Name: セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学ぶショウジョウバエNotch受容体のトランス配位子結合とシス配位子による阻害の評価法。in vitro細胞凝集アッセイにより、遺伝的・薬理学的要因がシグナル伝達に与える影響を明らかにする。

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著者は NIH/日の出からのサポートを認める (HJN、R01GM084135) 水谷糖質科学 (HJN にグラント #110071) トム V. Lee を議論と、アッセイの提案に感謝している財団と Spyros Artavanis-Tsakonas、ヒューゴ ・ Bellenロバート ・ フレミング、ケン アーバイン校とプラスミドのセルラインショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC)。

1.シャムスノックダウンのため二重鎖 RNA (dsRNA) の準備
<ol>
	<li>Pcr の製品の
	<ol>
		<li>DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。 
		緑色蛍光タンパク質を強化(EGFP) dsRNA のプライマー (5' 3')- 前方プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 逆プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		シャムスdsRNA のプライマー (5' 3')- 前方プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 逆プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 注: EGFP dsRNA はネガティブ コントロールとして使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ゲル - 製造元のプロトコルに従って商業ゲル精製キットを使用してポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の製品を浄化します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って T7 プロモーターから転写できる商品を使用しての in vitro転写を実行します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って RNA 精製キットを使用して dsRNA を浄化し、-80 ° C で保存</li>
	<li>次の手順 (1.5.1-1.5.5) を使用して、シャムスノックダウンの効率を評価します。
	<ol>
		<li>6 の各ウェルにも検定とプレート 5 x 105 S2 セルを使用して手動でセル 1 mL/シュナイダーの中のプレートを添加した 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの数。</li>
		<li>各ウェルにEGFP- またはシャムスdsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>収穫制御 (EGFP dsRNA 処理) と 25 ° C で 5 分間 1,000 x g とによると RNA 抽出キットを使用しての RNA の隔離のためのプロセスでの遠心分離によってダウン ペレット化が続く穏やかなピペッティングによるシャムスdsRNA 扱われる S2 細胞製造元のプロトコル。</li>
		<li>分光光度計およびプロセス 100 使用して RNA を定量化する商業 qPCR 試薬とプライマー ・ プローブと次の PCR の温度プロファイルを使用してステップ 1 qRT PCR のために RNA の ng: 変性 (95 ° C、15 s) と焼鈍/拡張 (60 ° C、1 分)。 注: は、プライマー ・ プローブ セットでこれらの研究でshams さんとコントロールの qRT PCR 実験用計測器については材料の表を参照してください。</li>
		<li>2-16ΔΔCTメソッドを使用して相対シャムスの mRNA のレベルを計算します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Notch 受容体とトランス間のバインドの評価-配位子
<ol>
	<li>信号受信セル (Notch 受容体を発現する S2 細胞) を準備します。
	<ol>
		<li>診断を使用して手動でのセルをカウントし、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加したプレート 5 x 105 S2 とシュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに安定した S2 ノッチ細胞。 注: S2 ノッチ細胞、ショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC) から利用可能なメディアで 200 nM メトトレキサートを追加します。0.5 mM メトトレキサート ストック溶液を調製するには、最初 1 M NaOH の 250 μ L の 20 mM メトトレキサート ソリューションを準備します。次に、このソリューションを 0.5 mM 1 M リン酸バッファー生理食塩水、-20 ° C でストアを希釈します。S2 ノッチ細胞にノッチ蛋白質の表現はpMTベクトルでショウジョウバエのメタロチオネインのプロモーターの制御下です。</li>
		<li>各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4ノッチの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。 メモ: CuSO4は、メタロチオネインのプロモーターによって制御タンパク質の発現を誘導するために使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>信号を送る細胞 (S2 セル デルタまたは Serrate 配位子を表現する) を準備します。
	<ol>
		<li>106安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル 1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに x の検定とプレート 〜 5 を使用して手動でのセルをカウント/シュナイダーの中の井戸 10% 添加した FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。 注: は、メディアで S2 デルタ細胞の 200 nM メトトレキサートと S2 鋸歯トム細胞の 100 μ g/mL hygromycin を追加します。デルタと鋸歯状トムの式-鋸歯状12トマト タグ付きで機能的なバージョン- pMTベクトルでショウジョウバエメタロチオネインのプロモーター下にあります。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4リガンドの発現を誘導し、, 3 h の 25 ° C でを追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>信号の送信と受信の細胞間の集約を実行します。
	<ol>
		<li>DsRNA 扱われる S2 を収穫 (コントロール) と穏やかなピペッティングしてプレート 2.5 x 10 の5細胞/ウェルで検定による手動カウント後 24 ウェル プレート S2 ノッチ細胞。</li>
		<li>シュナイダーの媒体の 200 μ L の総ボリュームで 5 × 105安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムのセルを追加 (FBS、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加した)。 注: 処理 (めっき、誘導、dsRNA の処理) を含むすべての S2 セルは、バイオ セーフティ キャビネットの下で行われていた。</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/分) で軌道シェーカーにプレートを配置します。</li>
		<li>1 分後、各ウェルの内容を混合し、集計の数を数えるために 20 μ L を取る。<ol>
			<li>同時に 10 倍の倍率 (PLL 10/0.25 目標) を使用して逆の化合物の顕微鏡下での代表的な画像を取る。</li>
			<li>手動で集計をカウント (&#62; 6 細胞) 診断。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>シェーカーにプレートを配置します。</li>
		<li>画像の取得と 5 分後と 15 分間集計のカウントを繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>トランスの定量化を実行-バインド。
	<ol>
		<li>バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯トムと mL あたりの集計の数を計算します。</li>
		<li>S2 ノッチと S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル間の mL あたりの集計の数を計算 (トランスの大きさ-バインディング)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3。ノッチとトランス間の結合阻害の評価- Cisによって配位子の配位子
<ol>
	<li>信号受信セルを準備します。
	<ol>
		<li>シュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルのプレート 5 x 105 S2 セルは、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加しました。</li>
		<li>各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>共同 transfect dsRNA 処理細胞pBluescriptとpMT ノッチ11 (DGRC) だけで、 pMT ノッチとpMT デルタ11 (DGRC) またはpMT 鋸歯状の合計172 μ g/ウェルを使用して製造元のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬の濃度は DNA。 メモ: pBluescriptは、コントロールとして使用されます。共同 transfected セルは S2 ノッチと呼ばれる、&#38; デルタ過渡または S2 ノッチ &#38; 以下一時的な細胞を鋸歯状します。</li>
		<li>25 ° C 24 時間で一過性トランスフェクション S2 細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4ノッチとリガンドの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2 で説明されているように信号を送る細胞を準備します。</li>
	<li>セクション 2.3 で説明した信号を送信して信号受信セル間の集約を実行します。</li>
	<li>トランスの阻害を定量化- cisによってバインド-配位子。
	<ol>
		<li>バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯と mL あたりの集計の数を計算します。</li>
		<li>Cisによって抑制の大きさを定量化-次のように配位子。<ol>
			<li>S2 ノッチ過渡と S2 デルタ セルの集計の数としてAを定義します。</li>
			<li>S2 セル間集計数なノッチとデルタで一過性 co transfected Bを定義 (S2 ノッチ &#38; デルタ過渡) と S2 デルタ細胞。</li>
			<li>相対的な集合Cを計算 (B x 100) =/A</li>
			<li>Cis- 100 としてリガンド (デルタまたは Serrate) – によって抑制の大きさを計算するC。 注: 例として、相対的な集計が 45%、 cisの場合-配位子はトランスを阻害すると考えられている-55% によるバインドします。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者は利害の対立があります。

正規 Notch シグナルは、Notch 受容体とそのリガンド5間の相互作用に依存します。ノッチのパスに関するほとんどの研究は、主にノッチと隣接セル (トランス) の配位子の結合を検討、ノッチと同じ細胞リガンドが影響しあうか、およびこれらのいわゆるcis-ノッチの抑制的役割を果たす相互作用3,4をシグナリングします。したがって、正規の notch シグナルに及ぼす修飾子の基になるメカニズムを解読するノッチ-リガンド相互作用 (トランス・シス) の両方のタイプを確認する適切なです。ただし、動物の開発の間に多くの状況で、これらの相互作用とそのフィードバック調節の両方の関与は生体内研究1,6を複雑になります。この議定書でトランス配位子・ cis</e...

正規 Notch シグナルは、隣接するノッチの受容体とそのリガンド1間の相互作用を促進する細胞の物理的な接触を必要とする短距離の細胞コミュニケーション メカニズムです。(信号受信細胞の表面上に存在) Notch 受容体リガンドとの相互作用 (信号送信の表面に細胞) Notch シグナルを開始し、トランスとして知られている-活性化2。その一方で、ノッチと同じセル内とそのリガンドの相互作用のノッチ経路の阻害につながるし、 cisとして知られている-抑制3。トランス- とcisのバランス-相互作用が最適なリガンド依存性 Notch4をシグナルのために必要です。ショウジョウバエは 4 ノッチの受容体と 5 配位子を持つ哺乳類とは異なり (デルタと Serrate) 2 つの配位子 1 つのノッチの受容体を持ちます [ジャグ 1 (JAG1)、JAG2、デルタのような 1 (DLL1) DLL3 および DLL4]5。このシンプルさを持つショウジョウバエモデルはノッチ-リガンド相互作用とその後 Notch シグナル経路の修飾子の効果の分析・研究に使いやすさを提供しています。(ショウジョウバエの翼の開発を含む)、動物の開発時に特定のコンテキストで両方cis- および-適切な Notch シグナルを達成し、運命1,6 セルの相互作用が関与しています。.シス-トランス対にこれらのコンテキストでノッチ経路の修飾子の効果を区別することが重要だ-ノッチとそのリガンドとの相互作用。
当社グループは、ショウジョウバエのノッチにキシロースを否定的と呼ばれる炭水化物残留物の添加が翼開発7を含む、特定のコンテキストで Notch シグナルを調節することを報告しました。シャムスの損失 (酵素、xylosylates ノッチ)「翼の静脈の損失」表現型7に 。最近では、クローン解析と遺伝子投与実験は、シャムスの損失がデルタ介したノッチ名指しを強化することを使用されました。シャムス変異体で強化された Notch シグナルが減少したcisの結果かどうかを区別するために-抑制または増加トランス-活性化、幼虫翅成虫原基におけるノッチ ligands の異所性発現の研究dpp GAL4ドライバーを使用して行われました。これらの実験は証拠を示唆シャムスがトランスを調節することを提供-ノッチcisに影響を与えずにデルタでノッチの活性化-8配位子による抑制。ただし、フィード バック規制と内因性リガンドの作用の異所性発現研究1,6,9の解釈を複雑にします。
ショウジョウバエS2 細胞10を用いて, この問題を解決するには、ノッチ-リガンド相互作用研究11,12の簡単な生体外でシステムが得られます。S2 細胞しない内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド11を表現し、鋸歯状の13ノッチ リガンド凝集実験8に影響しない低レベルを表現します。したがって、S2 細胞をノッチおよび/または個々 の配位子 (デルタまたは Serrate) 専ら Notch 受容体またはその配位子の 1 つを表すセルを生成するまたはそれらの組み合わせによって、その安定または一過性を導入することができます。S2 のノッチを表現する細胞の受容体リガンド結合11,12,14を介した血液凝集体の形成に配位子を表現する S2 細胞結果を混ぜてください。集計の形成の定量化は、トランスの測定を提供します-ノッチとその配位子15 (図 1) との結合します。同様に、S2 細胞が cotransfected ノッチとデルタまたは Serrate 配位子とすることができます (すなわち cis-配位子)。Cis-これらのノッチ表現 S2 細胞における配位子はトランスとノッチのバインディングを破棄する-配位子との結果集計形成8,12,14を減少しました。Cisによる会合体形成の相対的な減少-配位子は、 cisの抑制効果の測定を提供します-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-配位子 (図 2)。したがって、細胞凝集アッセイが活かされて -トランス・シスの xylosylation の損失の影響を調べるためのノッチとそのリガンドの相互作用。
ここでは、提案する詳細なプロトコル細胞凝集アッセイはトランスとノッチの結合を評価する目的のため-配位子とcisによるその阻害-ショウジョウバエS2 細胞を用いた配位子。例として、我々 はノッチ xylosylation のノッチとトランス間のバインディングへの影響を判断できるようにデータを提供-デルタ8。これらの簡単な試金はノッチ-リガンド相互作用の in vitroの半定量的評価を提供し、ノッチ経路修飾子の生体内での効果発現の分子機構を調べる。

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider's ショウジョウバエ medium, modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td><td>GE Healthcare lifescience&nbsp;</td><td></td><td></td>SV30010</tr><tr><td>CELLSTAR 6 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini shaker</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HDトランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 転写キット</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA 精製キット)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision 倒立顕微鏡</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 顕微鏡 デジタルカメラ + 高度なソフトウェア</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>ToupViewソフトウェアを使用した画像取得</td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>メトトレキサート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅</td><td>マクロン ファインケミカルズ</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2細胞</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-SerrateTom cells</td><td></td><td></td><td>R. Fleming からの贈り物 (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta cells</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Notch cells</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vector</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>S. Artavanis-Tsakonas からの贈り物</td></tr><tr><td>pMT-Serrate ベクター</td><td></td><td></td><td>Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch ベクター</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Hugo Bellen</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td><td>応用バイオシステム</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>FAM-MGB染料付き</td></tr><tr><td>CG7939 (RpL32)の TaqMan 遺伝子発現アッセイ</td> <td>Applied Biosystems</td><td>Dm02151827_g1</td><td>with FAM-MGB dye</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystem</td><td></td><td>4351405 96-well Block module</td></tr></tbody></table>

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とcisによるその阻害-配位子

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch シグナルは、動物の開発および成人のメンテナンスに幅広く使用されて進化的に保存された細胞間コミュニケーション システムです。隣接セルからのリガンドと Notch 受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化 (トランス-活性化)、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達 (cis-抑制)。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立ちます。ノッチと多くの細胞タイプの有機配位子の重複式ドメインとフィードバック機構の存在のためトランス-シス対に与えられた翻訳後修飾の効果の研究-ノッチの相互作用とその配位子生体内で困難です。ここでは、ノッチのトランスとcis各リガンドへのバインドをノッチ経路修飾子をノックダウンの効果を評価する細胞凝集アッセイでショウジョウバエS2 細胞を使用するためのプロトコルについて述べる。S2 細胞安定または一過性発現するノッチ表現のベクトル (S2 デルタまたは S2 鋸歯) 各ノッチ リガンドを発現する細胞と混在しています。トランス-リガンドと受容体の結合は異型細胞集塊の形成に結果し、成る mL あたりの集計の数の点では測定 &#62; 6 セル。Cisの抑制効果を検討する-配位子、ノッチとそれぞれの ligand の共発現 S2 細胞が S2 デルタまたは S2 鋸歯状細胞混在、集計数は上記のように定量化します。Cisの存在のため集計数の相対的な減少-配位子によりcis-リガンド-トランスの阻害を介した-バインド。これらの簡単な試その配位子にノッチのバインディングの遺伝的または薬理学的操作の効果の半定量的なデータを提供できるし、の生体内で効果の基礎となる分子メカニズムの解明に役立つことができます。Notch シグナルのような操作。

私たちの生体内観察提案、Notch シグナルによる利得の xylosyltransferase 遺伝子のシャムス結果の損失増加デルタ介したトランス-シスに影響を与えずにノッチの活性化-の抑制配位子8ノッチ。この概念をテストするための in vitro細胞凝集アッセイを行った。まず、S2 細胞におけるシャムス発現ノックダウンされたシャムスdsRNA を使用します。EGFP dsRNA は制御として使用されました。ノックダウン (KD) の効率は、リアルタイム PCR を用いて、808よりも大きいことが示されました。トランスと Notch 受容体の結合、-シャムス凝集アッセイを使用して KD を調べた時にデルタ。S2 ノッチと S2 デルタの細胞間の集約をそれらを混合後様々 な時点で調べた。普通 S2 細胞と S2 デルタ...

-トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

この凝集アッセイの全体的な目標は、Notch受容体とトランスリガンドとの結合、およびシスリガンドによるその阻害を評価することです。この方法は、遺伝的または薬理学的要因がNotch受容体のリガンドへの結合にどのように影響し、シグナル伝達を変化させるのかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、Notch受容体とそのリガンドとのトランス結合およびシス結合を評価できることです。興味深いことに、内因性リガンドの重なり効果を伴わずに。評価を開始するには、シグナル受信細胞をスピンダウンし、それらをシュナイダー培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。6ウェルプレートの各ウェルに5回10回10および安定なS2ノッチ細胞を、シュナイダー培地のウェルあたり1ミリリットルで、6ウェルプレートの各ウェルにプレート化する。次に、7.5μgの二本鎖RNAを各ウェルに加え、細胞を摂氏25度で24時間インキュベートします。0.7ミリモルの硫酸銅を添加してNotchの発現を誘導し、細胞を25°Cで3日間インキュベートします。インキュベーション後、血球計算盤を使用してシグナル伝達細胞を手動でカウントします。そして、6ウェルプレートの各ウェルに10〜6番目の安定細胞を5回プレートし、補充したシュナイダー培地のウェルあたり1ミリリットルで。次に、0.7ミリモルの硫酸銅を加えてリガンドの発現を誘導し、細胞を摂氏25度で3時間インキュベートします。二本鎖RNA処理されたS2コントロール細胞およびS2ノッチ細胞を穏やかなピペッティングで回収します。そして、24ウェルプレートにウェルあたり10〜5細胞の2.5倍をプレート化する。5番目の安定なS2-DeltaまたはS2-Serrateトマト細胞に5倍10を加え、合計200マイクロリットルのシュナイダー培地を補充します。プレートを150rpmのオービタルシェーカーに置きます。1分後、各ウェルの内容物を混合し、20マイクロリットルを取り出して凝集体の数を数えます。同時に、倒立型複合顕微鏡で10倍の倍率で代表的な画像を撮影します。細胞を可視化するには、顕微鏡にカメラをセットし、ソフトウェアと接続して画像を取得します。血球計算盤を使用して骨材を手動でカウントします。プレートをシェーカーに置きます。画像の取得とカウントを繰り返し、5分と15分の集約後にカウントします。バックグラウンドコントロールとして、S2細胞とS2-DeltaまたはS2-Serrate Tomato細胞との間の1mL当たりの凝集体数、およびS2-NotchとS2-DeltaまたはS2-Serrate Tomato細胞との間の1mL当たりの凝集体数を計算することにより、トランス結合定量を行います。6ウェルプレートの各ウェルに5倍10〜5番目のS2細胞を

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、HEK細胞凝集アッセイを通じてシナプス細胞接着分子間の細胞間相互作用を測定する技術を実演します。このアッセイでは、所望のシナプス前細胞接着分子と蛍光タンパク質を発現する同数のHEK細胞を、シナプス後細胞接着分子と別の蛍光タンパク質を発現するHEK細胞と混合します。細胞接着分子間の相互作用により、細胞は凝集し、これは蛍光顕微鏡で測定できます。...

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対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成<em&gt;インビトロ</em

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