Name: 細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（IDLV）の生産法とCRISPR/Cas9遺伝子編集への応用。HEK-293T細胞を用いた高濃度ベクター調製と、in vivo・in vitroでの効率的な遺伝子導入技術を解説します。

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デューク大学医学部、基礎科学, デューク大学の学部長のオフィス、神経生物学部に感謝したいと思います。私たちも原稿のコメントのデューク ウイルス ベクター コアのメンバーに感謝します。プラスミド pLenti CRISPRv2 は、張鋒 (ブロード研究所) からの贈り物だった。プラスミド psPAX2 を含む LV 包装システム、VSV G、pMD2.G、pRSV Rev はだったディディエ ・ Trono (スイス連邦工科大学、スイス連邦共和国) からの優しい贈り物です。この仕事のための財政支援は、大学のサウスカロライナの医学によって提供された RDF18080 E202 (B.K) を付与します。

<ol><li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas%2C+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference%3A+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li>
<li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR%2FCas+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li>
<li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146(2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987(2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+CRISPR%2FCas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968(2017).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li>
<li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).</li>
<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27(2006).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
<li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+of+live%2C+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li>
<li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals%3A+functional+roles+of+NF-kappaB%2FNF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+%28SIN%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li>
<li>Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017).</li>
<li>CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
</ol>

USC-499-P を特許 (1175) がこの原稿で説明する作業に関連してサウスカロライナ大学によって提出されました。

IDLVs は生体内遺伝子編集、配信プラットフォーム22の統合と比較してこれらのベクトルに関連する突然変異誘発のリスクの低いが主因となって、遺伝性疾患のコンテキストで特にのための最適な手段として浮上し始めています。,28.28私たちの研究室で開発された最近改良されたオール ・ イン ・ ワン IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産に関連付けられているプロトコルの詳細を現在原稿を目指しました。
既存のプラットフォームへの変更 この方法では、1 x 1010 TU/mL (図 3 a) の範囲で IDLV-CRISPR/Cas9 と ICLV-CRISPR/Cas9 価でベクトルを生成することができました。生産効率のこの拡張は、オール イン ワン CRISPR/Cas9 ベクトル カセットに Sp1 ...

正確な遺伝子編集遺伝的疾患に取り組むために新しい戦略の開発を含む生物医学的進歩の基礎を形成します。遺伝子編集技術の最前線は、 c光沢regularly -私nterspaced s「hort」 palindromic repeats (CRISPR) の使用に依存するメソッド/最初に識別された Cas9 システム(参照1,2レビュー) ウイルスの遺伝物質の侵入に対する細菌免疫のコンポーネント。亜鉛指核酸 (ZFNs) と転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) を (参照3の見直し) などの他の遺伝子編集ツール以上 CRISPR/Cas9 システムの主な利点はプラスミド設計の相対的なシンプルさとCRISPR コンポーネントの構築-の電源が大いにより広い研究コミュニティにいくつかの専門の研究所から遺伝子-編集の拡張機能。また、CRISPR/Cas9 プログラミングの簡潔さと多重ターゲット認識能力さらにコスト効果の高い、簡単に使用できる技術としてその人気を煽っています。ウイルスのベクトル、細胞にこのような遺伝子編集コンポーネントを提供する研究者に利用できるさまざまな方法の中で最も人気のある、効率的なシステムのまま抜いて。
レンチウイルスベクター (LVs) は、CRISPR/Cas9 システム生体内で多様なアプリケーション4,5,6、7のためのコンポーネントを提供する最適な手段として浮上しています。いくつかの主要な機能は、LVs 分割と非分裂細胞、低免疫原性と最小の細胞毒性 (文献8の見直し) の両方に感染する能力を含むこのプロセスの人気のある選択肢を作る。結果として、LV 媒介性遺伝子治療は人間の遺伝性疾患、嚢胞性線維症やネオ血管の加齢黄斑変性などの基礎となる欠陥の補正だけでなく、HIV 1、HBV、HSV-1 などの感染症の治療に採用されています。4,5,7,9,10,11します。 また、LVs を効果的に多重遺伝子の単一のベクトル システム12を使用して異なるゲノム遺伝子編集を実行に変更されています。
しかし、Lv がホストのゲノムに統合するための固有の特性は変異することができます、しばしばハンディキャップとして transgene の配送車、特に臨床の現場での実用。さらに、Lv が安定的に統合された持続可能な高いレベルで自分の遺伝子を表現、以来このシステムは適して CRISPR/Cas9; など遺伝子編集コンポーネントの配信のためCas9 ガイド RNA (gRNA)、および ZFNs など同じような蛋白質の過剰発現は望ましくない突然変異13,14,15,16を含むオフターゲット効果の高いレベルに関連付けられています。,17 18細胞毒性を高めることができる可能性があります。したがって、正確な達成するために最小限のオフターゲット効果と遺伝子編集だ編集コンポーネント遺伝子の一過性発現を可能にするシステムを設計することが不可欠。
近年、一過性細胞16,19,20,21 (参照22レビュー) に CRISPR/Cas9 を表現するさまざまな配信プラットフォームが開発されています。直接ご紹介と共に適切なガイド Rna 精製 Cas9 細胞にトランスフェクションのプラスミド性16と比較する対象となる遺伝子編集でより効果的に示されていたに依存するメソッドが含まれます。そのリボ核タンパク質 (RNP) の調査は示した錯体から成るガイド RNA/Cas9 粒子はそれらの目標は、これらのコンポーネントの短期的な表現が達成するために十分であることを示唆で DNA 切断を仲介後急速にめくって堅牢な遺伝子16を編集します。多分、非統合アデノ随伴ウイルスベクター (通気) などウイルスのベクトルのプラットフォームは細胞に遺伝子編集機械を提供する実行可能な代案を提供できます。残念ながら、AAV カプシドは Lv よりも大幅に低い包装機能を所有している (< 5 kb)、これは深刻な (文献8の見直し) 単一ベクター内多成分 CRISPR ツールキットをパッケージ化する能力を妨げます。それは、レンチ ウイルスの力価を増加する (例えばナトリウム酪酸23) にヒストン脱アセチル化酵素を阻害する、または (例えば、カフェイン24) 細胞周期阻害化合物添加が示されていることは注目に値するです。最近の進歩にもかかわらず、これまで開発した一過性発現システムはまだ生産効率が悪くなどに、減らされたウイルス抗体とウイルスを介して生成された低伝達効率につながる欠点によって妨げ25をのようなアプローチします。
インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) は、LVs の包装機能を組み合わせて細胞における AAV のような episomal 整備の利点として遺伝子デリバリー車両の開発に大きな進歩を表しています。これらの機能は、主ベクトル、潜在的遺伝毒性要素の統合による変異原性に対して-à-に対して継続的な過剰発現の統合に関連する主要な問題を回避 IDLVs を助けます。以前 episomal 遺伝子式26,27を強化する IDLVs、正常に変更できることが示された.IDLV を介した CRISPR/Cas9 配信に関して低生産価とインテグラーゼ熟練したレンチウイルスベクター システムと比較して episome 由来のゲノムの低い表現制限ゲノム編集を提供するための善意のツールとしての実用遺伝子組換えを構築します。我々 は最近、遺伝子発現および IDLV の生産に関連付けられているウイルスの抗体は、ウイルス発現カセット28内転写因子 Sp1 のためのサイトのバインドを含めることによって大幅に強化を示した。変更された IDLVs は確実 CRISPR 媒介性遺伝子 ICLV を介した対応と比較して最小限のオフのターゲット変異を誘導しながら両方体外(HEK 293 t 細胞)体内(分裂後の脳ニューロン) での編集をサポートシステム28。全体的に、小説を開発した、コンパクト、CRISPR ツールキット IDLV プラットフォームで実施し、強化された遺伝子編集のような配信手段を使用しての様々 な利点を説明しました。
ここでは、IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産プロトコルは述べたように、アセンブリ、浄化、集中、および IDLVs、だけでなく、戦略は、これらのベクトルの遺伝子編集の有効性を検証するための滴定に関連するさまざまな手順を含みます。このプロトコルは別の捜査官のニーズを満たすために拡張が容易と 1 x 10 の10単位 (TU) の伝達の範囲の値と LV ベクトルを正常に生成するように設計/mL。このプロトコルを介して生成されたベクトルを活用すると、効率的にいくつかの異なる種類の細胞、培養および変換困難な胚性幹細胞、造血細胞 (T 細胞やマクロファージ) を含むとin vivo- に感染すること注入されたニューロン。さらに、プロトコルは似たような量のインテグラーゼ有能なレンチウイルスベクターの生産のため均等に適しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> 図 1: IDLV 包装します。変更されたプラスミドは、psPAX2 から派生した野生型インテグラーゼ蛋白質(b)の(a)の回路図 (詳細についてはプラスミド構築メソッドを参照してください)。クローン変異インテグラーゼ クローンのスクリーニングの代表 agarose ゲル画像。標準プラスミド DNA 分離ミニ キットを使用して作製した DNA サンプルは、EcoRV と SphI 消化によって分析されました。正しく消化クローン (番号 5、赤い点線) は直通 (サンガー) intD64E 置換シーケンスによってさらに検証されました。インテグラーゼ欠損包装カセット pBK43 に選ばれました。(c)トランスフェクション プロトコルの概略図は VSV G、パッケージング、および遺伝子カセット (Sp1-CRISPR/Cas9 オール イン ワン プラスミッド) をトランスフェクトした 293 t 細胞を示す IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルを生成する採用。細胞膜から芽をウイルス粒子には (遺伝子カセットから表される) ベクトルのフルレングスの RNA が含まれます。Tat の規制のタンパク質が含まれています、IDLV 包装システムの第二世代が使用され、牧師回転式はさらに別のカセット (RSV REV プラスミド) から補われます。略語: LTR 長いターミナル繰り返し、VSV-g の水疱性口内炎ウイルス pCMV サイトメガロ ウイルス プロモーター; G タンパク質ラウス肉腫ウイルス (RSV) プロモーター。RRE - (回転応答要素)。式カセットの他の規制要素があります Sp1 結合部位、Rev 応答要素 (RRE)、ウッド チャック肝炎ウイルス転写規制要素 (WPRE)、コア伸長因子 1 α プロモーター (EFS ノースカロライナ州)、ベクトル包装要素 ψ (psi)、人間のサイトメガロ ウイルス (hCMV) プロモーターおよび人間の U6 プロモーター。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>アレグラ 25R 卓上遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>xMark マイクロプレート 吸光度プレートリーダー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu;m フィルターユニット、500mL</td><td>コーニング</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>円錐底部超遠心チューブ</td><td>シートンサイエンティフィック</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブアダプター</td><td>シートンサイエンティフィック</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti スイングバケットローター</td><td>ベックマンコールター</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>15mL コニカル遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL コニカル遠心分離管</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>高結合性96ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC処理細胞培養ディッシュ、20 mmグリッド付き</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>100mm TC処理培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;M フィルターユニット、1L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ピペット、5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ピペット、10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ピペット、25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計、カバースリップ付き</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>細胞培養試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト胚性腎臓293T(HEK 293T)細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>293FT細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース培地</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌溶液、100X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>名称</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>p24ELISA試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗p24抗体</td><td>NIH AIDS研究および参照試薬プログラム</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1規格</td><td>NIH エイズ研究および参照試薬プログラム</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ 抗p24抗体</td><td>NIHエイズ研究および参照試薬プログラム</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ IgG</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>12-348</td><td>作業濃度 1:1500</td></tr><tr><td>正常なマウス血清、滅菌済み、500mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清、滅菌、10mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>使用濃度 1:1000</td></tr><tr><td>TMB ペルオキシダーゼ基質</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>使用濃度 1:10,000</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Restriction酵素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>ニューイングランドBiolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞分裂に crispr/cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

レンチウイルスベクターは、安定して高いレベルの遺伝子発現を仲介する細胞の広い範囲を伝達の能力による細胞に遺伝子編集コンポーネントを提供するための理想的な選択肢です。しかし、宿主細胞のゲノムに統合する能力を挿入変異原性のリスクを高めるため安全上の懸念を発生させます、臨床現場での使用を制限します。さらに、これら統合主務レンチウイルスベクター (ICLVs) 増加によって無差別遺伝子ターゲティングの確率を配信遺伝子編集コンポーネントの永続的な表現。代わりは、これらの問題の多くが解決、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の新世代が開発されています。ここ CRISPR 媒介性遺伝子編集およびリストのための新しく、改良された IDLV プラットフォームの生産のプロトコル、精製の手順し、このようなベクトルの濃度が記載されて伝達と HEK 293 t を使用して遺伝子編集効率細胞を示した。このプロトコルは、拡張が容易細胞in vitroとin vivoのことができる高価 IDLVs を生成に使用することができます。さらに、このプロトコルは、ICLVs の生産のために容易に適応することができます。

IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルのノックアウト効率の検証 CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトの効率を検証するのにモデルとして gfp 発現する 293 t 細胞を使用します。GFP 陽性細胞は、pLenti GFP (vBK201a) を 0.5 (図 3 b、「いいえウイルス」パネル) の MOI で HEK 293 t 細胞の伝達によって生成されました。SgRNA-GFP/Cas9 オール イン ワン ベクトル カセットは IDLV や ICLV の粒子にパッケージ化され、生産効率は p24 (上記を参照してくださいおよび図 3 a) elisa 法によって評価されました。Sp1 結合部位 (以下濃度) を含むベクトルの抗体価が 10 の範囲内に判明した10 TU/mL。我々 は、蛍光顕微鏡 (図 3...

セルに CRISPR/Cas9 を提供するための車としてインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の生産戦略について述べる。迅速かつ堅牢な遺伝子がセル内編集を仲介する能力、IDLVs 現在安全と同様に効果的なベクトル遺伝子送達用に比べてベクトル インテグラーゼ主務。

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

本プロトコルの目的は、in vivoおよびin vitroで細胞にCRISPR/Cas9トランスジーンを導入し、迅速かつ効率的な遺伝子編集を可能にする、最適化されたインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの作製とその潜在的な応用について記述することです。CRISPR/Casは、遺伝子編集および操作のための極めて効率的なプラットフォームです。ここでは、CRISPR/Cas遺伝子編集ツールの効率的な導入に向けた、高濃度の最適化インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの作製に関するプロトコルの概説を提示します。この手法は、培養細胞および分裂後ニューロンにおいて非常に効率的であることが証明されています。トランスフェクションの前日にHEK-293T細胞を播種し、翌日にコンフルエンシーが70～80%に達するようにしてください。トランスフェクションの前に、培養プレートから古い培地を吸引し、新鮮に調製した無血清培地を加えてください。15 mLのコニカルチューブに、15 cmディッシュへのトランスフェクションに使用するプラスミドミックスを調製するため、4種類のプラスミドをすべて加えます。次に、1 M塩化カルシウムを312.5 µL加え、滅菌二重蒸留水を用いて全量を1.25 mLに調整します。ボルテックスしながら、2X BES緩衝液を数滴ずつ徐々に加えます。次に、混合物を室温で30分間インキュベートします。各15 cmプレートに、プラスミド混合物を2.5 mLずつ滴下して加えます。その後、プレートを緩やかに回して混ぜ、37 °C、5% CO₂条件下で2〜3時間インキュベートします。3時間後、各プレートに10% serumを2.5 milliliters加え、一晩培養を継続します。10-milliliterの組織培養用ピペットを用いて、各培養皿に播種したトランスフェクション後の細胞から上清を注意深く吸引します。次に、全量の上清を50-milliliter遠心チューブに回収します。チューブを卓上遠心機にセットし、遠心分離を開始します。次に、上清を0.45 µmの真空フィルターユニットでろ過します。コニカル超遠心管に異なる濃度のスクロースを充填し、スクロース密度勾配を形成させます。ウイルスを含む上清をショ糖密度勾配に慎重に加えます。100 mLすべてのウイルス上清を処理する場合、1回の遠心につき6本の超遠心管を使用してください。次に、1X PBSバッファーを用いて超遠心管の重量バランスを調整し、17 °Cで70,000 gにて2時間遠心分離します。清潔なチューブに30%および60%のショ糖分画を回収し、冷たいた1X PBSバッファーを加えて液量を100 millilitersに調整します。ピペッティングを数回行い、サンプルを混合します。次に、1X PBS溶液中の20%ショ糖4 mil

a-protocol-for-production-integrase-deficient-lentiviral-vectors-for

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

ここでは、低分子Shield-1の下で定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(Cas9)の時間的および条件付き安定化に基づくゲノム編集ツールについて説明する。この方法は、培養細胞および動物モデルに使用することができる。...

条件Cas9安定化を用いた遺伝子機能評価のための新しいツールキット

このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。...

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

CRISPR関連のプロトコルがますます有用で利用しやすくなるにつれて、特定の実験条件下では依然として合併症や障害が発生する可能性があります。このプロトコールでは、CRISPR/Cas9を使用した受容体相互作用セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK1/RIP1)ノックアウトヒト細胞株の作製を概説し、このプロセスで遭遇する可能性のある課題を強調しています。...

CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

ここでは、用量増加アプローチを用いた化学抵抗性細胞の生成プロトコルを提示し、その後、エピジェネティック修飾因子を標的としたCRISPR/Cas9ベースのスクリーニングを実施し、獲得化学抵抗性の調節因子を特定するために焦点を絞ったsgRNAライブラリーを用います。また、化学抵抗性細胞モデルに合わせた複数の最適化ポイントも提供し、耐性機構を調査する研究者にとって堅牢な枠組みを提供します。...

化学抵抗性細胞に対するエピゲノム全域のCRISPR-Cas9ベースのノックアウトスクリーニング

学ぶインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（IDLV）の生産法とCRISPR/Cas9遺伝子編集への応用。HEK-293T細胞を用いた高濃度ベクター調製と、in vivo・in vitroでの効率的な遺伝子導入技術を解説します。

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

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