L リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応

この手順の全体的な目標は、有機合成のためのキラル助剤から薬物療法まで幅広い用途を持つ化合物であるキラルアミノアルコールを合成および精製することです。これは、天然アミノ酸、リジンに由来するキラルアミノアルコールへのアクセスを得るためのすべての収量メーターで、1つの部分からなる手順で2つまたは3つの酵素ステップです。この手順の主な利点は、プロトコルの単純さと精製ステップの効率です。

その手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるAurelie Fossey-Jouenneです。ジヒドロキシル化リジン誘導体を合成するには、250 mLの三角フラスコにhepes buffer、l-リジン、アルパキータグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、および塩を加えます。次に、追加する酵素溶液の容量を考慮して、最終容量の10mlまで水を追加します。

デオキシゲナーゼKD-01を最終濃度0.075mg / mlまで加え、反応混合物を室温で300rpmで適切な時間振とうします。.混合後、反応混合物10mclを1.5mlのエペンドルフチューブに移します。

次に、アクイアス重炭酸ナトリウム溶液、エタノール、およびエタノール中のDNFB溶液2.5mg /mLを加えます。マイクロチューブを閉じ、溶液を1000rpm、摂氏65度で1時間振とうします。終了したら、ミニ遠心分離機を使用して溶液を落ち着かせます。

反応混合物を10mclの1Mヒドロクロリン酸で急冷します。溶液をボルテックスし、ミニ遠心分離機を使用して溶液を沈殿させます。1mlのルアーシリンジを使用して、直径4mmの非滅菌シリンジフィルターで混合物をろ過し、0.22mcmの注ぐサイズの親水性ポリフッ化ビニリデンメンブレンを使用します。

その後、誘導体化した反応混合物サンプルをHPLC装置に入れます。C-18カラムに10mclを注入します UV検出を使用して、400ナノメートルで製品を分析します。反応モニタリングで反応が完了したことが示されたら、アルファキータグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、およびより多くの塩をフラスコに加えます。

デオキシゲナーゼKD-02を最終濃度0.5mg/mLに添加し、初期反応量を用いて計算します。反応混合物を室温で300rpmで18時間振とうします。

反応モニタリングで反応が完了したことが示されたら、反応混合物に100mclの100ミリモルDTTを添加します。さらに100mclの100ミリモルPLP。精製したデカルボキシラーゼDccpinを約最終濃度0.5mg / mlで追加します。.

初期反応量を用いて算出。次に、反応混合物を室温で300rpmで18時間振とうします。反応が完了したら、フラスコを氷浴に入れて混合物を冷却します。

0.25mlの6モルhclを慎重に加え、添加中に冷反応混合物を静かに振ってください。次に、ガラス製の牧草地ピペットを使用して、acdic混合物を50mlの円錐形の底部遠心分離チューブに移します。混合物を重力の1.680倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を250mlの丸底フラスコに移します。次に、ペレットが入った遠心分離チューブに10mlの脱イオン水を加えます。渦巻きしてペレットを再懸濁します。

サンプルを遠心分離した後、上清を最初の上清を含む丸底フラスコに移します。フラスコから液体窒素に浮かび上がり、常に手で渦巻くことにより、収集した上清を凍結します。フラスコをすぐにベンチトップマニホールド凍結乾燥機に移して、材料の解凍を防ぎます。

凍結乾燥プロセスが完了したら、フラスコを凍結乾燥機から取り出し、精製手順を実行します。モノヒドロキシルL-リジンの生体触媒脱炭酸のために、S RhumerentiumからのDCは、すべてのモノヒドロキシリジンに対して活性を示しました。ここで、対応するキラルヒドロキシジアミンの3つおよび5つの誘導体に対して観察された最良の変換

予想通り、Dccpinは4R-ヒドロキシ-L-リジン2の脱炭酸に最も適していることが判明しました。標準的な反応条件下では、DCcpinによる3S-ヒドロキシ-L-リジン1の脱カルボキシル化対応物5への変換は低かった。また、5R-ヒドロキシ-L-リジンに対する活性は観察されませんでした。

デヒドロキシ-L-リジンの生体触媒的脱炭酸では、標準反応条件下で3R、4R、ジヒドロキシ-L-リジン3のみが対応するジヒドロキシ-ジアミン7に定量的に変換されました。45-ジヒドロキシ-L-リジン8の変換は中程度でしたが、酵素負荷量を増やすことで改善されました。どちらのPLP-DCも35-ジヒドロキシ-L-リジン9に対して活性がありませんでした。

HPLCモニタリングによって決定された定量的変換を示す酵素カスケード反応は、成功裏にスケールアップされました。アミノアルコールは、複雑な酵素反応混合物と優れた化合物から精製され、NMRによって特徴付けられました。この酵素カスケード合成とその後の精製をマスターすると、適切に準備されていれば48時間で行うことができます。

この手順を試みている間、反応メジャーの良好な酸素化が二酸素化反応に不可欠であることを覚えておくことが重要です。また、ジカルボキシダーゼを添加する前にすべてのリジンが消費されることを確認するための慎重なモニタリングも行います。このプロトコルの主な欠点は、ジオキシゲナーゼおよびデカルボキシラーゼ酵素の助成範囲が限られていることです。

それにもかかわらず、アミノ酸からのさまざまなアミノアルコールのバイオチャタリティック合成は、異なる酵素セットを使用して調査することができます。このビデオを見れば、酵素カスケード反応の調製方法と、複雑な反応混合物からアミノアルコールを精製する方法を十分に理解できるはずです。DNFBでの作業は危険であり、個人用保護具の着用やヒュームフードでの反応の準備などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。