Name: L リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶL-リジンから酵素連鎖反応による光学活性アミノアルコールの合成と精製法。有機合成や医薬品開発への応用が可能な効率的なバイオ触媒プロトコルを解説します。

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著者は、テクニカル サポートのペギー Sirvain クリスティン Pellé とアラン ・ ペレ ヴェロニク Berardinis 有意義な議論のためにありがとうございます。

1. 酵素製剤
<ol><li>表現し、上記26として蛋白質を浄化します。 注: 次の最終濃度で組換えタンパク質が得られた: Catenulispora acidiphila、UniProtKB ID から αKAO: C7QJ42 (KDO1)、1.35 mg/mL;C. pinensis、UniProtKB ID から αKAO: C7PLM6 (KDO2)、2.29 mg/mL;S. rumirantium、UniProtKB ID から PLP Dc: O50657 (LDC下さい Srum) 12.44 mg/mL で合計酵素と無細胞抽出C. pinensis、UniProtKB ID から PLP DC: C7PLM7 (DCCpin) 2.62 mg/mL。</li>
</ol>2. 溶液の調製
注: 下すべてのソリューションは、脱イオン水用意しています。
<ol><li>HEPES 緩衝液, pH 7.5; の 1 M を準備します。水酸化ナトリウムの 5 m を調整します。 注: pH 調整手順中には、保護手袋、防護服、目の保護と顔の保護 (P280) を着用します。(P305、P351、P338) の目に接触した場合、いくつかの分削除コンタクト可能であれば水で慎重をすすいでください。洗浄を続けるし、すぐに毒センターや医師 (P310) を呼び出します。P コード予防声明を参照 (クラスやカテゴリの危険性を参照してください、例えばpubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/)。</li>
	<li>L-リジン 100 mM 100 mM (5S) の準備 - ヒドロキシ - L-リジン、150 mM の α-ケトグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム 100 mM、10 mM アンモニウム鉄 (ii) 六水和物硫酸 (モール塩)、100 mM ピリドキサール-5-リン酸 (PLP)、100 mM ジチオトレイトール (DTT)。</li>
	<li>1 M、2 M と 6 M 塩酸 (HCl) 37 %hcl 溶液 (approximatively 12 M 溶液) の 2.1 で説明したものと同じ安全手順を準備します。 注: α-ケトグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、アンモニウム鉄 (ii) の硫酸塩の水和物のソリューション上で行わなければ新鮮な使用の日。リジン ソリューションは、室温で数ヶ月保存できます。PLP ソリューションは 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。DTT ソリューションは-20 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
</ol>3. 分析スケール反応
<ol><li>(5R) の脱炭酸反応法の開発 - ヒドロキシ - L-リジン<ol>
<li>HEPES バッファー pH 7.5 の 1 M 溶液 11 μ L を追加 (最終濃度 50 mM) 2 mL マイクロ チューブに。100 mM (5S) の 22 μ L を追加し、- ヒドロキシ - L-リジン (最終濃度 10 mM)、2.2 μ L 100 mM PLP の (最終濃度 1 mM)、および 100 mM DTT の 2.2 μ L (最終濃度 1 mM)。 注: LDC下さい Srumと反応、場合地デジ追加必要はありません。</li>
		<li>精製 PLP DC を追加 (最終濃度 0.1 mg/mL)。H2O の 220 μ L の最終巻を完了します。</li>
		<li>常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。 注: はオープンエアのオープンふた付き反応混合物を振動反応メディアの良い酸素を保証します。したがって、反応液中の酸素をバブルに必要はありません。</li>
		<li>手順 6 で説明した反応モニタリング手順に従って分析する反応液の 10 μ L を収集します。サンプルは好ましく誘導体し、サンプリング後に直接分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>触媒 αKAO 触媒 PLP DC による脱炭酸と水酸化一歩を組み合わせた酵素カスケード反応法の開発<ol>
<li>HEPES バッファー pH 7.5 の 1 M の 11 μ L を追加 (最終濃度 50 mM) 2 mL マイクロ チューブに。その後、α-ケトグルタル酸の 150 mM の 22 μ L を追加 (最終濃度 15 mM)、5.5 μ L アスコルビン酸ナトリウムの 100 mM の (最終濃度 2.5 mM)、22 μ L モールの 10 mm の塩 (最終濃度 1 mM) と L リジンの 100 mM の 22 μ L (最終濃度 10 mM)。</li>
		<li>H2O 220 μ L、3.2.3 の手順で追加する酵素液の量を考慮しての最終巻の完了します。</li>
		<li>追加対象の位置選択性によると必要な精製 αKAO 酵素: L-リジンの位置 C-4 のポジション C-3 または KDO2 水酸化の KDO1。精製酵素の最終濃度 (0.05 0.5 mg/mL) 3 h approximatively の完全な変換を有効にするために決定されました。</li>
		<li>常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。</li>
		<li>PLP の 100 mM の 2.2 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM) と DTT の 100 mM の 2.2 μ L (終濃度 〜 1 mM)。 注: LDC下さい Srumと反応、場合地デジ追加必要はありません。</li>
		<li>18 h: LDC の完全な変換を有効濃度に精製 PLP DC を追加下さい Srum 0.1 mg/mL KDO1、DCCpin 0.5 mg/mL のおおよその最終濃度とカスケード反応のためのおおよその最終濃度で、KDO2 連鎖反応。</li>
		<li>反応混合物を室温で 18 時間 300 rpm でオープンエアのオープンふた付き振る。</li>
		<li>3.1.4 の手順と監視作業を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ΑKAOs によって触媒 PLP DC による脱炭酸を触媒に用いる 2 つのヒドロキシル化手順を組み合わせること酵素連鎖反応法の開発<ol>
<li>3.2.1-3.2.2 の手順を実行します。</li>
		<li>最終濃度 0.05 mg/mL に KDO1 を追加します。常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に KDO2 を追加します。18 h の 300 の rpm で、オープンエアで開く蓋と、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>3.2.5 の手順を実行します。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に精製 PLP DC DCCpinを追加します。18 h の 300 の rpm で、オープンエアで開く蓋と、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>3.1.4 の手順と監視作業を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. セミ分取鍋生体触媒反応
注: 酵素反応はオープンエアの 250 mL ガラス 10 ml 容量の三角フラスコに L-リジンの 0.1 モルで遂行されます。
<ol><li>Monohydroxylated 誘導体の合成<ol>
<li>1 M HEPES 緩衝液, pH 7.5 の 0.5 mL を追加 (最終濃度 50 mM) をフラスコに加えて。100 mM L リジンの 1 mL を加えます (最終濃度 10 mM)、150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。</li>
		<li>H2O 4.1.3 の手順で追加する酵素液の量を考慮し、10 mL の最終巻の完了します。</li>
		<li>追加対象の位置選択性によると必要な精製 αKAO 酵素: 最終濃度 0.5 mg/mL 位置 C-4 L リジンのための最終的な集中で C-3 または KDO2 の位置に水酸化 0.075 mg/mL で KDO1。精製酵素の最終的な集中は approximatively 3 h の完全な変換を有効にすると判断されました。</li>
		<li>適切な期間の反応混合物を室温 300 rpm で横に振る。反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 の手順を実行) 完了した水酸化反応で示された 4.1.5 をステップに進みます。典型的な反応時間は、3 h です。</li>
		<li>ΑKAO 反応混合物に 100 mM PLP の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)。次に、100 mM DTT の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)、LDC下さい Srumを使用する場合を除きます。</li>
		<li>精製 PLP DC を追加: LDC下さい Srum 0.05 mg/mL の KDO1 と KDO2 と 0.5 mg/mL のカスケード反応のためのおおよその最終濃度で DCCpinカスケード反応のためのおおよその最終濃度で。</li>
		<li>18 h のための 300 の rpm、室温で反応混合物を振るし、直接 4.3 の手順で説明されている手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dihydroxylated 誘導体の合成<ol>
<li>1 M HEPES 緩衝液, pH 7.5 の 0.5 mL を追加 (最終濃度 50 mM)、100 mm L リジン 1 mL (最終濃度 10 mM)、150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。H2O 4.2.2 の手順で追加する酵素液の量を考慮し、10 mL の最終巻の完了します。</li>
		<li>0.075 mg/mL の最終的な集中に KDO1 を追加します。適切な期間のための 300 の rpm で、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>完成した水酸化反応を示されたとき反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 を参照)、4.2.5 のステップへ進みます。典型的な反応時間は、3 h です。</li>
		<li>150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL を追加 (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に KDO2 を追加します。反応混合物を室温 18 h 300 rpm で振る。</li>
		<li>完成したジヒドロキシ化反応を示されたとき反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 を参照)、4.2.7 ステップへ進みます。典型的な反応時間は、18 h です。</li>
		<li>DTT の 100 mM の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)、LDC下さい Srumを使用する場合を除きます。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に精製の DCCpinを追加します。</li>
		<li>反応混合物を室温 18 h 300 rpm で振る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>焼入<ol>
<li>反応混合物を氷浴で三角フラスコ 250 mL ガラスを配置することによって冷やします。</li>
		<li>Approximatively 1 分、0.25 mL 手動でゆっくり冷却した反応混合物を揺することによって 6 M 塩酸の上、慎重に追加します。2.1 の手順で説明したものと同じ安全指示に従います。</li>
		<li>50 mL コニカル底遠心分離機に酸性混合管、電球、パスツール ピペット装備ガラスを使用して転送 1,680 x g と 15 分のための 4 ° C で遠心分離します。</li>
		<li>上清を撤回し、250 mL の丸底フラスコに脇を維持します。</li>
		<li>ペレットを含む円錐底遠心管に 10 mL の脱イオン水を追加します。再ペレットを中断する渦。</li>
		<li>1,680 × g で遠心分離機、4 ° C、15 分。</li>
		<li>上清を撤回し、最初の上澄み (ステップ 4.3.4) を含む 250 mL の丸底フラスコに追加。</li>
		<li>フラスコの液体窒素に浸漬による旋回、一定の手で収集した培養上清を凍結し、ベンチトップ マニホールド材料が融解するを防ぐために凍結乾燥機にすぐにフラスコを転送します。</li>
		<li>(一晩) は凍結乾燥のプロセスが完了した後、凍結乾燥機からフラスコを削除します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 粗酵素反応混合物からアミノ アルコールの精製
<ol><li>イオン交換樹脂<ol>
<li>水溶液中の 0.1 m HCl (approximatively 4 mL) の最小限のフリーズドライ製品を溶解固体粒子が肉眼に目に見えるされなくなるまで。</li>
		<li>スルホン酸の機能グループの陽イオン交換樹脂、ガラス列 (20 x 250 mm) での 200-400 メッシュを 0.1 に続いて 1 M HCl (4 列ボリューム) を大気圧下で溶出条件 M HCl (4 列ボリューム; 列ボリューム 10 mL を =)。</li>
		<li>1,000 μ L マイクロ ピペットを使用してからす柱の壁にガレージの上部に慎重にサンプルをロードします。原油製品に含まれる円錐形底遠心チューブをすすぎ 3 回 1 mL 0.1 M HCl 水溶液あたりの洗浄し、同じ方法で列に結果リンス ボリュームをロードします。</li>
		<li>非線型と溶出グラデーション: 4 列量 0.1 M HCl、水、5% NH4ああ、4 列の量 10% NH4ああ、15% NH4ああ、20% NH4オハイオの 4 列のボリュームの 4 列のボリュームの 4 列のボリュームの 4 列ボリューム、25% NH4オハイオ州および 28% NH4オハイオ州の最後に 4 列のボリュームの 4 列ボリューム。</li>
		<li>高速液体クロマトグラフィーによる精製を監視 (手順 6 を参照)。</li>
		<li>化合物 (NH4ああ 20 28%) を含有する画分をプール、4.3.8-4.3.9 の手順で説明するように凍結乾燥します。 注: イオン交換カラムは HCl の 1 M の 50 mL の溶出によって再調整によって溶出水 (50 mL approximatively) の中和に脱イオン水で溶出後再利用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>H3PO4イソブチレン (20 μ L/mL) 2 ml approximatively フリーズドライ化合物を可溶化します。</li>
		<li>抽出マニホールド上場所混在モード陽イオン交換 SPE 6 mL のカートリッジは、水ポンプに接続されています。マニホールドによって提供される減圧下でメタノール 4 mL を描画することによって、カートリッジを状態します。PO4イソブチレン (20 μ L/mL) H34 mL を描画することによってカートリッジを平衡します。</li>
		<li>上部からす柱の壁に樹脂の 1,000 μ L マイクロ ピペットを使用してカートリッジの上にサンプルをロードし、H3PO4イソブチレン (20 μ L/mL) 洗浄あたり 0.75 mL で 3 回この商品を含むバイアルをすすいでください。同じ方法で列に結果のリンス ボリュームをロードします。</li>
		<li>減圧、マニホールド、2% の 4 mL によって提供される溶出カートリッジを洗って HCOOH 4 ml の水し、水の中。NH4水のオハイオの勾配で溶出 (4% NH4オハイオ州から始まって、それぞれの溶出の 4 mL: 10%、15%、15%、20%、28%)。</li>
		<li>手順 6 で説明したプロトコルを監視する反応によると各分画を分析することによって高速液体クロマトグラフィーによる精製を監視します。紫外線 (UV) のクロマト グラムによると純粋な必要な誘導を含むすべての画分を維持し、5.2.6 をステップに進みます。</li>
		<li>プール目的を含む分数 100 mL の丸底フラスコに化合物、水、分数を含むチューブを洗浄、リンス ボリュームを 100 mL に追加丸底フラスコです。</li>
		<li>40 ° C でサーモスタットやかんお風呂装備し、10 mbar で真空ポンプに接続して回転蒸発器を用いて減圧下で溶媒を除去します。</li>
		<li>水の最小量の固体を可溶化し、重量を量られた 25 mL の丸底フラスコにソリューションを転送します。リンス水の最小量とフラスコ 25 mL フラスコにリンス ボリュームを追加して、5.2.9 のステップへ進みます。</li>
		<li>精製した製品の重量を量るし、利回りを計算します。</li>
		<li>固体粒子が肉眼に目に見えるされなくなるまで最小 2 M 塩酸の量で精製した製品を溶解し、フリーズドライの手順 4.3.8-4.3.9 で説明したよう。 注: アミノ アルコールは敏感な化合物である、その塩酸塩として保持されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 反応モニタリングや製品の分析
<ol><li>基板および高速液体クロマトグラフィー分析の前に製品の誘導体化 注: 基板や製品は芳香族誘導体の UV クロマトグラフィーによる新規を増やすと誘導体がする必要があります。1-フルオロ-2, 4-ジニトロ (DNFB) を使いました。各サンプルは、直後に誘導体化 HPLC に注入されました。<ol>
<li>酵素反応と移動の 10 μ L を 1.5 mL のマイクロ チューブにかかります。エタノールで NaHCO3水溶液の 0.25 M の 10 μ L、100 μ L のエタノールと DNFB 溶液 2.5 mg/mL の 30 μ L を追加します。</li>
		<li>したマイクロ チューブを閉じて、65 ° c、1,000 rpm で 1 h の結果のソリューションを振る。10 μ L でクエンチ HCl の 1 M。</li>
		<li>1 mL ルアーロック注射器を使用して 0.22 μ m 孔サイズ親水性ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を 4 mm 径の非滅菌シリンジ フィルターをフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アミノ酸の誘導体を分離することができるシステムを使用して酵素反応の監視を実行します。このプロトコルには、ジニトロ (DNB) 発色団グループ27によって誘導体アミノ酸の紫外検出が含まれます。<ol>
<li>C18 と高速液体クロマトグラフィー、トリメチル シリルのエンドキャッピング逆相カラム (5 μ m、3 × 150 mm) が適してください。</li>
		<li>(無段階) 溶離液 B で C18 カラムの平衡 (MeCN + 0.1 %tfa) に溶離液 A (H2O + 0.1 %tfa) 1 mL/min と 35 ° C、15 分 (approximatively 20 列ボリュームに対応する) の流量で。</li>
		<li>誘導体の反応液の 10 μ L を注入 (手順 6.1 参照) 高速液体クロマトグラフィー C18 カラムに。MeCN、0.1 %tfa/H2O および 0.1% の混合物を使用して、線形グラデーションの溶離液として TFA (9 分、温度 35 ° C、70: 30 に比を 30: 70 の流れ 1 mL/分)。</li>
		<li>UV 検出 400 で設定を使用して、溶出クロマト グラフ列に製品を分析する nm。ドラムン ベース-リジンには約 6.5 分、水酸化ドラムン ベース-リジン約 5.5 分、dihydroxylated ドラムン ベース-リジン約 4.2 分、ドラムン ベース-aminodiol 約 5.3 分通常た。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR 分析精製アミノ アルコールの
<ol><li>D2O で精製したアミノ アルコールの溶解 (700 μ L)、核磁気共鳴 (NMR) 管にソリューションを転送。</li>
	<li>1H と13C NMR スペクトルに従って適切な NMR 施設プロトコル28を取得します。</li>
</ol>

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光学活性アミノ アルコールおよび派生物薬物療法が有機合成光学活性助剤から、アプリケーションの広い範囲があります。従来の有機合成によるアミノ アルコールを生産するための多段階の合成は多数あるが、できない場合があります常に効率的な立体化学16の敏感な制御手順と退屈な保護・脱保護のため。保護・脱保護手順と分配するため、通常の高立体選択的生体触媒のアプローチは、良い代替を表す.
前作は、動的運動論的不斉変換 (DYKAT) によって 2-phenylethan-1-アミン バックボーンを持つ様々 な β-アミノ アルコールの合成を報告しました。このルートでヒドロキシ置換ジャスモン センターはベンズアルデヒド、誘導体、触媒、スレオニンアルドラーゼによる aldolisation によって導入されました。低ジアステレオ、この最初のステップの中程度の収率は、触媒による芳香族 β-アミノ アルコール類11,12につながる L チロシン...

生体触媒によって提供される利点があるにもかかわらず合成経路や総生体触媒ルートの生体触媒のステップの統合ほとんど酵素の速度論的解像度に限られたまま。これらのルートは、不斉化学酵素合成の最初のステップとして広く使用されているが、生体触媒高立体選択性1,2,3 機能グループ相互変換でより多くの可能性を提供しています。.また、生体触媒反応は、同様の条件で行われているしたがって、ワンポット ファッション4,5で連鎖反応を実行する実行可能なは。
光学活性アミノ アルコール助剤または有機合成6の足場として使用する汎用性の高い分子である.二次代謝産物と原薬 (API)、アミノ アルコール部分は多い。主な β-アミノ アルコール類、γ-アミノ アルコール類のキラルにへのアクセスが従来の化学合成によって対応する α-アミノ酸の酸からすぐに利用できるまたは二次アミノ アルコールはしばしば一緒に敏感な退屈な合成経路を必要と立体化学7,8,9,10のコントロール。その高い立体選択性により生体触媒これらキラル11,12,13,14に優れた合成経路があります。
我々 は、ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンを報告した/α-ケト酸依存性オキシゲナーゼ家族 (αKAO) (図 1)15。KDO1 ジオキシゲナーゼ L リジンから始まって、(3S) - 水酸基誘導体 (1)、(4R) - の形成を触媒する特に、デリバティブ (2)、KDO2 ジオキシゲナーゼとの反応によって形成されます。KDO1 と KDO2 によって連続 regiodivergent アントシアンが - ジヒドロキシ - L (3R, 4R) の形成につながる-リジン (3) 光学的に純粋な形で。ただし、これらの酵素の基板の限られた範囲は、アミノ基の α 位のカルボン酸残基が活動16に不可欠な化学合成、特に単純なアミンの水酸化の大規模な利用を妨げます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> 図 1: L-リジンの生体触媒変換します。(3S) への変換 - ヒドロキシ - L-リジン (1) 触媒による KDO1 ジオキシゲナーゼ;(4R) - ヒドロキシ - L-リジン (2) 触媒による KDO2 ジオキシゲナーゼ;(3R, 4R) - ジヒドロキシ - L-リジン (3) KDO1 と KDO2 dioxygenases による連続触媒カスケード反応によって。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
脱炭酸代謝17一般的な反応であります。特に、アミノ酸 Dc (EC 4.1.1) 因子無料 (pyruvoyl に依存) または PLP 依存した酵素と細菌と高い生物18,19対応するポリアミンにアミノ酸の脱炭酸を触媒します。,20,21,22. 水酸化カダベリン、L リジンの脱炭酸によって得られるジアミンに、モノとジヒドロキシ化合物 (図 3) 4-7, 10-11対応します。カダベリンは化学工業の主要なビルディング ブロック、特にそれはポリアミド、ポリウレタン高分子のコンポーネントです。したがって、再生可能な資源からこのジアミンのバイオ生産は、石油ベースのルートの代替として注目を集めているし、様々 な微生物は、この目的のために設計されています。これらの代謝経路でリジン DC (LDC) はキー酵素であります。LDC は、アラニン ラセマーゼ (AR) 構造家族23に属する PLP 依存した酵素であります。PLP 依存性 DCs (PLP Dc) は、高い基質特異的知られています。ただし、いくつかの酵素自身の子牛 rumirantium (LDC下さい Srum) から LDC の例として、L-オルニチン、L-リジンのアミノ酸の方活躍中のわずかな混乱の機能のと同様の速度定数があります。リジン、オルニチン脱炭酸24,25。この拡張の基質特異性は、この酵素のモノラル- とディ-ヒドロキシ-L-リジン脱炭酸に適して。また、リジンのヒドロキシ誘導体に向かってアクティブな Dc の発見を αKAO 酵素をコードする遺伝子のゲノムのコンテキストを検討しました。確かに、原核生物ゲノムの同じ生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子が一般的に共同でローカライズされて遺伝子クラスター。推定 PLP DC (図 2) をコードする遺伝子と共局在 ( Chitinophaga pinensis) から KDO2 遺伝子が見つかりました。これに対し、DC の遺伝子が見つかりませんでした KDO1 ジオキシゲナーゼのゲノムのコンテキストを解析するとき。PLP DC 蛋白質c. pinensis (DCCpin) からしたがって、カスケード反応の脱炭酸のステップを触媒する有望な候補として選ばれました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> 図 2: C. pinensisにおける KDO2 遺伝子のゲノム コンテキスト。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
したがって、我々 は dioxygenases とアミノ酸 (図 3) から脂肪族光学活性 β- および γ-アミノ アルコールの合成を達成するために Dc を含む酵素カスケード反応を設計されています。既報の通り、αKAO によって触媒 C H 酸化紹介合計ジアステレオ; ヒドロキシ置換ジャスモン センターCβ/γ カイラリティは、アミノ酸を有する16の先端カーボンにのみ影響 decarboxylative の手順で保持されます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> 図 3: Retrosynthetic 解析します。(A) Retrosynthesis β と γ-アミノ アルコール (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-オールの (4) (5R) - ヒドロキシ - L-リジンと (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) と 1, 5-diaminopentan-3-オール (6) からL-リジン。(B) Retrosynthesis の β、γ、β、δ-アミノ酸ジオール (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-ジオール (10) (2R4S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 4-ジオール (11) (5R) から始まって-ヒドロキシ-L-リジンと (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-ジオール (7) L リジンから始まって。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
L-リジンとその (5R) から始まって-ヒドロキシ誘導体報告 2/3 ステップ、1 つの鍋、dioxygenases とアミノ アルコールをターゲットに取得する PLP Dc 結合酵素のプロシージャ。前に合成反応条件、例えば、開始材料の完全な転換に必要な酵素の濃度を調整する分析スケールで開発されたメソッド標的分子の実験室規模でこの手順も紹介します。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン塩酸塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5S)-ヒドロキシ-L-リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>GPS NONH</td><td>アウトソーシング</td></tr><tr><td>&α;-ケトグルタル酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>75892</td><td></td></tr>アス<tr><td>コルビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物</td><td>アクロス</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキサールリン酸(PLP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-ジメルカプタン-1,2-ジオール(DTT)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNFB)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D1529</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム炭酸水素塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル HiPerSolv CHROMANORM LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-トリフルオロ酢酸</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>メタノール HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>リン酸 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC カラム</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLCシステム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA検出器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mmシリンジフィルター - 0,22&micro;m - PVDF</td><td>メルク</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>ml目盛り付きシングルユースツベルクリンシリンジ、ルアーチップ</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>陽イオン交換樹脂 100-200&nbsp;メッシュ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>ミックスモード陽イオン交換固相抽出カートリッジ 6 mL</td><td>ウォーターズ</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>抽出マニホールド</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>B&uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機α 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 20 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 100 & マイクロ;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 500 & マイクロ;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 1000 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz 分光計</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL マイクロチューブ</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐底遠心分離管</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 丸底フラスコ 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 丸底フラスコ 29/32</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック 11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 丸底フラスコ 29/32</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック 11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 三角フラスコ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

l リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

アミノ アルコールは、アプリケーションの広い範囲で汎用性の高い化合物です。例えば、彼らは有機合成においてキラルの足場として使用されています。従来の有機化学の合成よく立体化の結果の困難なコントロールとの退屈な多段合成プロセスが必要です。48 h ですぐに利用できる L リジンから酵素によってエレメンタリー アミノ アルコールにプロトコルを提案します。このプロトコルは、従来の有機合成による実施し非常ににくい 2 つの化学反応を組み合わせたものです。リシンの unactivated C-H 結合の最初のステップ位置、ジアステレオ選択的酸化の側鎖は; ジオキシゲナーゼによって触媒します。regiodivergent ジオキシゲナーゼによって触媒 2 番目 regio ・ ジアステレオ選択的酸化は、1, 2-ジオールの形成につながることができます。最後の手順で α アミノ酸のカルボキシルはリン酸ピリドキサール (PLP) の脱炭酸酵素 (DC) によって切断され。Decarboxylative ここだけベータ/ガンマ位置にヒドロキシ置換ジャスモン センターを維持、アミノ酸の α 炭素に影響します。結果として得られるアミノ アルコールは光学的濃縮されてしたがっています。プロトコルは、4 つのアミノ アルコールの semipreparative スケール合成に正常に適用されました。反応の監視によって実施されました高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による誘導体化後 1-フルオロ-2, 4-ジニトロ。固相抽出 (SPE) による簡単な浄化は、優れた収率とアミノ アルコールを与えられる (93% > 95%)。

ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンについて報告した/16αKAO 家族 (図 1)。両方の要件を満たすために調節された反作用の状態触媒による触媒 PLP DC による脱炭酸ステップが続く、αKAO 1 つまたは 2 つの水酸化反応ステップを組み合わせると、今回紹介した全体のカスケードのプロトコルを最適化するには酵素反応。2 つの Dc、LDC下さい Srum DCCpin、市販 (5R) に向けての活動を調査し始めました - ヒドロキシ - L-リジン。適切な αKAO によって触媒酸化ステップを伴う翼列モノ誘導体、3-ヒドロキシ-L-リジン (1) と 4-ヒドロキシ-L-リジン (2) に向かって DC の活動を測定しました。表 1...

光学活性アミノ アルコール足場として使用するための汎用性の高い分子は有機合成、です。ジアステレオ選択的 C-H 酸化による対応する水酸基のアミノ酸のカルボン酸残基の胸の谷間に続いてジオキシゲナーゼによって触媒を組み合わせた酵素カスケード反応によってアミノ アルコールを合成 L-リジンから始まって、脱炭酸酵素。

L リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

この手順の全体的な目標は、有機合成のためのキラル助剤から薬物療法まで幅広い用途を持つ化合物であるキラルアミノアルコールを合成および精製することです。これは、天然アミノ酸、リジンに由来するキラルアミノアルコールへのアクセスを得るためのすべての収量メーターで、1つの部分からなる手順で2つまたは3つの酵素ステップです。この手順の主な利点は、プロトコルの単純さと精製ステップの効率です。その手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるAurelie Fossey-Jouenneです。ジヒドロキシル化リジン誘導体を合成するには、250 mLの三角フラスコにhepes buffer、l-リジン、アルパキータグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、および塩を加えます。次に、追加する酵素溶液の容量を考慮して、最終容量の10mlまで水を追加します。デオキシゲナーゼKD-01を最終濃度0.075mg / mlまで加え、反応混合物を室温で300rpmで適切な時間振とうします。.混合後、反応混合物10mclを1.5mlのエペンドルフチューブに移します。次に、アクイアス重炭酸ナトリウム溶液、エタノール、およびエタノール中のDNFB溶液2.5mg /mLを加えます。マイクロチューブを閉じ、溶液を1000rpm、摂氏65度で1時間振とうします。終了したら、ミニ遠心分離機を使用して溶液を落ち着かせます。反応混合物を10mclの1Mヒドロクロリン酸で急冷します。溶液をボルテックスし、ミニ遠心分離機を使用して溶液を沈殿させます。1mlのルアーシリンジを使用して、直径4mmの非滅菌シリンジフィルターで混合物をろ過し、0.22mcmの注ぐサイズの親水性ポリフッ化ビニリデンメンブレンを使用します。その後、誘導体化した反応混合物サンプルをHPLC装置に入れます。C-18カラムに10mclを注入します UV検出を使用して、400ナノメートルで製品を分析します。反応モニタリングで反応が完了したことが示されたら、アルファキータグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、およびより多くの塩をフラスコに加えます。デオキシゲナーゼKD-02を最終濃度0.5mg/mLに添加し、初期反応量を用いて計算します。反応混合物を室温で300rpmで18時間振とうします。反応モニタリングで反応が完了したことが示されたら、反応混合物に100mclの100ミリモルDTTを添加します。さらに100mclの100ミリモルPLP。精製したデカルボキシラーゼDccpinを約最終濃度0.5mg / mlで追加します。.初期反応量を用いて算出。次に、反応混合物を室温で300rpmで18時間振とうします。反応が完了したら、フラスコを氷浴に入れて混合物を冷却します。0.25mlの6モルhclを慎重に加え、添加中に冷反応混合物を静かに振ってください。次に、ガ

enzymatic-cascade-reactions-for-synthesis-chiral-amino-alcohols-from

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

ペプチドの第三級アミド（PTAは）が含まれるが、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチドミメティックのスーパーファミリーである。ここでのPTAの1ビーズ1化合物ライブラリーを合成するためにスプリット·アンド·プールとサブモノマー戦略の両方を組み合わせた合成法を記載している。...

ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

SPOT法で合成されたPeptideアレイは、Protein lysine...

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

イオン液体(IL)は、高いジアステレオ選択性と良好な収率で、1,6-ケトエステルへの迅速、簡便、安価なアクセスを仲介します。反応プロトコルは堅牢で、1,6-ケトーエステルは簡単なろ過プロトコルの後にグラムスケールで得ることができます。さらに、1,6-ケトーエステルは炭化水素溶媒中の強力なゲル化剤です。...

イオン液体によって媒介1,6-ケトエステルの高立体選択的合成：低分子ゲル化剤の新しいクラスへの迅速なアクセスを有効にする三成分の反応

高い特異性で副作用を軽減して腫瘍部位に抗がん剤を送達するためには、ナノ粒子に基づく新しい方法が必要です。ここでは、過酸化水素を介した酸化によって容易に調製でき、還元腫瘍環境下で効率的に解離してペイロードを放出できるジスルフィド架橋ミセルについて説明します。...

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

カチオン性官能基が混在するペプトイドを同じ配列で合成するプロトコールが提示されます（リジン型およびアルギニン型モノマー）。その後、皮膚リーシュマニア症を引き起こす原虫であるリーシュマニア・メキシカーナに対するこれらの化合物の試験についても記載されています。...

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

ここで、我々は、効率的な加水分解およびNi-シッフ塩基複合体から単離されたアミノ酸のその後のFmoc保護を提示します。酸不安定性側鎖保護基の保持が必要な場合、ここに提示加水分解条件は、使用するのに適しています。この技術は、非天然アミノ酸の種々の基材に適応することができます。...

酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

光誘起チオール-エン ・ チオール-イン hydrothiolation を使用して硫化テザー ヘリカル...

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

Enolonium 種にケトン レートの極性転換と α-位へ求核剤の付加のための 2 つのステップ ワンポット プロトコル、説明します。求核剤には、芳香族化合物、アリル シラン、アゾール...

Enolonium 種によるケトン類の極性転換を高機能化 2 段階のプロトコル

不斉濃縮 bispiro [γ-ブチロラクトン-pyrrolidin-4、4'-ピラゾロン] スケルトン非対称的、単純な有機触媒 1,...

効率的な薬物のような Bispirocyclic を介して α イミノ γ-ラクトンの有機触媒及び Alkylidene ピラゾロン足場の構築

マイクロ波アシスト分子内脱水素のDiels-Alder（DA）反応は官能シクロペンタに簡潔なアクセスを提供します[...

官能ナフタレン/ソルバトクロミック色素の合成のためのマイクロ波支援分子内脱水素Diels-Alder反応

学ぶL-リジンから酵素連鎖反応による光学活性アミノアルコールの合成と精製法。有機合成や医薬品開発への応用が可能な効率的なバイオ触媒プロトコルを解説します。

L リジンから光学活性アミノアルコールの合成酵素連鎖反応

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