Name: 高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ 高解像度ニューロン体積測定法。PDMSマイクロ流体デバイスと蛍光排除法を用いて、サブミクロン軸方向分解能で神経突起の動態構造を解析します。神経成長と変性過程の研究に有用です。

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著者は、プロセス開発、デバイス作製の貴重なサポート ChiLab ・ マイクロ システム研究室 - トリノ工科大学 - 教授 C F Pirri、博士 M Cocuzza、博士 S L Marasso の人に DISAT を確認します。Quantacell からビクター ラシーンは、議論と画像処理の支援を感謝いたします。GFP LifeAct マウスと私たちを提供するため、マウスのためのサポートのための Institut キュリーとパブロ ・ バルガスとアナ · マリア ・ レノン (Institut キュリー) の動物施設からイザベル グランジャンとマノン変わって感謝しております。蛍光除外法の理解で彼らの助けのための Institut ランジュバンとクロティルデ Cadart、ラリサ Venkova インスティトゥート キュリー - umr を 144 からマチュー Piel からオリビエ Thouvenin に感謝しております。最後に、我々 は微細加工の彼らのサポートのための Institut ピエール ・ ジル de Gennes (CNRS UMS 3750) の技術プラットフォームを感謝します。この作品は一部、欧州研究評議会高度なグラント号 321107「チェロ」によって支えられた PSL ユニヴェルシテ (SwithNeuroTrails プロジェクト)、ANR Investissement d'Avenir 地球 Labex と Equipex。

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ニューロンのボリューム イメージングは、これらの細胞の長くて細い拡張のための FXm 技術の挑戦を構成します。このプロトコルでは、ニューロン イメージングへ専用マイクロ流体デバイスの同じ型の変形について説明します。
マイクロ流体設計の側面と横にある目的の選択は蛍光の排除のための基本でありトレードオフ水平解像度と画像の鮮明さを意味します。これは、商工会議所の高さより小さい焦点深度につながる高 NA なかったこと容積測定の精密のため有害なフォーカスでイメージングを行った、私のオブジェクトの輪郭間に十分な余白が残っている場合13に示されています。暴騰と積分面の境界。ただし、商工会議所の焦点深度よりもはるかに高いは、関心のオブジェクトのエッジが滑らかになり、光子拡散による画像の鮮明さを損ないます。この横方向のぶれを軽減の 3 μ m の高い部屋の作製と高 NA を使用しても非常によく定義された蛍光除外画像を提供した (0.8) 40 X 目標高い空間分解能と神経の枝を視覚化します。
チップ組立が重要なステップ、特に 3 μ m の高い部屋の場合が、慎重に操作 4.1.2 の説明に従って屋根の崩壊を回避できます。これらの薄い部屋に関連付けられた容積の比率に高い表面に時間をかけてデキストラン濃度の安定性の問題も発生します。我々 は、インキュベーションの 1 泊後、デキストランの表面の吸収はごくわずかだったことをチェックしている: PBS によるデキストランを交換した後柱と背景の強度の違いは初期強度のコントラストの 1000 人あたり約 1デキストランの存在下でのこれらの 2 つの領域。下部 coverslip と PDMS 屋根の両方神経細胞が付着することに注意してください。この効果は、コーティングとしてパターン coverslips (すなわち我々 は PDMS チャンバ内接着分子を孵化しない場合) を使用して、ローカライズ チャンバーの底に厳密にしたがってときに消えます。
法、すなわちデキストラン エンドサイトーシスの主要な限定の 1 つは非常に限られたという事実のために、その挑戦的な形態から離れてニューロンではなく FXm に適しているこれらの細胞で。我々 は、10 を選択して長期的に抑える kDa の定式化の範囲 (時間) すべて表示エンドサイトーシスの現象。
FXm の概念的なシンプルさのバランスが取れて議定書、ナノメートルの PDMS の粗さやミクロ室高さの凹凸を補正するためのバック グラウンド補正などにより解決されている実験の問題の結論として、柱間 PDMS の天井。ただし、蛍光メジウムを閉じ込めるに近い流体チャンバーの使用によって効果的な表面の細胞接着、または中央から相馬を除外する必要を下げるサポート柱の必要性のようないくつかの特定の制約高分解能観察にアクセス可能なセルの領域を制限する最高の明快さと神経の拡張を観察する商工会議所。このメソッドの 1 つの可能な進化は光一で交換するこの物理的な監禁をなくすでしょう。光シート顕微鏡の新展開が有利と組み合わせる FXm、将来的に。

細胞容積の正確な知識は、セルの大きさの恒常性単一 celled の微生物1とより一般的に細胞分裂の細胞2の問題によって駆動される最後の年に増加した注目を集めています。しかし、細胞容積の質問は分裂細胞、ニューロンが、典型的な例を構成するものにも関連します。
ボリュームは確かに不可逆的に電気的活動 (ミリ秒) 3に関連付けられている一時的な軸索の変形から、神経の人生のスケールが異なると時間点で生理学的および病理学的イベントの重要な署名神経変性疾患 (年間人間の) 4の段階で無症候性神経腫脹発生。しかし、最大のボリューム変更に数日または神経成長中 (考慮される有機体) によって数週間の中間の時間スケールで発生します。ニューロンの拡張と複雑な形態を発生させる倍数問題、その中でセルのサイズの規則。軸索の長さと直径規制実にきっちりと生体内で、各神経タイプ5,6に固有の値です。
これらの問題に対処するため生体内で、複雑な簡単な方法で対処できます体外。その目的の容積測定に専用の高速メソッド十分成長ダイナミクス (すなわち分の時間スケールで) と互換性のある時間または数日間の観察に従うことが必要です。複数の方法は細胞容積体外への直接的または間接的なアクセスを提供するために長年にわたって開発されています。共焦点イメージングからセルの再構成は、それらの 1 つが、このメソッドは約 500 nm 7の限られた軸の解像度を見せながら光にラベリング反復暴露を意味します。これらの 2 つの最後の欠点は、格子ライト シート顕微鏡8をというより高度な最近のメソッドによって克服部分的に注意してください。この走査法はゆっくりと退屈な本質が原子間力顕微鏡は使用される9にしました。さらに、それでセルは、物理的な接触はニューロンの10の極端な柔らかさを考慮した計測と干渉する可能性があります。別のセルタイプを11の不十分な拡張接着細胞ニューロンのようなインピー ダンスまたは共鳴を用いた間接的手法が採用されています。
最も有望な方法の一つは、蛍光色素で満ちていた近い区域の細胞の排除体積の測定に基づいています。蛍光方式 (FXm) ラベル、必要ないとその原理はシンプルで、高速、長期的潜在的サブ光軸の解像度を持つ細胞集団の光イメージングに適しています。いくつかノイズの源を制限するこの究極の解像度がより正確に、z の解像度はカメラのダイナミック レンジで割った値 (すなわち細胞に欠けている地域の) 培養室で最大蛍光強度に依存します。このメソッドは、移行する付着性のセル12の量に従うまたは徹底的に13に記載されている、哺乳類細胞の有糸分裂の間の体積変化を研究する非常に強力なされています。しかし、ニューロンは fxm サブ ミクロ プロセスに彼らの広範な分枝を考慮した方法論的課題を構成します。
高精度ボリュームと神経の枝と成長円錐のような神経細胞の成長に関与する動的構造体の高さにアクセスする滑らかな FXm チャンバーの作製につながる方法をご紹介します。
部屋軸の解像度を最適化するために測定するオブジェクトより同じような高さが必要です。したがって、3 つの異なる高さの中央測定室によって特徴付けられるさまざまな FXm デバイスを考案しました。神経突起の測定に、薄 (3 μ m の高さ) を専用: この低い高さ除く相馬近く 15 μ m の高い中間チャンバー内に残る。厚い中央室 (10 と 12 μ m) が全体の細胞の成長に十分に高いです。デバイスには、中央の部屋のどちら側に位置する 2 つの貯水池も含まれています。4 つの注入穴 (IH) ため実装されています、次のように示される: 入口と出口、チップに細胞懸濁液を紹介し、他の 2 つは、貯水池をフィードに対しサービスします。
我々 は知られているジオメトリのフォトレジスト構造を使用した高さ測定の最初の試作した校正 coverslips あります。接着のマイクロ パターンに無料成長ニューロン、しかしまた形態学的制約付きニューロン、イメージしています。

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>To perform DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 mask aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 photolithography</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Mask aligner</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Photolithography associated to DRIE</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ヘレウス マルチフュージ X1R</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター 37 &deg;C 5% CO2</td><td>パナソニック</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 インキュベーター</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS オーブン 65 から 80 °;C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メカニカルプロファイラー</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M スタイラスプロファイラー</td> 光学プロファイラー <td></td></tr><tr><td></td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>真空乾燥器</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>直径 200 mm</td></tr><tr><td>超音波バスソニケーター</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>バスの容量:0.8リットル</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>スチュアート SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>補足データ</td></tr><tr><td>Su8 マスク 1</td><td></td><td></td><td>補足データ</td></tr><tr><td>Su8 マスク 2</td><td></td><td></td><td>補足データ</td></tr><tr><td>Su8 マスク 3</td><td></td><td></td><td>補足データ</td></tr><tr><td>S1805 キャリブレーション</td><td></td><td></td>ストライプ <td>補足データ</td></tr><tr><td><ストロング>スモールラボ機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mmホールパンチャー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>29002519 (米国参照)</td><td></td></tr><tr><td>メスまたはカミソリの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9インチ ステンレス製フラットスパチュラ スプーン付き</td><td>VWR インターナショナル</td><td>82027-532</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>を離型するにはトップリップウェーハハンドリング</td><td>VWRインターナショナル</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>湾曲ピンセット</td><td>FST</td><td>デュモン#7鉗子-標準/デュモクセル</td><td>ガラスカバースリップを操作するには</td></tr><tr><td><-strong>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mmガラスカバースリップ</td><td></td><td>VWR631-0127</td><td></td></tr><tr><td>フォトレジストと現像剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518ポジティブフォトレジスト</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>DRIEプロセス前、シックネス1.8 &micro;m</td></tr><tr><td>AZ 351B 開発者</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>ポジを開発するには AZ 1518 フォトレジスト</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td> SU-8 2050 MicroChem <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA 開発者</td><td>Technic</td><td></td><td>SU-8 ネガ フォトレジストを開発するには</td></tr><tr><td>Microposit S1805 レジスト</td><td>Chimie技術サービス</td><td></td><td>ポジフォトレジストは、0.5&microを得るために使用されます。m 高構造</td></tr><tr><td>MF 26A 開発者</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>ポジを開発するには S1805 フォトレジスト</td></tr><tr><td><ストロング>ラボ消耗品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てプラスチックピペット 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 ペトリ皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>透明なスコッチテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正方形はVWR</td><td></td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>プラスチックパラフィンfilm</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-メタクリロキシプロピル)トリクロロシラン</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMSおよび硬化剤シルガード184をワイプします</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>ポリオルニチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-メタクリロキシプロピル-トリメトキシシラン</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML(</td><td>C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン 10kW と Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>488 nm での吸収</td></tr><tr><td>デキストラン 10kW と Alexa647 LifeTechnologies と結合</td><td>- ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>647 nm</td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies で吸収</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>LifeTechnologies - サーモフィッシャー</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - サーモフィッシャー</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - サーモフィッシャー</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies -ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まない神経基礎</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab for background normalization</td><td>Quantacell</td><td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>特定のROIを選択するには画像解析</td></tr><tr><td>ルーチン</td><td>ImageJ</td><td></td><td>補足データ</td></tr><tr><td>ルーチン</td><td>Matlab</td><td></td><td>補足データ</td></tr></tbody></table>

高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

ボリュームは、異なるタイム スケールでニューロンの生理学的および病理学的特性に関する重要なパラメーターです。ニューロンはその拡張区分された形態に関する非常にユニークなセルであり、したがって体積測定のためのいくつかの方法論的課題を上げます。生体外で神経成長の特定のケースで選択した方法論は分からに時間または数日間の時間スケールでの全視野観察と組み合わせてサブ ミクロの軸解像度を含める必要があります。共焦点レーザー顕微鏡、電気ベースの測定あるいは原子間力顕微鏡を用いた細胞形状復元のような他の方法とは異なり最近開発された蛍光方式 (FXm) これらの課題を満たすために可能性があります。しかし、神経細胞の高解像度 FXm の実装をその原理でシンプルながら、複数の調整と専用の方法論が必要です。蛍光除外、低粗度多区画マイクロ流体デバイス、そして神経のローカル ボリュームの生体外の測定を達成するために微細の組み合わせに基づいてメソッドをご紹介します。デバイスの高解像度では、神経突起 (突起) のローカル ボリュームと成長円錐 (GCs) など、神経細胞の成長に関与するいくつかの特定の構造の量を測定することができました。

図 1 aのイメージによって作製セクション 1 と 2 で説明されているプロセスの結果を示す-1 bと図 1の曲線。図 1の表には、PDMS チップ、すなわち中央と 20 μ m 高次中間室の 2 つの異なる代表的なエリアの粗さの値が表示されます。SU 8 フォトレジストの代わりにエッチングの Si ウェハを使用して、約 7 倍の粗さの減少が得られました。その後、FXm は最初、10 μ m の高い商工会議所内知られているジオメトリ (図 2 a) のフォトレジスト ストライプに適用されました。画像処理と強度高さ変換後 (図 2 bのグラフを参照)、このストライプ (図 2) に沿って 2 次元断面に対して FXm プロファイル提供希望の高さプロファイル (図 2 D)。図 2 Dは、機械的形状測定と FXm メソッドを使用して取得したプロファイルの比較を示しています。エッジと高原の値を含め、これらのプロファイルが非常に似ている方法を検証します。FXm データの散乱が、さらに図 3および図 4、評価法の究極的な解決の代表ではないことに注意してくださいが、低強度からの結果が非常に弱いの可能な効果を避けるために採用GFP チャネルでのフォトレジストの自家蛍光。
その後、3 μ m と 10 μ m 高室 (図 3) の神経突起を見ました。バック グラウンド ノイズの標準偏差は約 18 nm 高さの変換とバック グラウンドの補正に強度の後。この値はシリコン表面にキャストした PDMS 表面の物理的な粗さよりわずかに高い (12 nm、図 1の表を参照) PDMS で測定された粗さが SU 8 金型から得られたよりもはるかに低いが。これらの結果は、シリコンウェハーに井戸を掘削するのではなく、柱をキャストする SU 8 フォトレジストに穴が開いての付加価値を強調表示します。このような低値は、図 3 aで表示されるなどボリュームの非常に鮮明な画像とノイズ比の高い信号をことができます。このようなイメージから取得できるデータの例として我々 は 1.6 μ m (すなわち10 ピクセル) ワイド神経突起のボリュームを計算 (図 3 bのグラフを参照してください) をスライスします。約 400 の平均神経突起の高さの値を与える最初の近似でこれらのデータの線形フィットを使用して nm、例えば軸索直径の 500 nm、10 日脳梁5内の古い子犬と比較します。我々 はまた接着における出力直列 2 μ m と 30 μ m の長さの 6 μ m の広い縞から成るのと FXm を組み合わせます。私たちの目的は神経突起の幅がその 3次元形状に及ぼす影響を研究するだった。図 3は、10 μ m の高い部屋で得られた全体のニューロン イメージの偽色の 3 D の表現を示しています。最大のストライプの極みに、相馬があるに対し、神経突起は 2 μ m と 6 μ m の広い縞、広がっています。3 つの異なる断面の高さプロファイルを描いた。図 3 aに表示されるグラフとの一貫性、表面 (図 3 D) 神経突起幅断面増加に統合されています。
成長円錐 (GC) の立体構造にも着目。図 4A Bプロファイルが表示されます 2 つ異なる GC 3 μ m の高い部屋で得られた彼らの分岐部分の構造を強調します。さらに、我々 は 12 μ m の高い部屋で Gc がボリュームのダイナミクスに従うタイムラプス実験を行った。図 4には、数十分の時間スケール内で指定された GC の再活性化と縮小のサイクルが表示されます。Lifeact GFP マウスの使用のおかげで成長円錐に GFP の発光波長ローカライズされた (510 nm) のアクチンの高濃度から。波長で特定されるサーフェスは 647 でデキストラン発光波長にわたって統合に使用された GC の体積を計算する nm。図 4は最終的に約 6 μ m3の値を中心とした 3 つの異なるニューロンに異なる時点および場所で GC のボリュームの分布を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> 図 1: FXm PDMS チャンバ。(A)最終型につながる微細加工の 4 つの主な手順のスキーム。入口、出口、貯水池の場所が示されます。バーをスケール: 1 mm。(B)光学測定機を用いて PDMS FXm 室の画像。この画像は、10 μ m 高柱の 3 つの行と高さは 20、50、90 μ m の中間室を含む中央の部屋を示します。スケール バー: 500 μ m。 (C) (B) に描かれた 2 本の破線に沿ってチップの断面図。イエロー/ゴールド: 青の柱に沿って断面: 断面柱の間。(D) PDMS の粗さの値は実測 50 × 成形シリコンと 20 μ m 高 SU 8 中間室 50 μ m2のエリアを意味する (これらの区域の場所の矢印を参照)。平均値は、3 つの異なる分野の測定から得られました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> 図 2: FXm 用いたフォトレジスト ストライプの興味の対象としての校正します。(A) 10 μ m の高い部屋で撮影した GFP 蛍光画像 10,000 MW デキストラン 488 で吸収でいっぱい nm 1 mg/mL で。(B: 背景、p: 柱)。乾燥 40 X ナ 0.8 目的の観察。スケール バー: 2 色の四角形の (A) に表示されている青い点線のレベルで得られる A. (C)蛍光強度分布に示すようにフォトレジストを渡る平均強度から得られる(B)線形校正法 50 μ m。ストライプ (0.45 μ m 高ポジ型フォトレジスト)。(D) (B) (青い点) のデータの高さの転換へ強度後機械的測定機 (黒い点) や FXm から得られるプロファイルの比較。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> 図 3: 神経突起ボリューム イメージングします。(A)の突起が次に 15 μ m の中間室にある相馬から中央の 3 μ m 高の室に拡張します。488 で吸収 10,000 MW デキストランを用いてイメージング nm と 40 X、NA 0.8 乾燥目的。はめ込み式バック グラウンド低減ルーチンの使用は 2 つの突起をハイライトした後を取得し、右側のグラフをプロットすることを選択。スケール バー: 30 μ m。( B) (A) に示す 22 プロファイル (10 ピクセル、すなわち1.6 μ m「神経突起スライス」の上平均) から得られた神経突起幅の関数として突起スライス ・ ボリューム。実線は、原点を通る傾き 0.4 μ m の線形フィットを表します。(C)接着ストライプにパターン化されたニューロンの偽色のイメージから成って連続 2 μ m と 6 μ m の広い切り株 (白で表されます)。10,000 MW デキストラン 647 で吸収で満ちていた 10 μ m の高い区域で測定を行い nm と 40 x NA を用いた 0.8 乾燥目的。(D)色の破線 (C) に示すように、同じ維持に対応する高さプロファイルは色コードです。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> 図 4: 静的および動的成長円錐イメージングします。(B)成長円錐の高さプロファイル強度関連画像に表示される黄色の線に沿って高さ変換後 3 μ m の高い商工会議所で得られました。488 で吸収 10,000 MW デキストランと塗りつぶしを用いて観測 nm と 40 X、NA 0.8 乾燥目的。(C) 12 μ m の高い部屋で全体のニューロン イメージング 10,000 MW デキストラン 647 で吸収でいっぱい nm。観測は、2 つの蛍光チャネルで行われている: GFP 成長円錐 (黄色破線)、および CY5 蛍光除外から GC の体積を計算します。黄色破線で含まれている表面は、GC の体積を計算する使用されました。グラフでは、2 つの代表的な異なる時点で GFP および cy5 の組合せの両方のチャンネルで GC 量の時間、および関連付けられている形態上の変化を示します。40 x NA を使用してすべてのデータを取得した 0.8 乾燥目的すべての 3 分のスケール バー: 10 μ m.<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>1:8 μ m の層をマスクします。</td>
			<td>マスク 2:30 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 2000 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>照射エネルギー量</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 高さ 12 μ m の中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 20、50、90 μ m。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>マスク 1:10 μ m の層</td>
			<td>マスク 2:30 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 1500 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>照射エネルギー量</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 10 μ m の高さの中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 20、50、90 μ m。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>マスク 1:12 μ m の層</td>
			<td>マスク 2:32 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
			<td>30 s 2500 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 5 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光時間</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 5 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>3 分</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: 3 μ m の高さの中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 18、50、90 μ m。
補足データ1: masks_neuron_volume_chips.tiff。(DRIE マスクとマスク 1-3) PDMS のデバイスを作製するためのマスクの模式図。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足データ 2:ファイル"masks_neuron_volume_chips.dxf"。電子ファイル DRIE マスクとマスク 1-3 を作製することができます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足資料 3: 「Mask_Photoresist stripes.dxf」。電子ファイルは、フォトレジストのストライプのフォトリソグラフィーに使用されるマスクを作製することができます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足資料 4: conversion_mattotiff.m ファイル<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
補足資料 5: importfilevol.m ファイル<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

ボリュームは、細胞の生理学的および病理学的特徴に関する重要なパラメーターです。神経突起および暗黙の神経成長の動的構造の分析に必要なサブ ミクロ軸分解能生体外で神経ボリュームの全視野計測を可能にする蛍光排除法について述べる。

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

この手順の全体的な目標は、ニューロンの成長に関与する動的構造の神経突起の分析に必要なサブマイクロメートルの軸方向の分解能で、in vitroニューロン体積の全フィールド測定を可能にすることです。この方法は、非成長または軸索変性中の補助スケールでの体積変化のダイナミクスに関する細胞神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、サブマイクロメートルの軸分解能とフルフィット観察、および時間または日の時間スケールを組み合わせることで提供されることです。手順を開始するには、PDMSブロックにイソプロパノールを注いで化学フードの下で離型します。次に、フードのステンレス製ベンチに置きます。シリコンウェーハの周りをカットし、PDMSレプリカを型取りします。次に、チップの周りを切り取り、メスまたはカミソリの刃を使用して2ミリメートルのマージンを残します。直径1.5mmのパンチャーをしっかりと押し込んで入口を打ち抜き、作動させることで入口の穴を切って彫ります。液体が注入されるチップの4つの専用ゾーンで同じことを行います。その後、微細構造側の粘着テープを貼り付けて剥がしてチップをクリーニングします。両側にイソプロパノールを振りかけます。その後、エアブローガンを使用して加圧窒素でチップを乾燥させます。この手順では、各カバースリップをクリーンルーム環境にあるスピンコーターに置きます。ポジ型フォトレジストを一滴垂らしてカバーガラスの約75%を覆い、4000rpmで30秒間スピンコートして、最終厚さ0.45マイクロメートルに到達します。カバーガラスを表面温度115°Cのホットプレートに1分間置きます。マスクアライナーを使用して、製造パラメータに従って、専用のマスクを通じて各カバースリップを435ナノメートルの波長で露光します。次に、2つのガラス結晶化皿を準備し、1つは希釈せずに現像液を含み、もう1つは脱イオン水を含む。カバースリップを1枚ずつ現像液に浸し、結晶化皿を連続的かつ穏やかに攪拌しながら1分間浸します。次に、ウェーハを脱イオン水に約5秒間浸します。ウェーハを吸収紙に移し、エアブローガンを使用して加圧窒素で乾燥させます。PDMSチップと、PDMSチップを接着するガラス皿の両方をプラズマチャンバーに配置して、表面活性化します。次に、長方形の厚い顕微鏡スライドガラスに水滴を堆積させ、毛細管現象によってカバーガラスをスライドガラスに貼り付けます。顕微鏡で、スライドガラスの後部にあるフォトレジストストライプの位置をマークします。パターン化されたガラスカバースリップをマスクアライナーのマスクホルダーに置きます。フォトレジスト参照オブジェクトの中央に付けられたマークを頼りにしてください。光学コントラストを上げるには、PDMSチップの下にシリコンウェーハを配置します。シリコンウェーハは、アライメントプロセス中、チャックにしっかりと取り付けられたままにする必要があります。次に、PDMSチップをマスクアライナーのモバイル基板ホルダーにセットします。その後、チャックを十分に持ち上げて、チップとカバーガラス上に配置されたフォトレジストストライプの配列の両方を視覚化し、機械的接触の後ろにとどまります。位置合わせを行い、PDMSピラーの表面がガラスカバースリップに接触するまでチャックを持ち上げることにより、チップとカバースリップの間に機械的な接触を実現します。その後、チャックを下げます。チップに貼り合わせたカバースリップをマスクホルダーから取り外します。次に、デバイスを35ミリメートルのペトリ皿に入れ、すべてをオーブンに5〜10分間移して、接着強度を高めます。接着後30分後、PLO溶液を充填した10マイクロリットルのピペットチップを入口に置きます。次に、上に液滴が形成されるまで液体を入れます。出口と貯水池で同じ操作を繰り返します。その後、チップの周りのペトリ皿にPBSを追加します。ペトリ皿をパラフィンフィルムで密封し、室温で最低5時間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの先端コーンを各注入穴に軽く押し込み、余分な液体を吸い上げます。次に、PLOとチップを囲むPBSを培地で交換します。その後、チップを摂氏37度と二酸化炭素5%に調整されたインキュベーターに入れ、ニューロンが播種するまで、最低5時間のインキュベーション時間で行います。この手順では、チップから培地を引き出します。新たに再懸濁した細胞溶液を2〜3マイクロリットル収集し、入口に注入します。すぐにコンセントで同じ操作を繰り返します。各リザーバーにほぼ同量の培地を注入します。顕微鏡でチップをすばやく観察して、細胞の密度を確認します。最適なセル密度の桁は、4本の柱で区切られた正方形の表面内の約5〜10個のセルに相当します。0.5〜1マイクロリットルの細胞懸濁液を注入する手順を繰り返して、標的の細胞密度に到達します。イメージングの場合は、培地をイメージング培地と交換します。次に、チップを落射蛍光顕微鏡の下に置きます。タイムラプス実験の場合、単一画像から複数の連続画像まで細胞の画像を取得します。ここに示されているのは、キャリブレーションフォトレジストストライプとニューロンの代表的な観察結果です。これらのオブジェクトの高倍率の画像と断面が右側に表示されます。代表的な神経突起と高さ3マイクロメートルの中央チャンバーを以下に示します。神経突起スライスの体積は、神経突起の幅の関数として計算できます。そして、これが代表的な成長コーンと高さ3マイクロメートルの中央チャンバーです。それらの下部構造は、約20ナノメートルの光学的バックグラウンドノイズからはっきりと浮かび上がります。生命のタイムラプス観察は、高さ12マイクロメートルのチャンバーに播種されたニューロンを作用させ、成長円錐の縮小と再活性化のサイクルを数十分以内に追跡します。この手順を試みる際には、シリコン泥を製造するための深部イオンエッチング装置を利用できることが重要です。このビデオを見れば、構造化ガラスのカバースリップをPDMSチップに合わせる方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、この手法は3Dでの神経学の定量に再現性よく適用できます。この技術は、薬理学の分野の研究者が、実際の口径を持つさまざまな薬物の効果をすべて閉じた円錐形で探求する道を開きました。一次ニューロンの扱いには、汚染や粉々を避けるために多くの注意が必要であることを忘れないでください。彼らがインキュベーターの外で過ごす時間を制限するために、培地を交換するときは常に穏やかで迅速であることを確認してください。

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。...

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます...

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。...

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

このビデオでは、ニューロン小胞が特定の蛍光タンパク質で標識され、その動きを視覚化する方法を示しています。まず、蛍光タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクション剤とインキュベートし、次にニューロンの培養物に導入します。その後、ニューロンの画像を取得して分析し、小胞の動きを追跡します。...

蛍光イメージングによるニューロンの小胞運動の可視化

我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。...

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

ここで単位と血液脳関門脳浮遊セクションを使用して高解像度の画像とマウスの三次元再構成のための顕微鏡ベースのプロトコルを紹介します。このメソッドは、可視化、解析、および BBB...

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

このプロトコルでは、文化し、一次マウス...

プライマリ マウス神経細胞も見逃せません組み立て済みプラスチック製マイクロ流体チップの使用

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。...

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

学ぶ 高解像度ニューロン体積測定法。PDMSマイクロ流体デバイスと蛍光排除法を用いて、サブミクロン軸方向分解能で神経突起の動態構造を解析します。神経成長と変性過程の研究に有用です。

高解像度ボリュームイメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

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