標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

この実験プロトコルの全体的な目標は、経験の浅いPTM研究者が、単一の包括的なシステムを使用して、標的タンパク質が1つ以上のPTMによって内因的に修飾されているかどうかを効果的に判断できるようにすることです。この方法は、単一の簡素化されたシステムを使用して、任意の標的タンパク質の主要なPTMと潜在的なクロストークの検出を可能にすることにより、翻訳後修飾フィールドの研究を強化します。この手法の主な利点は、PTMの専門家でない人でも、タンパク質がモデルシステム内の1つ以上のPTMによって内因的に修飾されているかどうかを検出できることです。

私たちは最初に、いくつかの細胞シグナル伝達経路の調節メカニズムを研究しているときにこの方法のアイデアを持っていましたが、私たちのユーザーフレンドリーなキットやシステムが非リン酸化PTMの研究に実際には利用できないことを発見しました。また、阻害剤を含む希釈バッファーでブラスター溶解を調製します。

培地を注ぎ、細胞を氷の上に置きます。次に、10ミリリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄します。細胞溶解を最大化するために、ブラスター溶解バッファーを添加する前に、できるだけ多くのPBSを除去してください。

各150mmプレートに600マイクロリットルのブラスター溶解バッファーを加えます。バッファーの量は、予想されるタンパク質収量に基づいています。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を溶解します。

ライセートは核溶解により粘性になります。切り取った1mmピペットチップを使用して、粗溶解物を15ミリリットルの収集チューブに入れられたブラスターフィルターに移します。付属のフィルタープランジャーを使用してブラスターフィルターを完全に圧縮し、気泡を含むライセートの流れを15ミリリットルのチューブに集めます。

シンプルで効率的なブラスターフィルターは、他の一般的に使用される方法で見られるようにゲノムDNAをせん断するのではなく、ゲノムDNAを除去します。清澄化したライセートをブラスター希釈バッファーで希釈し、150mmプレートごとに最終容量3ミリリットルにします。最終的な容量は、予想されるタンパク質収量に基づいています。

このステップは、最終的なバッファー組成がアミノ沈殿反応のストリンジェンシーに影響を与えるため、重要です。次に、テキストプロトコルに記載されているように、タンパク質定量アッセイを調製します。600ナノメートルでライセートサンプルの吸光度を測定し、タンパク質濃度を計算します。

ストック試薬チューブを数回反転させて、ビーズがチューブ内に完全に再懸濁されていることを確認します。各IPアッセイについて、ビーズ懸濁液を氷上の別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに分注します。ここでは、20マイクロリットルのユビキチンアフィニティービーズ、30マイクロリットルのホスホチロシンアフィニティービーズ、40マイクロリットルのSUMO化2/3アフィニティービーズ、または50マイクロリットルのアセチル化アフィニティービーズを個々のマイクロ遠心分離チューブに加えます。

ユビキチン化IPコントロールビーズとIGGコントロールビーズが入ったストック試薬チューブを数回反転させ、ビーズがチューブ内に完全に再懸濁していることを確認します。次に、コントロール反応ごとにコントロールビーズを分注して、非特異的結合を決定します。ここでは、氷上の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに、ユビキチンコントロールビーズ20マイクロリットル、ホスホチロシンコントロールビーズ30マイクロリットル、スモイル化2/3コントロールビーズ40マイクロリットル、またはアセチル化コントロールビーズ50マイクロリットルを追加します。

20マイクロリットルのライセートを保存して、ウェスタンブロットインプットライセートコントロールとして実行します。予約したライセートに5マイクロリットルの5倍サンプルバッファーを加え、95°Cで5分間煮沸します。次に、各IPチューブにライセートを添加し、IPチューブを制御します。

ここでは、1つのIPおよび制御反応につき1ミリグラムのライセートを使用し、合計8つのIP反応をもたらしました。チューブを端部にインキュベートし、プラットフォームを摂氏4度で2時間回転させます。インキュベーション後、摂氏4度で1分間Gの3〜5,000倍を遠心分離してビーズを収集します。

ビーズを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引し、摂氏4度の回転プラットフォームで1ミリリットルのブラスター洗浄バッファーで5分間ビーズを洗浄し、以前と同様に遠心分離してビーズを回収します。遠心分離後、ビーズを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引し、洗浄ステップをさらに2回繰り返します。最終洗浄および遠心分離後、バッファー上清で大多数を吸引し、微細な内径タンパク質ローディングチップを使用して残留上清を除去します。

ビーズペレットの最小限の混乱は許容されます。PTMタンパク質の回収率を最大化するために、ビートペレットの混乱を最小限に抑えながら、すべての洗浄バッファーが除去されていることを確認してください。次に、30マイクロリットルのビーズ溶出バッファーを加え、チューブの側面を軽くたたいたりフリックしたりしてビーズを再懸濁します。

この段階ではピペットを使用しないでください。再懸濁したビーズを室温で5分間インキュベートします。トランスファーピペットチップの端を切り取り、各ビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れた1.5ミリリットルのマイクロ遠心スピンカラムに静かに移します。

室温で1分からGの9〜10,000倍でサンプルを遠心分離し、IPサンプルを収集し、各サンプルに2マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを加えてよく混合します。サンプルを摂氏95度のウォーターバスに5分間置きます。インキュベーション後、室温で1分間Gの10, 000倍で遠心分離することによりサンプルを収集します。

最後に、テキストプロトコルで説明されているように、SDS PAGE、転写、およびウェスタンブロット解析の実行に進みます。未処理およびEGF処理のA431細胞ライセートを、ユビキチン、ホスホチロシン、SUMO 2/3、およびアセチルリジンアフィニティービーズに添加しました。PD-L1抗体をウェスタンイムノブロット分析に利用し、EGF刺激に応答してPD-L1タンパク質がこれら4つのPTMによって修飾されたかどうかを判断しました。

ここに示す代表的な結果は、この方法がPD-L1の内因性PTM修飾を効果的に同定することを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば4〜4時間半で行うことができます。このビデオを見れば、この包括的なPTM検出システムを使用して、標的タンパク質またはシグナル伝達経路の固有性PTMまたはクロストークを検出する方法について十分に理解できるはずです。