高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

この手順の全体的な目標は、ニューロンの成長に関与する動的構造の神経突起の分析に必要なサブマイクロメートルの軸方向の分解能で、in vitroニューロン体積の全フィールド測定を可能にすることです。この方法は、非成長または軸索変性中の補助スケールでの体積変化のダイナミクスに関する細胞神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、サブマイクロメートルの軸分解能とフルフィット観察、および時間または日の時間スケールを組み合わせることで提供されることです。

手順を開始するには、PDMSブロックにイソプロパノールを注いで化学フードの下で離型します。次に、フードのステンレス製ベンチに置きます。シリコンウェーハの周りをカットし、PDMSレプリカを型取りします。

次に、チップの周りを切り取り、メスまたはカミソリの刃を使用して2ミリメートルのマージンを残します。直径1.5mmのパンチャーをしっかりと押し込んで入口を打ち抜き、作動させることで入口の穴を切って彫ります。液体が注入されるチップの4つの専用ゾーンで同じことを行います。

その後、微細構造側の粘着テープを貼り付けて剥がしてチップをクリーニングします。両側にイソプロパノールを振りかけます。その後、エアブローガンを使用して加圧窒素でチップを乾燥させます。

この手順では、各カバースリップをクリーンルーム環境にあるスピンコーターに置きます。ポジ型フォトレジストを一滴垂らしてカバーガラスの約75%を覆い、4000rpmで30秒間スピンコートして、最終厚さ0.45マイクロメートルに到達します。カバーガラスを表面温度115°Cのホットプレートに1分間置きます。

マスクアライナーを使用して、製造パラメータに従って、専用のマスクを通じて各カバースリップを435ナノメートルの波長で露光します。次に、2つのガラス結晶化皿を準備し、1つは希釈せずに現像液を含み、もう1つは脱イオン水を含む。カバースリップを1枚ずつ現像液に浸し、結晶化皿を連続的かつ穏やかに攪拌しながら1分間浸します。

次に、ウェーハを脱イオン水に約5秒間浸します。ウェーハを吸収紙に移し、エアブローガンを使用して加圧窒素で乾燥させます。PDMSチップと、PDMSチップを接着するガラス皿の両方をプラズマチャンバーに配置して、表面活性化します。

次に、長方形の厚い顕微鏡スライドガラスに水滴を堆積させ、毛細管現象によってカバーガラスをスライドガラスに貼り付けます。顕微鏡で、スライドガラスの後部にあるフォトレジストストライプの位置をマークします。パターン化されたガラスカバースリップをマスクアライナーのマスクホルダーに置きます。

フォトレジスト参照オブジェクトの中央に付けられたマークを頼りにしてください。光学コントラストを上げるには、PDMSチップの下にシリコンウェーハを配置します。シリコンウェーハは、アライメントプロセス中、チャックにしっかりと取り付けられたままにする必要があります。

次に、PDMSチップをマスクアライナーのモバイル基板ホルダーにセットします。その後、チャックを十分に持ち上げて、チップとカバーガラス上に配置されたフォトレジストストライプの配列の両方を視覚化し、機械的接触の後ろにとどまります。位置合わせを行い、PDMSピラーの表面がガラスカバースリップに接触するまでチャックを持ち上げることにより、チップとカバースリップの間に機械的な接触を実現します。

その後、チャックを下げます。チップに貼り合わせたカバースリップをマスクホルダーから取り外します。次に、デバイスを35ミリメートルのペトリ皿に入れ、すべてをオーブンに5〜10分間移して、接着強度を高めます。

接着後30分後、PLO溶液を充填した10マイクロリットルのピペットチップを入口に置きます。次に、上に液滴が形成されるまで液体を入れます。出口と貯水池で同じ操作を繰り返します。

その後、チップの周りのペトリ皿にPBSを追加します。ペトリ皿をパラフィンフィルムで密封し、室温で最低5時間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの先端コーンを各注入穴に軽く押し込み、余分な液体を吸い上げます。

次に、PLOとチップを囲むPBSを培地で交換します。その後、チップを摂氏37度と二酸化炭素5%に調整されたインキュベーターに入れ、ニューロンが播種するまで、最低5時間のインキュベーション時間で行います。この手順では、チップから培地を引き出します。

新たに再懸濁した細胞溶液を2〜3マイクロリットル収集し、入口に注入します。すぐにコンセントで同じ操作を繰り返します。各リザーバーにほぼ同量の培地を注入します。

顕微鏡でチップをすばやく観察して、細胞の密度を確認します。最適なセル密度の桁は、4本の柱で区切られた正方形の表面内の約5〜10個のセルに相当します。0.5〜1マイクロリットルの細胞懸濁液を注入する手順を繰り返して、標的の細胞密度に到達します。

イメージングの場合は、培地をイメージング培地と交換します。次に、チップを落射蛍光顕微鏡の下に置きます。タイムラプス実験の場合、単一画像から複数の連続画像まで細胞の画像を取得します。

ここに示されているのは、キャリブレーションフォトレジストストライプとニューロンの代表的な観察結果です。これらのオブジェクトの高倍率の画像と断面が右側に表示されます。代表的な神経突起と高さ3マイクロメートルの中央チャンバーを以下に示します。

神経突起スライスの体積は、神経突起の幅の関数として計算できます。そして、これが代表的な成長コーンと高さ3マイクロメートルの中央チャンバーです。それらの下部構造は、約20ナノメートルの光学的バックグラウンドノイズからはっきりと浮かび上がります。

生命のタイムラプス観察は、高さ12マイクロメートルのチャンバーに播種されたニューロンを作用させ、成長円錐の縮小と再活性化のサイクルを数十分以内に追跡します。この手順を試みる際には、シリコン泥を製造するための深部イオンエッチング装置を利用できることが重要です。このビデオを見れば、構造化ガラスのカバースリップをPDMSチップに合わせる方法について十分に理解できるはずです。

一度習得すれば、この手法は3Dでの神経学の定量に再現性よく適用できます。この技術は、薬理学の分野の研究者が、実際の口径を持つさまざまな薬物の効果をすべて閉じた円錐形で探求する道を開きました。一次ニューロンの扱いには、汚染や粉々を避けるために多くの注意が必要であることを忘れないでください。

彼らがインキュベーターの外で過ごす時間を制限するために、培地を交換するときは常に穏やかで迅速であることを確認してください。