腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

このプロトコルの全体的な目標は、腫瘍溶解性ウイルス療法を強化するために操作できる宿主標的を特定することです。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を調節する特定の宿主因子や細胞経路など、腫瘍溶解性ウイルス治療の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するために操作できる宿主標的を包括的かつ偏りのない方法で特定できることです。

このプロトコルは、一般的にウイルス複製を調節する宿主因子を特定するためにも利用できます。テキストプロトコルに従ってハイスループットスクリーニングアッセイを開発した後、マイクロタイタープレートのバッチを冷凍庫から取り出し、20〜30分間解凍します。その間に、2本のボトルに70%エタノールを入れ、次に2本の50mLコニカルチューブにPBSを、1本に蒸留水を入れます。

液体ディスペンサーチューブを70%エタノールのボトルに浸し、チューブの周りにマスキングテープを貼って、チューブが無菌と見なすことができるポイントをマークします。約25mLの70%エタノールを使用してチューブをプライミングします。失われた容量を補うために追加のエタノールをボトルに注ぎ、チューブをエタノールに最低5分間放置します。

細胞培養フードを調製後、密封したプレートを遠心分離し、室温でGの1026倍に2分間セットします。次に、プレートからシールをはがします。次に、必要量のトランスフェクション試薬を、予め加温したトランスフェクション試薬希釈剤を含む円錐形チューブにピペットで移します。

各プレートから培地を吸引することにより、細胞のトリプシン化を開始します。9 mLのPBSを使用して細胞をすすぎ、プレートあたり3 mLのトリプシンをピペットで使用します。細胞を摂氏37度で約5分間インキュベートします。

次に、22mLの培地を使用して、細胞を再懸濁し、ピペッティングを10回上下します。各組織培養プレートからの細胞懸濁液を滅菌ボトルに結合し、ボトルを反転させて細胞懸濁液を混合します。次に、細胞懸濁液中の1 mLのアリコートを2つの別々のマイクロチューブにピペットで移します。

各マイクロチューブからサンプルを取り出し、細胞をカウントします。次に、必要な密度に必要な細胞懸濁液の量を計算し、プレートの1バッチに分注するのに十分な希釈細胞懸濁液を調製します。細胞が準備されている間に、エタノールの液体ディスペンサーチューブを空にします。

約25mLのPBSを使用してチューブをプライミングし、チューブを空にします。トランスフェクション試薬に浸漬するチューブの部分、および後で細胞懸濁液に浸す部分が無菌に保たれていることを確認してください。トランスフェクション試薬溶液の1本の円錐形チューブで安全に実行できるプレートを離してセットします。

トランスフェクション試薬溶液を10回上下にピペットで動かします。次に、溶液を使用してチューブをプライミングしてから、ウェルあたり5マイクロリットルを分注します。プレートをGの1026倍にして室温で1分間遠心分離します。

次に、プレートを室温で、使用するトランスフェクション試薬に規定された時間インキュベートします。インキュベーション中に、トランスフェクション試薬溶液のチューブを空にし、PBSを含む完全な50mLコニカルチューブに入れます。次に、約25mLのPBSを使用して、プライミングしてから空にしてチューブをすすぎます。

細胞懸濁液を含むボトルを混合し、チューブを懸濁液に入れ、各チップが適切に分注されていることを確認できるようにチューブを十分にプライミングします。細胞懸濁液のウェルあたり30マイクロリットルをすべてのプレートに分注します。チューブから細胞懸濁液を空にし、約25mLのPBSでチューブをすすぎ、続いて約50mLの蒸留水ですすぎます。

プレートを室温で45〜60分間放置します。次に、プレートを乱されていないインキュベーターで、必要な長さの遺伝子サイレンシングのためにインキュベートします。時間を節約するために、細胞を感染させる前日に、プレートの各バッチに感染させるのに必要な正確な量の培地(未感染のウェル用培地を含む)を滅菌ボトルにピペットで入れます。

培地を摂氏37度で温めてから、2本のボトルに70%エタノール、2本の50mLコニカルチューブにPBSを入れ、1本に蒸留水を入れます。前に示したように、チューブを70%エタノールで滅菌します。チューブがエタノールに留まっている間に、最初にウイルスをボルテックスし、次に必要な量のウイルスを感染培地のボトルにピペットで移します。

次に、25mLのPBSを使用してチューブをすすぎ、プライミングしてから空にします。インキュベーターからプレートを取り出した後、それらを組織培養フードに入れます。培地を使用してチューブをプライミングし、40マイクロリットルの培地を感染していないコントロールウェルに分注します。

メディウムのチューブを空にし、25mLのPBSを使用してすすぎます。ウイルスを混合した後、ウイルスの入ったボトルにチューブを入れ、プレート全体に40マイクロリットルのウイルスを分注します。プレートを室温で400倍Gで30分間遠心分離します。

プレートを事前に決定した時間インキュベートします。固定する前日に、プレートの各バッチについて、4%のホルムアルデヒドとPBSを含む固定用および固定用溶液のボトルを準備しますが、Hoechst染色は省略します。溶液は、光から離れた可燃性キャビネットに保管してください。

翌日、70%エタノールとPBSを使用して、前に示したようにチューブをすすぎます。30マイクロリットルの溶液をすべてのプレートに分注し、プレートをインキュベーターに30分間置きます。インキュベーション後、シールをプレートに塗布し、光から保護された摂氏4度で保管します。

テキストプロトコルに従ってイメージングと解析を行います。ここに示されているのは、トランスフェクション試薬希釈液のみで72時間のインキュベーションを行った後、Hoechst 33342で染色した786個のO細胞です。トランスフェクション試薬および希釈剤、非標的siRNA、およびPLK1を標的とするsiRNAとの併用。

ここで見られる生存プロットは、PLK1 siRNAをトランスフェクションした細胞の22%が生存し、非標的siRNAをトランスフェクションした細胞の94%が生存したことを示しています。このグラフは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに感染した786個のO細胞が、さまざまなMOIでGFPを発現している様子をライブタイムで行った結果を示しています。ここでは、MOI0.05で感染した細胞の代表的な画像をライブタイムで示します。

21時間の潜伏期間では、時点が線形範囲内にあるため、広がりの増減を検出できます。3つの腫瘍細胞株にわたるゲノムワイドRNAiスクリーニングの後、MAD法を使用して、3つのがん細胞株のうち少なくとも2つに共通する1008ヒットが同定されました。UPRおよびERAD経路内の10のヒットを、異なる標的配列のsiRNAによる二次検証のために選択しました。

試薬を分注する際には、正しいプレートのバッチがあり、分注する適切な量を選択していること、およびチューブに正しい試薬が充填されており、常に試薬に完全に浸されていることが重要です。このビデオを見れば、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するために操作できる宿主標的を特定したり、一般的にウイルス複製を調節する宿主因子を特定したりするためのハイスループットRNAiスクリーニングの実施方法について十分に理解できるはずです。