用する小胞膜がそのまま postfusion 二層に団結しつつ小水溶液内容を得る複雑な外部に放出されることがなくどこ環境。小胞の融合が有効な連絡にある相補的な融合性エージェント (いくつかの蛋白質11,12とペプチド13または特別に変更された DNA14) 内にある構造再編成のいずれかを駆動膜、または脂質二重層間のクーロン相互作用はカチオンとアニオン性の相補的荷電脂質15,16、またはカチオン脂質と蛋白質の負荷電の17の形成。
元のアプローチは、核融合の前に相互作用する膜の膜融合エージェントの存在は比較的遅い (~ 30 分フュージョン12,18の最大値の半分に到達する) が自然と人工の両方に適用することができます必要があります。膜。
脂質膜融合 (図 1) を使用してのアプローチの利点は、多くの高速の膜融合 (〜 1 分半-最大、および反応を完了する 5-10 分に到達する) できます。さらに、核融合の範囲は i) は容易に荷電脂質膜融合膜と ii) イオンと反応媒体 (50 mM と、例えば、ショ糖15上で塩の浸透、一般的な強度の相対的なコンテンツによって制御できます。とおり融合を停止する)、または両方の組み合わせ。融合を開始するには、(通常 10 〜 20 ミリメートル塩) 低イオン強度が 5-10 分の中帯電融合性小胞を混在しています。メソッドの相対的な不利な点はカチオン性脂質を及ぼす融合、特に低いイオン強さ、前にカチオン プロテオリポソームの膜蛋白質の機能に悪影響を及ぼすが、この効果は、可逆的、自然によって軽減されます。融合後の膜とイオン強度媒体へのリターンの脂質組成物。

<table><tbody><tr><td>DOPC中性脂質</td><td>アバンティ脂質</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA アニオン性脂質</td><td>アバンティ脂質</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PCカチオン性脂質</td><td>アバンティ脂質</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>コレステリル-ボディピー-FL12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>セファデックス G-50、スーパーファイン</td><td>シグマ</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>フィコール400、タイプ400-DL</td><td>シグマ</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>シグマ</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>ニゲリシン</td><td>シグマ</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>シグマ</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>シグマ</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>シグマ</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>スルフォロダミン 101</td><td>シグマ</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>押出システム</td><td>Avanti 押出機</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチューブルミノメーター、モデル Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート フィルター、D19 mm</td><td>シグマ、Whatman NucleporeTrack-エッチング メンブレン WHA800309</td><td>、WHA800284</td><td>100 または 200 nm で SUV を形成し、400 または 800 nm で LUV</td></tr> <tr><td>を形成名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>><Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl、50 mM MOPS pH 7.4、1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl、10 mM MOPS pH 7.4、0.1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>バッファーC</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl、10 mM MOPS pH 7.4 バッファーD</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7.4 KClのさまざまな濃度</td></tr></tbody></table>

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

複雑なより大きなモデル脂質二重膜は洗剤とは互換性が低く、洗剤は 30-100 nm 小型単層小胞に膜タンパク質の配信に不可欠なです。
ここで逆の電荷を興味の膜蛋白質を軸受リポソーム膜融合を使用してこの基本的な制限をバイパスするための戦略について述べる。低いイオン強さバッファーで 5 分以内にそのような小胞の融合が発生します。正荷電の膜融合リポソームは、負に帯電するバイオミメティック ターゲット脂質に膜タンパク質の洗剤無料配信するため簡単なシャトル ベクトルとして使用できます。また高速 30 分プロトコルと膜融合プロテオリポソームに膜蛋白質を再構成する方法を示します。
これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、エシェリヒア属大腸菌からの 2 つの膜タンパク質の電子輸送鎖の高速組立を示す、主なプロトン ポンプ ボー3-オキシダーゼと F1Fo ATP 合成酵素、膜0.1 からまで、様々 な規模の小胞 > このチェーンによって ATP の生産と同様、10 ミクロン。

融合性の相補的な充電プロテオリポソーム ターゲット二分子膜に膜タンパク質の高速洗剤無料配信するために 3 つの手順 (図 1) が含まれています: A、高脂質の混合物から SUV 融合性の形成荷電脂質の内容これらの SUV は必要に応じて、小負荷を運ぶことができます。B、膜融合 SUV の私たちの高速膜タンパク質再構成; を使用して PL への変換C減塩中ターゲット膜の膜融合 PL の融合は核融合反応を停止する高い塩の追加に続きます。膜タンパク質の活性の良い脂質環境を提供する陰イオンのターゲット層に膜タンパク質を提供する大きい小胞 (D) の場合望ましい戦略ことです (詳細についてはテキストで)。
逆エマルジョンを用いた GUV 形成プロトコルは、図2 でハイライトされます。比較的高いため脂質-油混合物のヘキサデカンを使うことが望ましい (18 ° C) の凍結温度をペレット化 GUV 後固化した油を簡単に除去できます。
コバルト カルセイン EDTA を用いた小胞の融合を図 3に示します。融合は相補的な荷電ベシクルは中より高い塩濃度の低い塩バッファーで使用時のみ見られている (&gt; 50 mM14) または非融合性の小胞の融合を示さない。
図 4 aに SUV の融合性に膜タンパク質の再構成のこの高速のプロトコルを示します。このプロトコルを用いて、高速を示す一次陽子の溶解ポンプ ボー3-オキシダーゼと F1Fo ATP シンターゼの PL とこれらの膜の特定活動の評価に。タンパク質再構成の収量が使用脂質15の料金に依存しない、約 50-75% であることを言及することが重要です25,12、および PL に再構成した後タンパク質を少なくとも 3 つ格納することができます日、蛋白質の活動の明白な損失することがなく室温でも。この手順は、ATP 合成酵素、それの 95% 以上がその親水性を有する F1指向外側15,26の一方向の方向を提供します。
図 5では、プロトン ポンプ F1Fo (パネル) の活動と洪明甫3-オキシダーゼ (パネル B) カチオン性脂質は減少、陰イオンおよび中性脂質環境と比較して、低イオン強度に敏感が、この効果は、アニオン マブラヴ-と+の PL を融合した postfusion 膜で軽減されます。
図 6は、大規模な小胞の膜に F1Fo ATP 合成酵素の配信を示しています。この実験、+の PL と 800 nm マブラヴ-は、5 分間 20 mM KCl と反応生成物の融合したペレット融着 PL+を削除する、再停止され、プロトン ポンプの。プロトン ポンプ マブラヴ0マブラヴ-の核融合反応 (黒い跡) で使用されていたまたは空マブラヴ-だけで試金 (青のトレース) と制御実験を示さなかった。
膜融合 PL による大規模な小胞の膜の機能電子輸送チェーンの高速組立を図 7に示します。F1Fo SUV+を使いました、ボー3 SUV+ 800 との融合の nm マブラヴ-、順番にコエンザイム Q1と活性化する DTT を追加することによって postfusion の小胞でこのチェーンによって ATP の生産を示したと膜と F1Foで ATP 合成をトリガーするリン酸塩を追加します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> 図 1: 超高速洗剤無料配信膜のベシクルの核融合による脂質二重層をターゲットの概念形成相補的な荷電脂質。陽イオンと陰イオンの膜融合小さなベシクル (SUV+、SUV-) オプションで小貨物搭載の形成は (A)。膜タンパク質の再構成によって膜融合プロテオリポソーム (PL) に SUV 融合性の (B) に変換されます。(C) 洗剤無料 100 nm PL+の融合によって示されている大きい小胞の膜に膜タンパク質の配信の融合性プラ (D) 望ましい戦略と postfusion 膜に膜タンパク質の配信800 nm マブラヴ-。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> 図 2: 逆エマルジョン法による GUV 形成プロトコル。(A) 油脂質混合物と水との間の国境に脂質単分子膜の形成。(B) 逆 (水油) エマルジョンの形成。(C) GUV 形成による遠心分離油水境界を通じてエマルジョンを渡すことによって。(D) 冷却管の下の &lt; 18 の ° C を固めるし、油を除去します。その膜 (緑) や小胞の内腔 (赤) で極蛍光体 (1 mM Sulforhodamine 101) 蛍光脂質 (1% の重量割合コレステリル Bodipy FL12) を含む GUV の A (E) 蛍光顕微鏡画像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> 図 3: コバルト カルセイン EDTA を用いた脂質小胞融合検討します。(A) 無料カルセインが EDTA によって非蛍光性コバルト カルセインの複合体から解放される方法の模式図。(B) SUV 融合の KCl 濃度。(C) 本文で説明されているようにBに示すように postfusion の小胞に EDTA とトリトン X-100 の洗剤の添加による小カルセインのリリースです。最大の背景修正融合信号を除して計算して赤のトレースの融合範囲 (%) (1-2) バック グラウンド補正された最大の信号カプセル化されたカルセイン (3-2) のリリースで、以下、100 を掛けることによって。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> 図 4: ボー3の超高速再構成-酸化酵素および膜融合プロテオリポソームとこのようなプロテオリポソームのタンパク質活性測定に F1Fo 。(A) 再構築プロトコルの概略図。(B) コエンザイム Q1酸化ボー3のプロトン ポンプを駆動-PL の酸化酵素測定 ACMA 焼入れ (テキストで説明します)。(C) ATP 加水分解駆動プロトン ポンプ F1Fo pl 測定 ACMA 焼入れ (テキストで説明します)。PL で F1Fo (D) ATP の加水分解は、ATP 再生システム (テキストで説明します) と、ランプによる促進で測定します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> 図 5: 膜タンパク質の活性に及ぼす脂質環境およびイオン強度。プロトン ポンプ F1Fo (A) と洪明甫3-20 と 100 mm KCl コントロールのトレース (アニオン マブラヴ (緑トレース) と融合した酸化酵素 (B) カチオン PL (赤いトレース)、アニオン PL (ブルー トレース)、中立的な PL (黒い跡)、カチオン PL。グレー) はプロトン ポンプ F1Fo PL-混合時に suv-の変更を示しています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> 800 の膜への F1Fo ATP シンターゼの図 6: 配信+の PL との融合による nm マブラヴ- .(A) 実験の概略: PL+ 、800 nm マブラヴ-は 1 mM モップ (pH 7.4) 1 mM MgCl2、20 mM KCl を削除するペレット、5 分間で融合した PL を融着し、同じバッファーで再停止されます。(B) プロトン ポンプ postfusion LUV (赤いトレース)。ACMA 焼入れマブラヴ- (黒い跡)、混ぜ PL0または空マブラヴ-だけで試金 (青のトレース) と制御実験を示さなかった。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> 図 7: 5 分洗剤無料アセンブリ 800 の膜中の電子輸送鎖の PL+との融合による nm マブラヴ- 。実験の (A) 回路図: 100 nm F1Fo +の PL と 100 nm ボー3-オキシダーゼ PL+マブラヴ-、された融合の図 6で説明しました。融合は、それぞれ 100 と 50 mm KCl とモップの追加によって停止されました。膜は、ADP-ルシフェリン-ルシフェラーゼ カクテルと混合され、テキストで説明されているように DTT と Q1、添加による通電。1 mM リン酸 (P私)、ルシフェリン-ルシフェラーゼ システム テキストで説明するように監視対象のリアルタイムの添加による ATP の生産が開始されました。(B) ATP 合成 postfusion 小胞 (赤いトレース)。制御実験高塩 (グレー)、+の PL マブラヴ-と混合または PL0マブラヴ- (ブラック) と混合されたとき、ATP の生産を示さなかった。(手順 8.8 8.9) 本文で説明している ATP 合成率を算出されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここの postfusion 二層にこれらの膜タンパク質の洗剤無料配信するためターゲット脂質膜融合ペプチド プロテオリポソームに膜タンパク質の再構成とそのようなプロテオリポソームの融合の 2 つの超高速プロトコルを提案する.これらのアプローチの組み合わせにより、複雑な多成分の膜システムの高速かつ容易に制御アセンブリです。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

実装が容易な手順の全体的な目標は、反対に帯電した脂質で形成された脂質二重層間の融合を使用して、さまざまなサイズの脂質二重膜に膜タンパク質を洗剤なしで迅速に送達することを実証することです。私たちの方法論は、層の個々のコンポーネントからバイオマーメトリック多成分脂質二重層システムのワンステップアセンブリのために、生化学および生物物理学で使用できます。私たちのアプローチの利点は、この迅速な官能化、つまりタンパク質、脂質、その他の対象分子との複合体モデル脂質ビラーゼにあることに言及することが重要です。この方法論は、脂質膜の通電が必要な膜輸送プロセスの研究にも使用できます。例えば、一次ポンプは、他の膜タンパク質によって可能になる二次輸送を駆動するために使用できます。私たちの方法は、合成生物学のニーズにも役立ちます。例えば、様々なプログラム機能を持つ膜小胞を作製することなどです。将来的には、このような小さな小胞を同じような大きな小胞の中に閉じ込めることで、人工細胞の構築に向けた一歩になるかもしれません。脂質と油の溶液を形成するには、クロロホルムストックと1ミリリットルのヘキサデカンを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで混合します。次に、クロロホルムを蒸発させるために、チューブを開いたままにすることで、80°Cの水平シェーカーで30分間混合物を絶えず混合し、加熱します。蒸発後、チューブを閉じて室温まで冷まします。次に、脂質単層を形成するために、油水性緩衝界面の脂質で、1.5ミリリットルの遠心分離管を取り、0.5ミリリットルの緩衝液B.Thenの上に油溶液中の脂質の200マイクロリットルを移します次に、室温で30〜60分間待ちます相分離境界が平らになり、脂質単層の形成を示します。相分離境界の凸形状は、オイルと水性バッファーとの間の表面張力の不一致によるものです。次に、水と油のエマルジョンを調製するために、バッファBに非イオン性多糖類の溶液を水よりも高い密度で混合します。次に、0.5マイクロリットルの混合物を、100マイクロリットルの脂質を油溶液に入れた新しい1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、混合物を44キロヘルツと14ワットで超音波浴で30秒間超音波処理します。超音波処理後、45分間激しく渦巻き、オイルエマルジョン中に水を形成します。次に、油エマルジョン中の水をアニオン性GUVに変換するために、エマルジョンを脂質と油の水性界面の上に慎重に移します。エマルジョンでは、各液滴は脂質単層でコーティングされています。オイルエマルジョン中の水の適切なシンジケーションボルテックスがGUV形成の成功を決定します。正しく形成されないと、エマルジョン液滴が順番に合体し、GUV形成の収率が低下します。GUVペレットを得るには、サンプルをGの1000倍で2分間迅速に遠心分離します。曲がった金属線をチューブに入れて、オイルの中に収まるようにします。次に、チューブを氷の上に置いて、脂質と油の混合物を固めます。凍結した油を慎重に取り除き、水相を回収します。次に、GUVペレットを50マイクロリットルの新鮮なバッファーBに再懸濁し、新しいチューブに移します。蛍光顕微鏡の100倍オイルエマージョン対物レンズの下でGUVを検査します。ゲルろ過樹脂を使用して重力流カラムを調製し、室温で保存したバッファーAと等価化します。次に、抽出バッファーを使用して、精製した膜タンパク質を最終濃度0.7ミリグラム/ミリリットルに希釈します。次に、タンパク質を事前に形成されたカチオン性SUVと1対30の比率で混合し、バッファーAを含む照合物を最終容量660マイクロリットルにします。次に、サンプルチューブをロッカーに置き、混合物を15分間静かに振とうします。次に、混合物をゲルろ過樹脂に通し、濁ったプロテオリポソーム画分を収集し、Gの4,000倍で15分間遠心分離します。次に、再構成されていないタンパク質上清を廃棄し、ペレットを蛍光光度計キュベット A.In 1ミリリットルの新鮮なバッファーに溶解し、0.5マイクロモルのACMAの存在下で20マイクロリットルのB03オキシダーゼを含むプロテオリポソームと2ミリリットルのバッファーAを加え、430ナノメートルの励起と515ナノメートルの放出で安定した信号を待ちます。次に、40マイクロモルのコエンザイムQ1をキュベットに加えます。次に、プロテオリポソームに2ミリモルDTTを添加してプロトンポンプを開始し、形成されたデルタpHを消散させます。別のキュベットで、0.5マイクロモルのACMAの存在下で、F1-F0を含む40マイクロリットルのプロテオリポソームを2ミリリットルのバッファーAに加え、0.2ミリモルのATPをプロテオリポソームに添加してプロトンポンピングをトリガーし、形成されたデルタpHを放散します。50マイクロリットルのPL +を50マイクロリットルの800ナノメートルLUVで溶断し、1ミリリットルのバッファーDに1ミリリットルの塩化マグネシウムを補給し、20ミリモルの塩化カリウムを5分間補給します。次に、サンプルを 6, 000 倍 G で 5 分間遠心分離し、融合後 LUV をペレット化します。遠心分離後、未反応のPLからなる上清を廃棄+次に、1ミリリットルの緩衝液Dに形成されたペレットを再懸濁し、1ミリモルの塩化マグネシウムと100ミリモルの塩化カリウムを補充します。再度、ACM Quenching Assayを実施します。まず、3マイクロリットルのB03オキシダーゼPL+と5マイクロリットルのF1F0 PL+を混合し、混合物を3マイクロリットルのLUVまたはGUV-800マイクロリットルのバッファーDと融合させ、20ミリモルの塩化カリウムと1ミリモルの塩化マグネシウムを5分間補給します。次に、塩化カリウムとMopsバッファーを融合膜混合物に最終濃度150ミリモルで加えます。400マイクロモルADP、50マイクロモルルシフェリン、2.5マイクロフラーゼを200マイクロリットルのバッファーAに混合して、ルシフェリンルシフェラーゼADPカクテルを調製します。.次に、融合した膜混合物にカクテルを追加します。ADP合成を正しく測定するには、Q1とDTTを添加する前に、偽陽性を避けるために安定したルシフェラーゼシグナルを持つことが重要です。次に、40マイクロモルの酸化コエンザイムQ1を添加し、次に2ミリモルのDTTを添加して、融合膜の通電を開始します。1分後、通電した小胞に5ミリモルのリン酸カリウム溶液を加えて、ATP合成を開始します。凍結したヘキサデカンを脂質と油の混合物から除去して再懸濁したGUVを検査するために、蛍光顕微鏡法を利用しました。得られたGUVの画像は、その膜上に蛍光コレステロールバイオポティFL12の存在、および内腔内の極性蛍光色素である自己エロジミン101の存在を示しています。塩化カリウムの濃度の増加におけるSUVの融合を定量化するために、グラフをプロットしました。このグラフは、塩化カリウム濃度が50ミリモルを超えると、SUV脂質小胞の融合が減少し始めることを説明しています。ただし、塩化カリウム濃度が低い場合、1〜20ミリモルでは、相補的な荷電小胞が融合します。次に、BO3オキシダーゼ瞑想型プロトンポンプによるコエンザイムQ1基質の酸化反応を測定するために、ACMA Quenching Assayに基づいてグラフをプロットしました。この結果は、アンカプラーを追加すると、プロットの Y 軸に沿って表される ACMA 蛍光シグナルが増加することを示しています。次に、F1F0によるATP加水分解依存性プロトンポンピングもACMA Quenching Assayに基づいて測定しました。グラフでは、アンカプラーを追加すると AMCA 蛍光シグナルが増加することを示しています。さらに、ルシフェリンルシフェラーゼシステムを使用して、融合小胞でのATP合成をモニターしました。コエンザイムQ1 DTTを逐次添加し、続いてリン酸を添加すると、融合小胞によるATP産生が成功したことが示されています。一度習得すると、膜タンパク質と結合筋医学を象徴する界面活性剤からの融合性プロテオリポソームの最初の技術形成は、わずか30分で行うことができます。2つ目の技術である物理融合は、わずか10分以内にさらに高速に行うことができます。このビデオを見れば、官能基化された脂質小胞によって提示されるさまざまな個々のビルディングブロックを組み合わせることにより、多成分膜システムを構築する方法について十分に理解できるはずです。私たちは、膜タンパク質のワンステップ再構成では不可能な主要な特性と機能を持つこのようなモジュラーシステムを期待しています。一般的に、私たちの手順は、より単純な、いわゆるバイオレンガから、複雑に区分化された生化学システムを構築するための単純なフレームワークを提供します。

detergent-free-ultrafast-reconstitution-membrane-proteins-into-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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Gタンパク質共役受容体(GPPC)を組み込んだモデル脂質膜の構築

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この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

学ぶ、洗剤を使わずに膜タンパク質を脂質二重層に超高速で再構成する方法。融合ペプチドを用いたプロテオリポソーム技術により、生化学・合成生物学における複雑な膜系の構築が可能となる。

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

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