セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

この凝集アッセイの全体的な目標は、Notch受容体とトランスリガンドとの結合、およびシスリガンドによるその阻害を評価することです。この方法は、遺伝的または薬理学的要因がNotch受容体のリガンドへの結合にどのように影響し、シグナル伝達を変化させるのかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、Notch受容体とそのリガンドとのトランス結合およびシス結合を評価できることです。

興味深いことに、内因性リガンドの重なり効果を伴わずに。評価を開始するには、シグナル受信細胞をスピンダウンし、それらをシュナイダー培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。

6ウェルプレートの各ウェルに5回10回10および安定なS2ノッチ細胞を、シュナイダー培地のウェルあたり1ミリリットルで、6ウェルプレートの各ウェルにプレート化する。次に、7.5μgの二本鎖RNAを各ウェルに加え、細胞を摂氏25度で24時間インキュベートします。0.7ミリモルの硫酸銅を添加してNotchの発現を誘導し、細胞を25°Cで3日間インキュベートします。

インキュベーション後、血球計算盤を使用してシグナル伝達細胞を手動でカウントします。そして、6ウェルプレートの各ウェルに10〜6番目の安定細胞を5回プレートし、補充したシュナイダー培地のウェルあたり1ミリリットルで。次に、0.7ミリモルの硫酸銅を加えてリガンドの発現を誘導し、細胞を摂氏25度で3時間インキュベートします。

二本鎖RNA処理されたS2コントロール細胞およびS2ノッチ細胞を穏やかなピペッティングで回収します。そして、24ウェルプレートにウェルあたり10〜5細胞の2.5倍をプレート化する。5番目の安定なS2-DeltaまたはS2-Serrateトマト細胞に5倍10を加え、合計200マイクロリットルのシュナイダー培地を補充します。

プレートを150rpmのオービタルシェーカーに置きます。1分後、各ウェルの内容物を混合し、20マイクロリットルを取り出して凝集体の数を数えます。同時に、倒立型複合顕微鏡で10倍の倍率で代表的な画像を撮影します。

細胞を可視化するには、顕微鏡にカメラをセットし、ソフトウェアと接続して画像を取得します。血球計算盤を使用して骨材を手動でカウントします。プレートをシェーカーに置きます。

画像の取得とカウントを繰り返し、5分と15分の集約後にカウントします。バックグラウンドコントロールとして、S2細胞とS2-DeltaまたはS2-Serrate Tomato細胞との間の1mL当たりの凝集体数、およびS2-NotchとS2-DeltaまたはS2-Serrate Tomato細胞との間の1mL当たりの凝集体数を計算することにより、トランス結合定量を行います。6ウェルプレートの各ウェルに5倍10〜5番目のS2細胞を、補充したシュナイダー培地のウェルあたり1ミリリットルにプレーティングすることにより、シグナル受容セルを調製する。

各ウェルに7.5μgの二本鎖RNAを加え、プレートを摂氏25度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、市販のトランスフェクション試薬を使用して、二本鎖RNA処理細胞をコトランスフェクションし、ウェルあたり合計DNA濃度が2マイクログラムになるようにします。一過性にトランスフェクションしたS2細胞を摂氏25度で24時間インキュベー

翌日、0.7ミリモルの硫酸銅を添加してNotchと配位子の発現を誘導し、摂氏25度で3日間インキュベートします。前のセクションで説明したように、シグナル送信セルを準備します。そして最後に、前述のように、シグナル送信セルとシグナル受信セル間のアグリゲーションを実行します。

1分から5分の間に凝集体の数が急激に増加したことが観察されました。その後、アグリゲートの数は 30 分まで増加し続け、その速度は遅くなりました。3つの時点での凝集を示す画像は、EGFP二本鎖RNA処理S2-Notch細胞がS2-Delta細胞と凝集体を形成し、S2-Delta細胞の数が時間とともに増加することを示しています。

対照的に、偽細胞と二本鎖RNA処理されたS2-Notch細胞は、凝集体をより早く形成し、凝集体はより大きく、数が多くなりました。シャムレベルの低下がNotchとDeltaのトランス結合を増強したことを示しています。NotchおよびDelta発現コンストラクトを同量S2細胞にトランスフェクションすると、これらの細胞とS2-Delta細胞との間に形成される凝集体の数が劇的に減少します。

また、シスデルタの量を減らすと、骨材の数も増えます。これらのアッセイで使用されるNotch/cis-Delta比の範囲において、cis-DeltaはNotchとtrans-Deltaとの間の結合を用量依存的に阻害できることを示しています。相対凝集の定量化は、EGFPおよび偽の二本鎖RNA処理で同等の凝集阻害を示しました。

すべての試薬を調製すると、このアッセイは簡単で、数時間で実行できます。