線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

この手順の全体的な目標は、線虫の行動に対する雌雄同体特異的ニューロン、またはHSN活性の影響のレシオメトリックカルシウムイメージングを実行することです。この方法は、動物が行動状態を交互に切り替えたときに、神経回路の活動が動物の行動にどのように変化をもたらすかについての行動神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、細胞内のカルシウム活性の変化を高いS/N比で記録すると同時に、動物の行動と移動を追跡することができます。

この方法は、C.elegansのニューロン活動に関する洞察を得ることができますが、ショウジョウバエの幼虫やゼブラフィッシュなどの他の透明なモデルシステムにも適用できます。私と一緒に手順を実演するのは、Collin's Labsの学生であるRichard Kopcock、Pravat Dhakal、Layla Nassarです。動物をマウントするには、まず、播種した線虫成長培地寒天プレートからOP50細菌性食品をプラチナワームピックの底に適用し、ピックを使用して、N-L 3 PプロモーターからHSN中の敏感なカルシウムレポーターGCaMP5およびmCherryを発現する動物のために約20後期L 4 L-X 2,000を播種した線虫成長培地プレートに移します。

白い三日月に囲まれた明確な暗いスポットとして、実体顕微鏡で発生中の外陰部の存在を確認し、摂氏20度で24〜40時間ワームをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、OP50を新しいピックに適用し、3匹の線虫を播種していない線虫成長培地プレートに移し、イメージング中に線虫が餌となるように新しいプレートに少量の食物を残します。次に、平らな丸いヘラを使用して、シードされていないプレートから20 x 20ミリメートルのチャンクを切り取り、ウォーム側を下にしてチャンクをきれいな24 x 60ミリメートルの番号1.5カバースリップの一方の端に置きます。

次に、寒天チャンクをカバースリップの中央に慎重にスライドさせ、22 x 22ミリメートルのナンバーワンカバースリップを寒天ピースの上に置いて、固着と蒸発を減らします。イメージャーを設定するには、ワームを倒立顕微鏡のステージに置き、20x主観を選択します。双眼眼鏡のアイピースを使用して、イメージング用のワームを選択し、赤外線フィルターをスライドさせてコンデンサーの上に置きます。

適切なビデオ分析プログラムを開き、シリアルステージXYステージ最終通信スクリプトを実行します。CsvWriterをクリックし、記録したXステージとYステージ情報を保存するフォルダを選択します。次に、緑色の矢印をクリックして、デジタル集録デバイスを初期化します。

赤外線カメラ録画ソフトの設定で、[カメラ制御ダイアログの切り替え]を選択します。次に、[カスタムビデオモード]メニューを選択し、[モード1]と[ピクセルフォーマットRaw8]を選択します。[Trigger Stroke] で、[Trigger Input Line] を 3 に、[Polarity] を [High] に、[Mode] を 14 に設定します。

Switching Enable は、vol が fluoresces カメラからトリガー信号を受信するまでフレーム取得を停止します。画像表示ウィンドウが開いている状態で、[記録] をクリックし、画像シーケンスを保存するフォルダーを選択します。バッファ録画モードを選択し、画像をJPEG形式で保存します。

次に、「録音開始」をクリックして集録を初期化します。次に、Florescence Acquisition Softwareの「Capture」タブを開き、露光時間を10ミリ秒に、「Binning」を4つのXに、「Image Depth」を16ビットに設定します。幅 512 ピクセル、高さ 256 ピクセルの中央にカメラ サブアレイを選択します。

プログラムは、ワイド画像を自動的に半分に分割して、別々の蛍光チャネルを生成します。「出力トリガー・オプションの表示」をクリックし、すべてのトリガーを正の値に設定します。トリガー 1 とトリガー 2 が [露出] に設定され、トリガー 3 が [プログラム可能] に設定され、期間が 25 ミリ秒であることを確認します。

次に、[シーケンス]タブで、[スキャン設定]で[タイムラプス]を選択し、[フィールド遅延]を1〜50ミリ秒に設定して、20ヘルツで画像を収集します。[一時バッファに保存]を選択します。レシオメトリックカルシウムイメージングの場合、[シーケンス]タブで[開始]をクリックして、目的の細胞とシナプスを視野の中央に焦点を合わせたままジョイスティックで線虫の記録と追跡を開始します。

蛍光記録が開始された瞬間、待機中の明視野カメラとステージコントローラーにトリガーが送信され、同期した画像とステージ位置の収集が開始されます。ヒストグラムウィンドウの統計ボタンをクリックすると、各チャンネルのピクセル統計が表示されます。LEDの電力を調整して、シナプス前末端で最大1ピクセルのmCherry蛍光を8、背景の上に約12ビットのダイナミックレンジを与える赤チャネルで000カウントを確保します。

安静時または低カルシウム中のシナプス前末端でのカルシウムレポーター信号は、グリーンチャネルで約2, 500カウントである必要があります。1つの産卵活動状態に達するまで、行動を記録します。次に、最初の産卵イベントの前の6, 000フレームと6, 001フレーム後の10分間のサブセットを保存します。

線虫の行動とX-Yステージ位置の時点の明視野画像の同じサブセットを保持するように注意してください。そうしないと、データストリームの正確な同期が失われます。画像セグメンテーションの場合は、画像シーケンスを適切なレシオメトリック量子化ソフトウェアプログラムにインポートし、シーケンスタブで時系列を右クリックして、時系列を毎秒20フレーム、ピクセルあたり1.25マイクロメートルに設定します。[ツール] メニューで [比率] を選択し、チャネル A に mCherry を、チャネル B に GCaMP5 を選択し、[計算] をクリックして各画像シーケンスから背景を減算します。

「レシオ・チャンネルにレインボー・ルックアップ・テーブルを適用」を選択し、mCherry チャンネルを使用して強度変調レシオ・チャンネルを生成し、レシオ・カラーを mCherry チャンネルの明るさにマッピングします。「比率」をクリックして、2 つのチャネルを生成します。オブジェクト検索プロトコルを作成するには、測定タブの下にある強度ツールを使用してオブジェクトを検索するツールをプロトコルペインにドラッグし、歯車をクリックしてmCherry強度値のウィンドウを設定し、オブジェクトを検索します。

背景から2標準偏差以上の強度値を選択し、細胞体とシナプス前末端が検出されるように注意してください。mCherryチャネルをターゲットとするフィルターは、頭、尾、腸の蛍光などの望ましくないオブジェクトを除外するために必要な場合にのみ追加します。次に、測定メニューを開き、測定項目の作成を選択し、画像量子化解析プロトコルを実行するすべての時点を選択します。

GCaMP5とmCherry蛍光信号の同時取得を使用して、動物の動きと焦点の変化を補正するピクセルごとの比率チャネルを生成します。各動物について、シナプス前細胞内HSNカルシウムの変化は、卵子の放出や移動運動の変化など、明視野イメージングで明らかな行動と相関させることができます。実際、産卵活動状態の前、最中、および後の線虫の速度に大きな違いが観察できます。

1つの産卵イベントにズームインすると、産卵イベント前のGCaMP5蛍光の強い変化が明らかになります。一方、mCherryの蛍光は比較的変化していません。さらに、GCaMP5:mCherry比の測定された変化は、卵子放出の約4秒前にHSNカルシウムの過渡性を明確に示しています。

外陰部の筋肉の収縮が進行し、卵子の放出で終わるワームの移動が明らかに遅くなります。さらに、先ほど示したように、線虫のイメージングと追跡により、採餌からの産卵行動の空間構成、一時的なHSMカルシウムの変化、および移動前のバースト発火に移行するHSN活動を産卵場所まで視覚化できます。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行されれば、1時間または2時間で完了することができます。

この手順を試行する際は、イメージングステップ中に目的の細胞とそのシナプス前終末に焦点を合わせ続けることを忘れないでください。この手順に続いて、Optogenetic Activationなどの他の方法を実行して、HSNがシナプス前刺激にどのように応答するかについての追加の質問に答えることができます。この技術は、神経科学の分野の研究者がC.elegansの産卵回路機能を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、活動性線虫Caenorhabditis elegansにおけるHSNのレシオメトリックカルシウムイメージングの実施方法について十分に理解できるはずです。