Name: 腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ全ゲノムRNAiスクリーニング法で腫瘍溶解性ウイルス治療を向上させる宿主標的を同定する方法。ハイスループットアッセイを用いてウイルス複製を制御する宿主因子を包括的に探索し、がん治療戦略の改善に貢献します。

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この作品は、イノベーション ・ オタワ地域がん財団・ テリー Fox 研究所がん研究、カナダの財団のオンタリオの研究所からの助成金によって支えられました。K.J.A. は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金、健康研究マスター賞のためのカナダの研究所によって支えられたとオンタリオ州大学院奨学金。

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ハイスループット RNAi スクリーニング腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために採用するためのプロトコルをご紹介します。これは、腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルス、正常にテストされていますが、前述のように、適応できる他の腫瘍溶解性ウイルスや他のウイルスを使用一般にウイルスの複製を調節する宿主遺伝子を識別するために。スクリーニングのプロトコルの目的はまた増加または減少の普及に伴い、遺伝子を識別するが、他の読み出し用に容易に変更できます。Maraba ウイルス、例えば、私たちの画面調節細胞生存率をスコアに単純なレサズリン ベースの重要な染料のアッセイを利用した腫瘍の遺伝子を識別するために設計されていた (図 4参照)15。これらの画面は、次のウイルスの孵化で、ホルムアルデヒドとヘキスト染色細胞を固定ではなく我々 調剤 (最終濃度 20 μ g/mL) を各ウェルにレサズリン染料と、吸光度を測定した 6 時間培養後 (573 nm) と、プレート リー...

高速全ゲノム RNAi スクリーニングは、ウイルス生物学などの多様な分野で生物学的洞察力を明らかにするための貴重なツールであると証明しました。広くウイルスの複製 (1,2,3,4のレビューを調節する宿主遺伝子を識別するの大規模な RNAi スクリーニングのセルベースの過去 10 年間以上にわたり多数のグループが実施しています。,5,6,7). 癌細胞、ワクシニア ウイルス8,9,10 を含む現在の腫瘍溶解性ウイルス候補であるウイルスといくつかの興味深いことに、これらの画面の数が多いを行った、Maraba ウイルス15水胞性口炎ウイルス13,14, 単純ヘルペス ウイルス12粘液腫ウイルス11。貴重なデータがのこれらのデータ セットから採掘される可能性ウイルスの複製のいくつかの側面に影響を与えるホストの要因を識別するのではなく、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するための生物学的製剤のターゲットを識別するこれらの研究のほとんどの焦点中、この点では。腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために強力な潜在性がない完全に悪用されるは明らかです。
腫瘍溶解性ウイルス プラットフォームの茄多は、後期臨床試験で明白な成功を収めているヘルペス シンプレックス ウイルス、レオウイルス、ワクシニア ウイルスを含む前臨床および臨床研究で現在テストされています。これらのプラットフォームの大半、努力に向かっていたウイルスのゲノムを変える治療を強化します。例えば、腫瘍特異性を増加する特定のウイルス遺伝子削除されたか通常の細胞が腫瘍細胞ではウイルスの複製を大幅に制限する変異します。いくつかのケースでの GM-CSF (顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子) を免疫反応を増強するまたは NIS (ナトリウム ヨウ化シンポート) in vivoイメージングと細胞における放射性の取り込みを有効にするような遺伝子が追加されて治療目的。ただし、ホスト/腫瘍の遺伝子を操作し、探索の腫瘍溶解性ウイルスの複製のホスト/腫瘍遺伝子の影響に焦点を当ててほとんどの仕事がずっとあります。ハイスループットス クリーニング技術の出現により、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する宿主ゲノムを操作する機会を解読する、ゲノム規模でのホスト ウイルスの相互作用を調査することが可能です今 (見直し16, 17,18)。
我々 は報告、最初研究デモの概念実証ハイスループット遺伝の腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する操作することができるホストのターゲットを識別するためにスクリーニングを使用するためです。Maraba ウイルス腫瘍、現在フェーズでテストされている腫瘍溶解性ラブドウイルスーを調節する宿主遺伝子を発見するには、私と第 II 試験を行った全ゲノム RNAi 画面 siRNA (短い干渉 RNA) と重複で 3 つの異なる腫瘍細胞株全体18,120 遺伝子15をターゲット ライブラリ。ヒットの画面で特定の経路分析では、(小胞体) 小胞体ストレス応答経路のメンバーの濃縮を明らかにしました。主な画面のものと異なるターゲット シーケンスに siRNA を用いた二次検証のためこれらの経路内で 10 安打を選びました。第三紀の検証の一環として、ire1 α とレスキュー実験を行い (イノシトール要求酵素 1 アルファ) あたりがターゲットにされたことを確認します。体外と体内ire1 α の小分子阻害薬を使用してテスト結果大幅に強化された腫瘍溶解性効果。
Workenheら12もプール レンチ ウイルス shRNA (短いヘアピン RNA) を使用して全ゲノム RNAi スクリーニングを実施したひと単純ヘルペス ウイルスを制限するホストの要因を識別する 16,056 遺伝子をターゲット ライブラリ タイプの胸の 1 (HSV-1) 変異 KM100 を介した腫瘍癌細胞。プライマリ画面彼らはモック感染細胞; 上 KM100 感染細胞の細胞毒性の強化につながるのノックダウンの 343 遺伝子を同定しました。彼らは二次検証のためのこれらの遺伝子の 24 を選択されています。24 遺伝子のうち 8 遺伝子がそれらの 1 つを持つセカンダリ画面で確認された第三の検証中に遺伝的レスキュー実験を使用して確認された後 (セリン/アルギニンリッチ スプライシング因子 2) SRSF2 をされています。グループは SRSF2 のリン酸化の減少、吐蕃担癌マウスの拡張生存率にこの阻害剤リードと HSV 1 KM100 の組み合わせ治療, DNA トポイソメラーゼ阻害療法を識別するようになった。
前述の調査で似たようなワークフローが続いた。各選択プライマリ画面で特定のヒット数でセカンダリ画面が続く主な全ゲノム RNAi スクリーニングから始まった。これはヒットした対象であることを確認含まれている第三の検証研究が続いた遺伝を実行してターゲット遺伝子プロダクトの vivoの操作によって実行される究極の検証と実験で試験管を救出します。この記事でまずウイルスの量と感染症の最適なトランスフェクション条件の決定は、高スループットの siRNA スクリーニング アッセイの開発性の一般的なプロトコルを提供します。セカンダリ画面検証および第三紀の検証の実行方法の全体的な説明と同様、高スループット siRNA スクリーンもプライマリを実施するための詳細なプロトコルを承っています。

<table><tbody><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNAライブラリー</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384ウェルプレート</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Negative Control siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HIGH Glucose</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Σ</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液 (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 100X 溶液</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>オリゴフェクタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>レサズリンナトリウム塩</td><td>Σ</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト 33342</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド(重量%37%)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>500 ml ボトル</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート用430282接着シールフィルム</td><td>エクセルサイエンティフィック</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>剥離可能なヒートシールホイル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFloセレクトディスペンサーカセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (液体ディスペンサー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HTプレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>オペライメージングおよび分析機器</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Robotic Arm</td><td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Automated Workstation</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Plate Carousel</td><td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 プレートシーラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム rnai スクリーニング

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

高スループット ゲノムワイド RNAi (RNA 干渉) スクリーニング技術は、ウイルスの複製に影響を及ぼす宿主因子を発見するため広く使用されています。具体的には強化療法の目標と Maraba ウイルス、腫瘍溶解性ラブド ウイルスについて、ワクシニア ウイルスの複製を調節する発見のホスト ターゲットにこの技術のアプリケーションをご紹介します。腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルスで使用するプロトコルをテストされています、このアプローチ他腫瘍溶解性ウイルスに適用されます、哺乳類細胞でのウイルス増殖を調節するホスト ターゲットを識別することができます活用も一般的です。このプロトコルは、開発および哺乳類細胞、重要な考慮事項と準備手順プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングとステップバイ ステップのガイドを行うために重要でハイスループット RNAi スクリーニング アッセイの検証について説明します。プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングの実施さらに、それは広くセカンダリ画面検証・第三紀の検証研究を行う方法をについて説明します。ハイスループット RNAi スクリーニングができる広範かつ公平な方法、感染などの in vitroアッセイを開発 1 つのウイルスの複製のあらゆる側面を調節する宿主因子で、カタログに 1 つの利点はバースト サイズ毒性。それは現在の知識に基づいて生物学的製剤ターゲット不測の事態を明らかにする力があります。

腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するホスト ターゲットを識別するためのワークフローの概要については、図 1にされます。
図 1に示すように、ハイスループット RNAi スクリーニングを実施する重要な第一歩は分析法の開発です。図 2 aは、トランスフェクションの最適化分析のサンプル プレート レイアウトを提供します。図 2 bは期待される結果の代表的なイメージで構成され、図 2は期待する結果の代表的なプロット。0-30 の間にある細胞の生存 PLK-1、細胞死を誘導して siRNA のノックダウン効率を監視する肯定的な制御として使用できる遺伝子の siRNA ノッ...

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア ウイルス療法が、それが他的に容易に適応することができますウイルスのプラットフォームまたは一般にウイルスの複製を調節する宿主遺伝子を発見するため。

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

このプロトコルの全体的な目標は、腫瘍溶解性ウイルス療法を強化するために操作できる宿主標的を特定することです。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスの複製を調節する特定の宿主因子や細胞経路など、腫瘍溶解性ウイルス治療の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するために操作できる宿主標的を包括的かつ偏りのない方法で特定できることです。このプロトコルは、一般的にウイルス複製を調節する宿主因子を特定するためにも利用できます。テキストプロトコルに従ってハイスループットスクリーニングアッセイを開発した後、マイクロタイタープレートのバッチを冷凍庫から取り出し、20〜30分間解凍します。その間に、2本のボトルに70%エタノールを入れ、次に2本の50mLコニカルチューブにPBSを、1本に蒸留水を入れます。液体ディスペンサーチューブを70%エタノールのボトルに浸し、チューブの周りにマスキングテープを貼って、チューブが無菌と見なすことができるポイントをマークします。約25mLの70%エタノールを使用してチューブをプライミングします。失われた容量を補うために追加のエタノールをボトルに注ぎ、チューブをエタノールに最低5分間放置します。細胞培養フードを調製後、密封したプレートを遠心分離し、室温でGの1026倍に2分間セットします。次に、プレートからシールをはがします。次に、必要量のトランスフェクション試薬を、予め加温したトランスフェクション試薬希釈剤を含む円錐形チューブにピペットで移します。各プレートから培地を吸引することにより、細胞のトリプシン化を開始します。9 mLのPBSを使用して細胞をすすぎ、プレートあたり3 mLのトリプシンをピペットで使用します。細胞を摂氏37度で約5分間インキュベートします。次に、22mLの培地を使用して、細胞を再懸濁し、ピペッティングを10回上下します。各組織培養プレートからの細胞懸濁液を滅菌ボトルに結合し、ボトルを反転させて細胞懸濁液を混合します。次に、細胞懸濁液中の1 mLのアリコートを2つの別々のマイクロチューブにピペットで移します。各マイクロチューブからサンプルを取り出し、細胞をカウントします。次に、必要な密度に必要な細胞懸濁液の量を計算し、プレートの1バッチに分注するのに十分な希釈細胞懸濁液を調製します。細胞が準備されている間に、エタノールの液体ディスペンサーチューブを空にします。約25mLのPBSを使用してチューブをプライミングし、チューブを空にします。トランスフェクション試薬に浸漬するチューブの部分、および後で細胞懸濁液に浸す部分が無菌に保たれていることを確認してください。トランスフェクション試薬溶液の1本の円錐形チューブで安全に実行できるプレートを離してセットします。トランスフェクション試薬溶液を10回上下にピペットで動かします。次に、溶液を使用してチューブをプライミングしてから、ウェルあたり5マイクロリットルを分注します。プレートをGの1026倍にして室温で1分間遠心分離します。次に、プレートを室温で、使用するトランスフェクション試薬に規定された時間インキュベートします。インキュベーション中に、トランスフェクション試薬溶液のチューブを空にし、PBSを含む完全な50mLコニカルチューブに入れます。次に、約25mLのPBSを使用して、プライミングしてから空にしてチューブをすすぎます。細胞懸濁液を含むボトルを混合し、チューブを懸濁液に入れ、各チップが適切に分注されていることを確認できるようにチューブを十分にプライミングします。細胞懸濁液のウェルあたり30マイクロリットルをすべてのプレートに分注します。チューブから細胞懸濁液を空にし、約25mLのPBSでチューブをすすぎ、続いて約50mLの蒸留水ですすぎます。プレートを室温で45〜60分間放置します。次に、プレートを乱されていないインキュベーターで、必要な長さの遺伝子サイレンシングのためにインキュベートします。時間を節約するために、細胞を感染させる前日に、プレートの各バッチに感染させるのに必要な正確な量の培地(未感染のウェル用培地を含む)を滅菌ボトルにピペットで入れます。培地を摂氏37度で温めてから、2本のボトルに70%エタノール、2本の50mLコニカルチューブにPBSを入れ、1本に蒸留水を入れます。前に示したように、チューブを70%エタノールで滅菌します。チューブがエタノールに留まっている間に、最初にウイルスをボルテックスし、次に必要な量のウイルスを感染培地のボトルにピペットで移します。次に、25mLのPBSを使用してチューブをすすぎ、プライミングしてから空にします。インキュベーターからプレートを取り出した後、それらを組織培養フードに入れます。培地を使用してチューブをプライミングし、40マイクロリットルの培地を感染していないコントロールウェルに分注します。メディウムのチューブを空にし、25mLのPBSを使用してすすぎます。ウイルスを混合した後、ウイルスの入ったボトルにチューブを入れ、プレート全体に40マイクロリットルのウイルスを分注します。プレートを室温で400倍Gで30分間遠心分離します。プレートを事前に決定した時間インキュベートします。固定する前日に、プレートの各バッチについて、4%のホルムアルデヒドとPBSを含む固定用および固定用溶液のボトルを準備しますが、Hoechst染色は省略します。溶液は、光から離れた可燃性キャビネットに保管してください。翌日、70%エタノールとPBSを使用して、前に示したようにチューブをすすぎます。30マイクロリットルの溶液をすべてのプレートに分注し、プレートをインキュベーターに30分間置きます。インキュベーション後、シールをプレートに塗布し、光から保護された摂氏4度で保管します。テキストプロトコルに従ってイメージングと解析を行います。ここに示されているのは、トランスフェクション試薬希釈液のみで72時間のインキュベーションを行った後、Hoechst 33342で染色した786個のO細胞です。トランスフェクション試薬および希釈剤、非標的siRNA、およびPLK1を標的とするsiRNAとの併用。ここで見られる生存プロットは、PLK1 siRNAをトランスフェクションした細胞の22%が生存し、非標的siRNAをトランスフェクションした細胞の94%が生存したことを示しています。このグラフは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに感染した786個のO細胞が、さまざまなMOIでGFPを発現している様子をライブタイムで行った結果を示しています。ここでは、MOI0.05で感染した細胞の代表的な画像をライブタイムで示します。21時間の潜伏期間では、時点が線形範囲内にあるため、広がりの増減を検出できます。3つの腫瘍細胞株にわたるゲノムワイドRNAiスクリーニングの後、MAD法を使用して、3つのがん細胞株のうち少なくとも2つに共通する1008ヒットが同定されました。UPRおよびERAD経路内の10のヒットを、異なる標的配列のsiRNAによる二次検証のために選択しました。試薬を分注する際には、正しいプレートのバッチがあり、分注する適切な量を選択していること、およびチューブに正しい試薬が充填されており、常に試薬に完全に浸されていることが重要です。このビデオを見れば、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するために操作できる宿主標的を特定したり、一般的にウイルス複製を調節する宿主因子を特定したりするためのハイスループットRNAiスクリーニングの実施方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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Cancer Research

がん研究

ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。...

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

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リップ-タグを利用した体細胞遺伝子の転送システムを実証するためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス モデル転移遺伝子の機能を研究します。鳥のレトロ ウイルスは、成体マウスの膵 β 細胞の前癌性、非侵襲的病変への遺伝子導入を確保するため intracardiacally...

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アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ...

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このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics...

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

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悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

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挿入型突然変異誘発細胞ライブラリーにおける機能関連レンチウイルス組み込み部位の同定

学ぶ全ゲノムRNAiスクリーニング法で腫瘍溶解性ウイルス治療を向上させる宿主標的を同定する方法。ハイスループットアッセイを用いてウイルス複製を制御する宿主因子を包括的に探索し、がん治療戦略の改善に貢献します。

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

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