Name: アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ神経細胞・マクロファージ共培養法を用いた神経突起伸展促進メカニズム。cAMP刺激によりマクロファージが再生促進因子を分泌し、DRG神経細胞の軸索伸長を誘導する手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロトコルは、NRF-2015R1A2A1A01003410 科学省、ICT および将来計画、韓国政府からの助成金によってサポートされます。

すべての実験動物を含む制度動物ケアおよび使用委員会の亜洲大学医学部によって承認されました。
1. 文化解離アダルト後根神経節ニューロンの準備
<ol><li>文化をセットアップする前にあらかじめポリ-D-リジンとラミニン 6 ウェル プレートをコートします。0.01% ポリ-D-リジン 2 h の 37 ° C、4 ° C で 6 ウェル プレート、一晩インキュベートします。蒸留水で 2 回プレートを洗います。</li>
	<li>2 時間、室温で 3 μ G/ml の濃度でラミニン溶液でプレートを孵化させなさいし、蒸留水で 2 回、その後、洗浄します。少なくとも 1 時間室温でプレートを乾燥します。</li>
	<li>圧縮された CO2ガス シリンダーに接続されている透明な CO2チャンバーにマウスを安楽死させます。外科ブレードで脊柱を上の皮膚を切開し、椎体の骨を公開する両側傍脊柱筋を解剖します。細心の注意、Drg は完全にさらされるまで狭い先端手術 rongeur を使用して椎体骨を削除します。 注: 大人 Drg ニューロンは 8 週間から 12 週間古い歳大人の C57BL6 男性マウスから取得されます。</li>
	<li>虹彩はさみと解剖顕微鏡の下で細い鉗子を使用して C1 レベルまで S1 から二国間、Drg を削除します。シュワン細胞や線維芽細胞の汚染を最小限にするために完全に Drg から根をカットしようとします。</li>
	<li>60 mm シャーレまですべて、Drg を収集 5 mL の冷たいダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 氷の上を含む解剖 drg コードを格納します。 注: できるだけ早く、Drg を解剖するが重要です。1 つのマウスからすべての Drg のコレクションする必要がありますいない安楽死後 30 分 30 分以上かかる、Drg の収集を停止、Drg がまだ残っていて、次の手順に進みます。</li>
	<li>1.5 mL エッペン チューブ カットオフ エンドと青いピペット チップ (1000 μ L) を使用して、Drg に転送します。ミニ遠心分離機を使用していくつかの秒のクイック スピン後、DMEM を削除します。125 U/mL タイプ XI コラゲナーゼを含む DMEM の 1 mL を追加し、37 ° C のインキュベーターでツイスター シェーカーを使用して緩やかな回転 (35-40 rpm) と 90 分のためのチューブを孵化させなさい。テープを使用してシェーカー階チューブを固定します。</li>
	<li>コラゲナーゼを含む DMEM を破棄し、新鮮な DMEM の 1 mL を追加します。フローティング DRGs 完全に底に沈みし、組織破片を DMEM を削除まで待ちます。少なくとも 6 回この洗浄工程を繰り返します。 注: は、上清を完全に破棄しようとしないでください。上澄み DMEM に任意の Drg を削除しないように注意します。</li>
	<li>カットオフ エンドと青いピペット チップ (1000 μ L) を使用して、15 mL の円錐管に、Drg を転送します。優しく上下にピペットの少なくとも 15 倍を使って均一な細胞の懸濁液を作る青いチップ (1000 μ L)。泡を避けるし、ピペット チップと円錐形の管の底に触れないでください。</li>
	<li>3 分の 239 x g でチューブを遠心し、慎重に破片をフローティングで上澄みを廃棄します。B27 Neurobasal 培の 1 mL を追加 (2.0 %v/v) し、上下に 5 〜 10 倍軽くピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を 50 mL のコニカル チューブ上にオーバーレイ 70 μ m セル ストレーナーに通過します。2 分待つし、ピペット コント ローラーを使用してストレーナーに Neurobasal/B-27 中を注ぐ。</li>
	<li>すべて収集した DRG ニューロン (1 つのマウスからおおよそ 2 x 106 DRG ニューロンの合計) 6 ウェル プレートの 2 つの井戸の上に板します。1 つの大人のマウスから DRG ニューロン 6 ウェル プレートに 2 つの井戸をカバーします。マクロファージ共培養まで、37 ° C で CO2インキュベーターでプレートを配置します。</li>
</ol>2. A 細胞文化の挿入に P, 腹腔内マクロファージの共培養
注: 解離の DRG ニューロンの初期のめっき後の共培養 4 h の確立します。
<ol><li>主な腹腔マクロファージは 8 週間から 12 週間古い歳大人の C57BL6 男性マウスから用意しています。CO2商工会議所に動物を安楽死させます。繊細な腹部の皮膚を切開、腹膜を公開し、洗浄液の漏れを防ぐために腹膜を切断しないでください。</li>
	<li>22 G 針と注射器を使用して腹膜を穿刺し、冷たいリン酸緩衝・ サリン (PBS) 10 mL を腹腔内に注入します。1-2 分の腹膜を優しくマッサージします。その後、針を抜く針穿刺部位を介して PBS を絞るし、50 mL の円錐管に洗浄液を収集します。 注意: 使用前に PBS の冷たさを維持するために氷の上に注射器を置きます。</li>
	<li>239 x g 細胞成分をペレットへの 4 ° C で 10 分間で洗浄液を遠心します。室温で 3 分の赤血球 (RBC) 換散バッファーの 3 mL にペレットを再懸濁します。4 ° C で 10 分間 239 x g で再び細胞懸濁液を遠心分離します。3 mL の PBS でペレットを再懸濁します、任意の残りの RBC の換散バッファーを削除するもう一度細胞懸濁液を遠心分離します。 注: RBC の換散バッファーが完全に削除されていることを確認します。それ以外の場合 RBC 換散バッファーの残りは培養マクロファージに有毒かもしれない。</li>
	<li>Neurobasal/B-27 中 1 mL に小球形にされた細胞を再懸濁します。プレート細胞培養すべて収集したマクロファージ (3 × 106 6 × 106セルの合計) の半分は 4.2 cm2、解離の DRG の井戸の上に配置されているの有効面積挿入します。 注: 共培養期間中にマクロファージ Neurobasal/B-27 神経細胞培養培地で栽培しています。この条件下でのマクロファージの十分な生存が確認されました。</li>
</ol>3. Db キャンプとマクロファージ CM 集の治療
注: は、神経細胞・ マクロファージの共培養後 db キャンプ治療 4 h を開始します。
<ol><li>神経細胞・ マクロファージの共培養に 100 μ M db キャンプ溶液 2 μ L を追加します。コントロール実験のため PBS の同じボリュームを追加します。</li>
	<li>24 h 後同じ 6 ウェル プレートでマクロファージ培養液 1 ml 空井戸を埋めます。神経細胞・ マクロファージの共培養における細胞文化挿入をマクロファージ培養培地で空井戸に転送します。媒体を変更することがなく 72 h の同じ条件下で細胞を保ちます。 注: する CM コレクション中にマクロファージ培養液 1 mL だけ CM を集中して追加します。CM コレクション中に必要な場合、我々 追加挿入内マクロファージを完全にカバーするため。</li>
	<li>72 時間後携帯電話のコンポーネントを削除する 5 分 239 x g でマクロファージ CM を遠心します。上清を任意の残りの細胞残屑を除去する 0.2 μ m フィルターを通過します。使用するまで-70 ° C で収集した CM を格納します。</li>
</ol>4. 収集した CM 神経突起伸長法
<ol><li>別アダルト DRG ニューロン文化をセットアップする前に 1.1 と 1.2 に記載されている同じ手順に従う 8 よくチェンバー スライドがプレコートします。</li>
	<li>B27 Neurobasal 培解離アダルト DRG ニューロンを取得 1.3 から 1.10 に説明した同じ方法を使用します。プレコート 8 よくチェンバー スライドによくあたりプレート 5 × 104セルです。</li>
	<li>場所 2 h の 37 ° C の定温器でチェンバー スライド下部に接続するセルを許可します。その後、培養培地を 37 ° C で予熱した解凍 CM に置き換えます 注: 培養培地を削除するとき 8 よくチェンバー スライドの下部に触れないように注意し収集した CM を追加します。</li>
	<li>初期めっき後 15 時間はメディアを取り出して、PBS のセルを一度洗います。次に、井戸に冷えた 4% パラホルムアルデヒド溶液 200 μ L を追加し、4 ° C で 20 分間パラホルムアルデヒド溶液で細胞をインキュベート 注: 神経突起伸長試金のための DRG ニューロンの文化は正確に 15 時間に制限されているはずです。この条件の下でかなり神経突起はありません。</li>
	<li>氷冷 PBS にて 3 回洗浄し、10% を使用してブロックを実行ヤギ血清 (NGS) 0.1 %30 分トリトン X 10% で希釈した一次抗体 (抗-Tuj-1) ソリューションと固定セルをインキュベート ルームで 4 h (1 μ g/mL の濃度) で NGS温度または 4 ° C で一晩</li>
	<li>PBS にて 3 回洗浄し、室温で 2 時間二次抗体 (ヤギ抗マウス) ソリューションと細胞をインキュベートします。PBS で 2 回洗浄し、マウント ソリューションを使用して観察 (24 × 50 mm) と文化のスライドをマウントします。</li>
	<li>神経突起伸長を可視化する蛍光顕微鏡を用いて画像を取る。</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この共培養システムの生成のいくつかの重要な手順があります。マウス後根神経節ニューロンと腹腔マクロファージが新鮮な準備されていることを確認することが重要であり、健康です。我々 はすべての Drg の郭清を 30 分以上取ったとき CM の減少した神経突起伸長活性を経験しています。さらに、マクロファージの血液成分の汚染はまた CM の神経突起伸長活性の減少につながった。Db キャンプで堅牢なニューロン マクロファージ相互作用を引き出すために徹底的に洗浄もなる組織破片の完全な除去および可能性のある残りの細胞毒性の除去を確保するための重要なステップ コラゲナーゼや RBC の換散バッファーなどのコンポーネント。改めて別のポイントは、drg コードに接続されている根を可能な限り削除することです。残りの根のスタブは、DRG ニューロン培養シュワン細胞の汚染を増加させるでしょう。シュワン細胞は結果を混乱させる可能性があります文化における神経栄養因子の高い金額を生成できます。
このプロトコルでは解離マクロファージはウェル プレートの底面にメッキ DRG ニューロンから分離細胞文化挿入時のメッキでし...

負傷後脊髄や脳の中枢神経系軸索の再生を高めるために様々 な研究を求めています。炎症反応、神経系に傷害を必然的に伴う伝統的成果劇物1,2につながる二次の病理学プロセスに参加する考えられています。確かに、炎症反応を抑制するステロイドは急性脊髄傷害3の唯一の承認された治療です。しかしより最近の研究では、マクロファージ、代表的な炎症性細胞の種類が再生または負傷した神経系4,5,6の修復に参加できることを証拠を提供しています。たとえば、浸潤マクロファージ網膜神経節ニューロン7,8の再生を促進させるレンズ損傷生成プロ再生分子を次します。さらに、移植後根神経節ニューロンは、マクロファージがザイモサン9によってアクティブ化されている領域を軸索成長を増加しました。また、病変のサイトでマクロファージは、傷ついた末梢神経10成長寛容な環境を作成できます。
私たちの仕事は、マクロファージは、隣接するニューロンの軸索再生の能力に貢献できる強力な証拠も提供。後根神経節 (DRG) におけるマクロファージの活性化が示されている DRG の強化された再生能力に不可欠な感覚ニューロンの前処理末梢神経傷害11。同様の研究は独立して別の所12から報告。また、軸索再生13の能力を強化するよく知られている分子である amp (db キャンプ)、intraganglionic 注射誘発マクロファージの活性化したことを示した。マクロファージの非アクティブ化は、神経突起伸長活性に及ぼす db キャンプを廃止しました。後続の作品は、傷害による発現 CCL2 ニューロンのプロ再生表現型14,15マクロファージを刺激するために信号として識別されます。
上記の実験結果に基づき, 前処理傷害モデル11,14以降 drg コードで発生する分子のイベントに似た生体外モデルを設けています。このモデルでは、db-キャンプはプロ再生表現型とマクロファージの活性化につながるシグナル伝達細胞間を引き出す神経細胞・ マクロファージの共培養に適用されます。ここでは、我々 は我々 が神経突起伸展 (図 1) を促進する分子の要因を分泌するマクロファージを生成できます詳細なプロトコルを説明します。この実験モデルは、マクロファージを刺激または傷害神経系の軸索再生をサポートに誘導できるコンセプトを示しています。我々 のモデルはプロ再生マクロファージの活性化につながる細胞間情報伝達機構の勉強に役に立ちます。

<table><tbody><tr><td>細胞培養インサート透明PETメンブレン0.4&mu;m孔径</td><td>コーニング、ファルコン</td><td>353090</td>透明<td>PET膜、0.4-&mu;m細孔サイズ、6ウェルプレート</td></tr><tr><td>70-&mu;m ナイロン細胞ストレーナー</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8ウェル培養スライド</td> バイオ<td>コート</td><td>ポリ</td><td>-D-リジンを均一に適用した</td>バイオコート 354632</tr> 赤<tr><td>血球溶解バッファー</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ Clostridium histolyticum</em/em></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>サーモフィッシャーScientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin</td></tr><tr><td>B-27 supplement, serum free</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>extracellular solution</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine臭化水素酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 3'、5'-環状一リン酸、N6、O2'-ジブチリル-、ナトリウム塩</td><td>メルクミリポアコーポレーション、カルバイオケム</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% ノーマルヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 16210072</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>アンチ & ベータ;III tubulin (Tuj-1)</td> <td>プロメガ</td><td>G7121</td><td>マウスモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG (H+L) 二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>マリエンフェルド・スペリオル</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養 CO2 インキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>カールツァ</td>イス<td>ステミDV4</td><td></td></tr><tr><td>ツイストシェー</td><td>カーFINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td>オ<td>リンパスアメリカ株式会社</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>VWRインターナショナル、ハイクロン</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr>フリー<tr><td>ドマンピアソンロンガーFST</td><td>(ファインサイエンスツール)</td><td>16021-14</td><td>ステンレス鋼、14cm、湾曲、シングルジョイントアクション</td></tr><tr><td>ファインハサミ-タングステンカーバイド&ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>シャープ、鋸歯状</td></tr><tr><td>Dumont #7 鉗子</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel、0.07 x 0.04mm、湾曲</td></tr><tr><td>したバンナス スプリング シザース</td><td>FST (ファイン サイエンス ツール)</td><td>15000-00</td><td>ストレート、3mm 刃先、シャープ</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 マイクロ遠心分離</td><td>機職人技術グループ</td><td>DW-41</td><td>入力電圧: 115VAC</td></tr></tbody></table>

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

マクロファージが再生または負傷した神経系の修復に参加できることを強力な証拠があります。ここでは、マクロファージ、神経突起伸長を促進するエアコン生産媒体 (CM) に誘導されるプロトコルについて述べる。大人の後根神経節 (DRG) ニューロンは急性解離、メッキします。ニューロンは接続安定、マクロファージが文化のセル挿入も同じにオーバーレイで共培養です。サイクリック AMP (db キャンプ)、24 h、その後細胞培養は大食細胞を含む挿入の共培養に適用されます調節は 72 h の CM を収集する別よくに移動されます。共培養別アダルト後根神経節ニューロンの文化に適用されるとき、db キャンプで治療から CM は、堅牢な神経突起伸長活性を発揮します。単一のセルの種類だけから成る db キャンプ治療文化から得られる CM、DRG ニューロンまたは腹腔マクロファージ、神経突起伸長活性に表わさなかった。これは、神経細胞とマクロファージの相互作用はない CM に神経突起伸長活性分子因子を分泌するマクロファージの活性化のため不可欠であることを示します。したがって、私たちの共培養のパラダイムは、恵まれているプロ再生表現型マクロファージを刺激する神経細胞・ マクロファージの相互作用における細胞間情報伝達の研究に有用もなります。

大食細胞の神経突起伸長活性分子因子を分泌することができる生成することができますプロトコルについて述べる。堅牢な神経突起伸長別の DRG ニューロン文化 (図 2 a) に適用されるマクロファージ db キャンプで治療共培養から得られた CM となりました。比較では、PBS 処理共培養から得られる CM でしたいない当社の 15 h 文化期間 (図 2 b) に神経突起形成を誘導します。Db キャンプは、マクロファージだけで文化と扱われとき、この状態から得られる CM は神経突起伸展 (図 2) の支援に効果的でした。これはニューロン マクロファージ相互作用が proregenerative 能力が備わっているマクロファージを刺激するために必要不可欠ではないことを示唆しています。また、CM db キャンプ扱われるニューロンだけ文化から得られる、神経突起伸長 (<strong class="xfig...

現在のプロトコルは、神経突起伸長を促進する因子の分子を解放する能力が備わっている培養マクロファージを刺激する実験の手順を示します。神経細胞・ マクロファージの共培養にキャンプの治療は、強力な神経突起伸長作用を有している馴化培地を生成するマクロファージを誘導します。

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

この手順の全体的な目標は、神経突起の成長を促進する分子因子を分泌できるマクロファージを生成することです。この方法は、ニューロンとマクロファージがどのように相互作用して再生促進マクロファギックフェノタイプを活性化し、優れた再生を促進するかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、アデノシン血清分子であるサイクリックAMPを使用していることですが、これは以前の研究でマクロファージを刺激するために使用されていた生理学的酵素です再生促進型の表現型を持つマクロファージ。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、マクロファージの活性化がアクシオンの成長能力の向上に不可欠であり、それらが永久的な葉の損傷の予防策に従って優れたニューロンを生成できることを発見したときでした。培養物をセットアップする前に、poly-D Lycineとラミニンを含む6ウェルプレートをプリコードします。次に、6ウェルプレートを0.01 poly-D Lycineと共に摂氏37度で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、プレートを蒸留水で2回洗います。次に、プレートをラミニン溶液と1ミリリットルあたり3マイクログラムの濃度で室温で2時間インキュベートします。その後、プレートを蒸留水で2回洗浄し、プレートを室温で少なくとも1時間乾燥させます。次に、安楽死させたマウスの脊柱を覆う皮膚を手術用ブレードで切開し、椎骨のペアを両側に解剖して椎骨を露出させます。先端が細い外科用ロンジャーを使用して、DRGが完全に露出するまで椎骨を細心の注意を払って除去します。解剖顕微鏡下で、虹彩切除ハサミと先端の細い鉗子を使用して、DRGをS1からC1レベルまで両側から除去します。DRGを1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに移し、端がカットオフされた青色のピペットチップを使用します。次に、ミニ遠心分離機を使用して数秒間すばやく回転した後、DMEMを取り出します。11型コラーゲン1ミリリットルあたり125単位を含むDMEMを1ミリリットル加え、ツイスターシェーカーを用いて37°Cで緩やかに回転させながらチューブを90分間インキュベートします。その後、DMEMを含むコラゲナーゼを廃棄し、1ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。DRGを、端がカットオフされた青いピペットチップを使用して15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、少なくとも15回静かにピペットで上下させて、均質な細胞懸濁液を作ります。チューブを239Gで3分間遠心分離し、浮遊破片のある上清を慎重に捨てます。B27を添加したニューロバジル培地1ミリリットルを加え、5〜10回ピペッティングで静かにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管の上に重ねた70μメートルの細胞ストレーナーに通します。次に、収集したすべてのDRGニューロンを6ウェルプレートの2ウェルにプレートします。成体マウスから一次腹膜マクロファージを調製するには、腹部の皮膚を繊細に切開して腹膜を露出させ、腹膜を切らないようにして洗浄液の漏れを防ぎます。次に、22ゲージの針が付いた注射器を使用して腹膜に穿刺し、腹腔に10ミリリットルの氷冷PBSを注入します。腹膜を1〜2分間優しくマッサージします。次に、針を引き出し、針の穿刺部位からPBSを絞り出し、洗浄液を50ミリリットルの円錐管に集めます。その後、洗浄液を239gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞成分をペレット化します。続いて、ペレットを3ミリリットルの赤血球溶解緩衝液で室温で3分間再懸濁します。次に、細胞懸濁液を再び239gで摂氏4度で10分間遠心分離します。ペレット化した細胞を1ミリリットルのニューロバジルB27培地に再懸濁します。.回収したマクロファージ全体の半分を、有効面積4.2cm四方の細胞培養インサートにプレートし、解離DRGのウェルの上に置きます。ニューロンマクロファージを共培養してから4時間後、ニューロンマクロファージの共培養物に2マイクロリットルの100マイクロモルDBサイクリックアンプ溶液を添加する。24時間後、空のウェルに1ミリリットルのマクロファージ培養培地を同じ6ウェルプレートに充填します。ニューロンマクロファージ共培養中の細胞培養インサートを、マクロファージ培養培地と共に空のウェルに移します。72時間後、マクロファージ馴化培地を239 g で 5 分間遠心分離し、細胞成分を除去します。上清を0.2マイクロメートルのフィルターに通して、残っている細胞の破片を取り除きます。この手順では、8ウェルチャンバースライドにpoly-Dリシンとラミニンをプレコートします。次いで、前述したのと同じ方法を用いてB27を補充した、解離した成体DRGニューロンおよびニューロバジル培地を得る。プレコートされた8ウェルチャンバースライド上に、ウェルあたり4つのセルに10の5倍をプレートします。次に、チャンバースライドを摂氏37度のインキュベーターに2時間置き、細胞を底部に付着させます。次に、培養培地を、摂氏37度に予熱された解凍した調整培地と交換します。最初のめっきから15時間後、培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄し、次に200マイクロリットルの氷冷、4%パラホルムアルデヒド溶液をウェルに加え、細胞をパラホルムアルデヒド溶液と4°Cで20分間インキュベートします。その後、固定した細胞を10%正常ヤギ血清で希釈した一次抗体溶液で室温で4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影し、神経突起の成長を視覚化します。DBサイクリックAMPで処理した共培養物から得られたマクロファージ馴化培地は、別のDRGニューロン培養に適用した場合、強力な神経突起伸長をもたらしました。これに対し、PBS処理共培養物から得られた馴化培地は、神経突起の伸長を誘導しなかった。DBサイクリックAMPをマクロファージのみで培養した場合、コンディショニング培地は神経突起伸長をサポートするのに効果がありませんでした。このことは、ニューロンマクロファージの相互作用が、マクロファージを刺激して再生促進能力を持たせるために不可欠であることを示唆しています。また、DB cyclic AMP処理ニューロンのみの培養から得られた馴化培地も試験しましたが、神経突起の伸長は見つかりませんでした。ニューロンとマイクロプレートは新鮮で健康的に準備する必要があることを覚えておくことが重要です。解剖が長引いたり、腹膜マクロファージが血液成分で汚染されたりすると、定常培地の神経突起伸長活性が低下しました。このプロトコルでは、解離したDRGニューロンを細胞培養インサート上のマクロファージから財政的に分離しました。したがって、私たちの共培養システムは、完全に再生するマクロファージの活性化を媒介する細胞間シグナル伝達に関与する細胞因子の特定を可能にします。

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。...

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

このビデオは、マウスの後根神経節ニューロンとマクロファージの共培養を示しています。ニューロンはコーティングされたプレート上に播種され、マクロファージは安楽死させたマウスから採取され、処理され、培養インサートに追加されます。db-cAMPによる治療はニューロンを活性化し、マクロファージにニューロンの成長をサポートするための再生促進表現型を採用するように促します。...

In Vitroでのニューロンとマクロファージの共培養の開発

このビデオは、マクロファージで調整された培地を使用して、神経突起伸長として知られるニューロン突起の成長を促進するためのアッセイを示しています。ニューロンとマクロファージをcAMPで共培養し、マクロファージ由来のコンディショニング培地を回収します。条件付けされた培地でニューロンを成長させると、神経突起の成長が促進されます。これらの成長物は蛍光標識され、蛍光顕微鏡を使用して視覚化されます。...

マクロファージ馴染培地を用いたニューロン伸長の促進

このビデオは、ヒト誘導ニューロン(iN)と誘導オリゴデンドロサイト前駆細胞(iOPC)の共培養の確立を示しています。iNは、共培養でiOPCと混合され、その後、両方のiNがニューロンに、iOPCがオリゴデンドロサイトに成熟するのをサポートするためにインキュベートされます。ニューロンは他のニューロンやオリゴデンドロサイトとシナプス結合を形成し、オリゴデンドロサイトはニューロンの軸索の周りにミエリン鞘を発達させます。...

ニューロン-オリゴデンドロサイト相互作用をモデル化するための共培養法

多細胞生物では、分泌された可溶性因子がパラクリンシグナル伝達の結果として異なる細胞タイプからの応答を誘発します。インサート共培養システムは、細胞間接触がない場合に分泌された可溶性因子によって媒介される変化を評価する簡単な方法を提供します。...

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。...

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

ここでは、腫瘍細胞が免疫応答を抑制するために使用する非接触パラクリンシグナル伝達の研究を容易にするために透過性膜支持体を用いる方法を提示する。このシステムは、マクロファージ活性化を減衰させる腫瘍分泌因子の役割を研究することに適している。...

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。...

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

このプロトコルは、胚の日15-16でマウスの胚から単離された初代ニューロン細胞から確立されたミクログリア-ニューロン共培養と、出生後1-2日に新生児マウスの脳から生成された初代ミクログリアを説明しています。...

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

学ぶ神経細胞・マクロファージ共培養法を用いた神経突起伸展促進メカニズム。cAMP刺激によりマクロファージが再生促進因子を分泌し、DRG神経細胞の軸索伸長を誘導する手法を解説します。

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・マクロファージ共培養

さらに動画を探す

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養

さらに動画を探す

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・マクロファージ共培養