腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

この実験的手順の全体的な目標は、腫瘍と間葉系幹細胞との間の細胞外小胞媒介性コミュニケーションの役割を研究するための前臨床マウスモデルを開発することです。この方法は、腫瘍と間葉系幹細胞が細胞外小胞を介してどのように通信するか、そしてこれががんの進行をサポートするかどうかについて、がん生物学分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、がんEVによる間葉系幹細胞の適応がin vivoでの進行と転移形成に果たす役割を研究できることです。

この手順の意味は、GSAを使用してEV通信を妨害し、アンドロゲンシグナル伝達を妨害してがんの進行を阻害できるため、がんの治療にまで及びます。この方法は、骨肉腫におけるEV媒介性コミュニケーションに関する洞察を提供するだけでなく、他の多くの種類のがんにも適用できます。実際、間葉系幹細胞に由来する骨髄は、がん支持細胞に分化できるより多くの部位に容易に動員されます。

まず、175平方センチメートルのフラスコ8個に、それぞれ300万個の143B細胞を播種します。EV枯渇培地を用いて細胞を36〜48時間培養します。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、EV分離のために8つのフラスコから上清を回収します。

次に、示差遠心分離を使用して、上清からすべての細胞と細胞破片を取り除きます。これは、摂氏4度で遠心分離を繰り返し、最大の加速と減速を行うことで構成されます。各遠心分離ステップの後、上清を収集し、遠心分離チューブに上清の1ミリリットルを残します。

次に、事前にクリアした上清を超遠心チューブに38.5ミリリットル/チューブでロードします。次に、超遠心分離機を使用して 70, 000g で 1 時間、ゆっくりと休憩し、摂氏 4 度で EV を分離します。超遠心分離後、上清を慎重に取り除き、約1ミリリットルを残します。

次に、EV含有ペレットを残りの容量に再懸濁します。すべてのサスペンションをプールします。そして、プールされた懸濁液をPBSで洗います。

チューブを38.5ミリリットルまで満たします。その後、超遠心分離サイクルを繰り返しますが、休憩は使用しないでください。ローターは約1時間後に回転を停止します。

次に、ペレットを乱さないように上澄みを慎重に取り除き、100〜200マイクロリットルの溶液を残します。最後に、EVペレットを再懸濁し、PBSで最終容量を200マイクロリットルに調整します。その後、EVはTEMで特性評価したり、取り込み実験のために色素で標識したり、in vivo実験のために間葉系幹細胞の教育に使用したりできます。

がんEVに曝露する前に、一次MSCが適切な細胞密度にあることが重要です。セルは、最適なセルEV比を達成し、教育期間中の過成長を防ぐために、約70%のコンフルエントである必要があります。この実験では、順応した成体Athymic Nude-Foxn1nuマウスを使用します。

外科的処置の1日前に、飲料水を介してパラセタモールを提供します。.手術当日は、PBSで1マイクロリットルあたり200, 000で143B細胞を調製します。手術の20分前に、動物にブプレノルフィンを提供します。

麻酔の直前に、濃縮された143B細胞を10マイクロリットルの注射器にロードします。適切な麻酔を確認し、眼軟膏を塗布した後、動物を仰向けにし、後肢をオペレーターに向けて置きます。次に、麻酔マスクを動物に固定します。

次に、左膝を曲げ、70%エタノールとポビドンヨードを交互に3回スクラブして皮膚を拭き、次に局所鎮痛剤として2%リドカインを塗布します。次に、膝のすぐ下の皮膚に小さな切開を行い、脛骨を露出させます。次に、0.8ミリリミッターマイクロツイストドリルを使用して、膝から約2ミリメートル下の脛骨にピンホールを開けます。

両方の脛骨皮質に穴を開けることは避けてください。約5秒かけて穴に1マイクロリットルの細胞をゆっくりと注入しながら進めます。次に、懸濁液の逆流を防ぐために、ティッシュ接着剤の液滴で穴を塞ぎます。

縫合糸と組織接着剤1滴で皮膚を閉じて手術を完了します。動物が加熱して回復するのを許し、パラセタモールで24時間治療します。2日後、0.5ミリメートルのインスリン注射器を使用して、MSCを尾静脈に注射します。

尾静脈注射中の正しい投与を視覚的に確認することができます。白い部分が出たり、抵抗が出た場合は、前の注入部位より上の部分から再度注入してください。次に、週に2回、生物発光を使用して腫瘍の成長を追跡します。

インスリン注射器を介してマウスにD-ルシフェリンを注入し、10分後に、イメージングシステムを使用して腫瘍細胞から生成された光子束を測定します。動物の腫瘍径が15ミリメートルを超える場合、またはその体重減少が15%を超える場合は、動物を安楽死させ、関連するすべての組織を採取します。安楽死の10分前に、イメージング前に行ったように、D-ルシフェリンを注射します。

安楽死後、滅菌されたハサミとピンセットを使用して、肺、肝臓、脾臓、腎臓を採取します。PBSを使用して臓器から血液を洗い流し、イメージングのためにペトリ皿に並べます。生物発光イメージングシステムを使用して、臓器の両側を文書化します。

画像を撮影したら、将来の組織学的分析のためにすぐに臓器を固定します。写真ドキュメントを処理するには、手動のしきい値設定を適用し、各写真の結節の数をカウントします。各写真に同じしきい値を使用し、すべての方向、特に肺からの組織を文書化するようにしてください。

マウスの脛骨を脱灰した後、脱水とパラフィン包埋を進めます。次に、ミクロトームを使用して6ミクロンのパラフィン切片を調製し、スライドガラス上に切片を回収します。スライドが乾いたら、室温で一晩保管します。

翌日、クエン酸緩衝液を使用して熱媒介抗原賦活化を行います。次に、抗GFP抗体で組織を1〜900で染色し、続いてDAPI対比染色を行います。最後に、蛍光顕微鏡を使用して染色された組織切片を文書化します。

単離されたEVの純度は、電子顕微鏡によって確認されました。製剤には、直径40〜100ナノメートルの小胞が含まれていました。がんEVがMSCと相互作用するかどうかを評価するために、EVを緑色蛍光親油リンカー色素で標識し、MSCと一晩インキュベートしました。

これにより、MSCによる効率的なEV導入が確認されました。MSC上のEVの免疫調節特性は、マルチプレックスBベースのサイトカイン免疫測定法を用いて確認されました。腫瘍EVは、ヒト線維芽細胞制御EVと比較して、MSCにおけるIL-8およびIL-6産生の増加を引き起こしました。

次に、骨肉腫の同所性異種移植マウスモデルにおいて、EV教育MSCで治療したマウスは、腫瘍増殖を加速したことが示されました。GFP発現MSCの全身注射の4日後、骨髄と腫瘍組織でGFP発現細胞が検出され、腫瘍部位へのMSCホーミングが示されました。さまざまな臓器のex vivoイメージングにより、肺結節形成が強調されました。

最終的に、EV教育を受けたMSCを投与されたマウスは、肺の転移が多かった。このビデオを見れば、がんEVをex vivoで間質細胞に教育する方法や、前臨床マウスモデルを用いてin vivoで間質細胞を教育する方法を十分に理解できるはずです。この手順を習得すると、十分ながんEVが利用可能であれば、4週間以内に実行できます。

この手順を試みる際には、事前に計画を立てて、がんの細胞外小胞の再現性のある精製を得ること、および低通過増殖性間葉系幹細胞を使用することが重要です。