Name: 腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶ 骨肉腫マウス前臨床モデルで腫瘍由来細胞外小胞と間葉系幹細胞の相互作用を探索する方法。EV教育MSCが腫瘍進行と転移形成に寄与するメカニズムを解明し、がん治療戦略への応用可能性を示します。

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S. r. バジーレは、欧州連合によって共同資金を供給 Cancro (AIRC) ラ Ricerca スルあたり Associazione イタリアーナで交わりによって支えられました。さらに、このプロジェクトはから資金を受けて欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下でない 660200 (s. r. バーリョ) に。

間葉系幹細胞の隔離のための人間の脂肪組織は、機関の倫理委員会で承認後 Tergooi 病院 (ヒルフェルスム, オランダ) のプラスチック外科から得られ、同意します。GFP 陽性脂肪 MSCs 子供と大人 (大学のモデナとレッジョ ・ エミリア) 医学と外科学から得られました。
動物実験を行った動物実験は、オランダ法に基づき、プロトコルは VU 大学医療センター, アムステルダム, オランダの動物実験委員会によって承認されました。
1. 腫瘍分泌細胞小胞の分離。
<ol><li>70,000 x g 一晩で FBS (16 時間)、4 ° c 超スイング バケツ ローターなしのブレーキを遠心分離によって EV 枯渇胎仔ウシ血清 (FBS) を準備 (減速 1 h を期待する)。慎重にペレットを乱すことがなく清 (EV 枯渇 FBS) を収集します。0.22 μ m のフィルターで EV 枯渇 FBS をフィルター処理します。</li>
	<li>100 の U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) を補うことで EV 枯渇培養培地を準備 (1 P/S/G x) と 5 %fbs の EV 枯渇します。</li>
	<li>175 cm2フラスコで 3 x 10 の6 143B セルをシードし、37 ° C、5% CO2でインキュベーターでの培養液の EV 枯渇にそれらの文化します。細胞は (通常後 48 h に 36 h) 80-90% の合流を EV 免 8 x 175 cm2フラスコ (28 mL/フラスコ) からの上清を収集します。</li>
	<li>あらかじめ差動遠心分離の (以前スピンするたびに上清を遠心分離) によると、次のプロトコルによって細胞と細胞の残骸を削除する細胞上清をクリアします。<ol>
<li>10 分間 500 x g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>15 分間 2000 x g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>30 分間、10,000 × g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>最大加速度と減速速度設定 4 ° C ですべての遠心を実行します。各手順の後約 1 mL を残して、EV を含む上清を慎重に収集します。手順 1.5 またはストアに事前認可エアコン-80 ° c 媒体 EV 分離まですぐに進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間 70,000 x g で一度にクリアランス済みエアコンの中を遠心分離で EVs を分離、4 ° c 超スイング バケツ ローターを用いた超遠心分離機管 (最終巻 38.5 mL/チューブ) で、ブレーキをゆっくり。</li>
	<li>慎重に残りのボリュームで EV を含むペレットを再懸濁しますが後ろに約 1 mL を残して上清を削除、それらをすべて 1 つの遠心管のプールおよび完全なチューブ充填までリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の追加 (最終巻 38.5 mL)。</li>
	<li>ブレーキなしの 4 ° C で 1 時間もう一度 70,000 × g で遠心分離 (減速 1 h を期待する)。慎重にペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、100-200 μ L を残します。</li>
	<li>EV ペレットを再懸濁し、(すべて EV 隔離の標準化) PBS で 200 μ L に最終的な音量を調整します。EV の準備をすぐに使用または使用22まで-80 ° C で保存します。 注: EVs に格納できる-80 ° C で 6 ヶ月</li>
</ol>2. EV の特性。
透過電子顕微鏡 (TEM)23によって精製された EVs を視覚化できます。
<ol><li>リン酸バッファーの 4% のパラホルムアルデヒドの等量とミックス EV preps。</li>
	<li>コート 200 メッシュ ホルムバール カーボン被覆ニッケル TEM グリッド室温で 20 分間 EV を懸濁液 5 μ L です。</li>
	<li>0.1 M リン酸緩衝液 (7.0)、シュウ酸ウラニル (pH 7.0) とは対照的に 1% グルタルアルデヒドで TEM グリッドに EV サンプルを固執し、氷の上比は 1:9 4% ウラニル、2% の酢酸メチル セルロースの混合物に埋め込みます。</li>
	<li>ステンレス ループを持つグリッドを削除およびメチル セルロース フィルムの適切な厚さを確保するためフィルター ペーパーで余分な水分をしみ。</li>
	<li>乾燥後、電子顕微鏡でグリッドを確認し、対応するイメージ ソフトウェアと結合したデジタル カメラで画像をキャプチャします。</li>
</ol>3. 腫瘍由来の EVs で MSCs の教育。
<ol><li>4 %ev 枯渇ひと血小板ライセート (hPL)24ヘパリン (10 U/mL) 1 とアルファ最小値必要な媒体 (アルファ MEM) を補うことで MSC の培養液の準備 P/S/G. x 注: EV 枯渇 hPL は、1.1 節で説明されている手順に従って取得されます。</li>
	<li>シード 1.4 x 106 75 cm2フラスコあたりの脂肪由来 MSCs と培地の EV 枯渇 MSC-37 ° C で 5 %co2 インキュベーターでそれらを文化します。</li>
	<li>ときセルを追加 143B 骨肉腫-70% の合流点に到達、またはひと線維芽細胞 (hf) を制御-10 μ L EV 準備/cm2の培養用フラスコ、EVs。24 時間インキュベートし、付加的な 6 時間の EVs の同じ量を追加します。注: 線維芽細胞培養ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) で 10 %fbs および EVs はセクション 1 で説明したように分離されます。</li>
	<li>MSC 上澄みを集め、1 x (最大加速度と減速速度設定) の 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心分離機、新しいチューブに移し、-80 ° c 将来サイトカイン解析 (セクション 5) を有効にするオフ上清を保存します。</li>
	<li>体内の実験 (セクション 6) 教育 GFP 陽性 MSCs25 3.3 3.1 のセクションで説明したように、細胞を収集し、注入まで氷の上 100 μ L。 保持細胞あたり 10 の6セルの最終的な集中に PBS でそれらを再懸濁します。</li>
</ol>4. EV 内面化の試金。
MSCs によって EV 吸収を可視化、次の製造元のプロトコル (市販) リンカー緑色蛍光色素 (GFLD) の Ev をラベルします。
<ol><li>簡単に言えば、200 μ L EV 準備に希釈液 180 μ L を追加します。GFLD 色素希釈の 50 μ L での 1 μ L を希釈し、希釈の EV 準備に色素希釈の 20 μ L を追加します。</li>
	<li>軽くピペッティングで混ぜるし、暗闇の中で部屋の温度で 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>PBS で 0.1 %bsa の 5 mL を追加、超遠心分離管に移し、PBS (最終巻 38.5 mL/チューブ) と管を埋めます。</li>
	<li>遠心ブレーキなしの 4 ° C で 1 時間 70,000 × g で 1 x (減速 1 h を期待する)。慎重に上澄みを除去し、200 μ L の最終巻でラベル付けされた EV ペレットを再懸濁します (PBS でボリュームを調整)。</li>
	<li>MSC 文化にラベル付きの EVs を追加または-80 ° C で保存一晩インキュベートした後蛍光顕微鏡による小胞内面を評価し、フローサイトメトリー7の流れ。</li>
</ol>5. MSC サイトカイン発現の評価。
<ol><li>インターロイキン 8 (IL-8) の多重の定量化, インターロイキン 1 β (il-1)、インターロイキン 6 (IL-6)、インターロイキン 10 (IL-10)、腫瘍壊死因子 (TNF)、MSC のインターロイキン-12 p 70 (IL-12 p 70) タンパク質レベル完備媒体 (手順 3.4 を参照) を使用して、製造元の指示に従う人間の炎症性サイトカインの市販フローサイトメトリーによるビーズの配列 (CBA)。</li>
	<li>簡潔に、キャプチャの標識抗体ビーズをミックスし、すべてのアッセイ チューブにそれらを追加します。サイトカイン標準希釈液の調製やエアコンの中のサンプルをチューブに追加します。</li>
	<li>検出試薬を追加し、室温 3 時間インキュベート</li>
	<li>付属の洗浄ソリューションでビーズを洗浄します。流れの cytometer を使用してサンプルを測定し、製造元の指示に従ってデータを分析します。</li>
</ol>6. 骨肉腫の同所性同種異種移植マウス モデルの世代。
<ol><li>慣らす実験の手順を開始する前に、少なくとも 1 週間に 6 週齢では、女性の無胸腺ヌード Foxn1nu マウスを許可します。</li>
	<li>1 日前手術に、と周術期鎮痛法としては、飲料水にパラセタ モールを追加します。「子供のためパラセタ モール ソリューション」を希釈 (材料の表を参照) を最終濃度 2 mg/mL の水で。150 mL/kg の平均水摂取量に基づいて/日、20 g の平均体重、この用量は 6 mg の投与量に達する/マウスに十分な/日 (300 mg/kg/日)。</li>
	<li>術後、あるいは長い動物は痛みの兆候を示す場合の 24 時間まで鎮痛治療を継続します。</li>
	<li>手術の日、10 分 300 × g で遠心分離によってルシフェラーゼ正 (流) 143B 細胞 (レンチ ウイルス伝達によって以前に生成) を収集し、PBS で 2 x 10 の5細胞/μ L の濃度で細胞を再懸濁します。6 時間を氷の上細胞懸濁液を維持します。</li>
	<li>オートクレーブ手術用機器。準備し、作業領域をきれいに滅菌ハサミとピンセット滅菌シート上に配置。手術の手順 (手順 6.8) の前に 20 分皮下ブプレノルフィン (0.05 mg/kg、0.9% 生理食塩水で希釈した) との 0.5 mL インスリンは注射器 (29 g 針) を使用して鎮痛剤として動物を注入します。</li>
	<li>それぞれの動物を麻酔直前集中 (流) 143B 細胞懸濁液の少なくとも 1 μ L で 10 μ L のシリンジを入力 (手順 6.4 を参照)。</li>
	<li>イソフルレン吸入麻酔 (酸素の 2-3%) と動物を麻酔します。つま先は、動物を締めつけることにより、麻酔のレベルを確認します。動物がすなわち、麻酔が深くつまんでに反応しないときは、麻酔中の乾燥を防ぐために目に軟膏を塗る。</li>
	<li>麻酔マスクで頭とオペレーターに向かって足背中に動物を配置します。左の膝を屈曲します。70% アルコールで皮膚を拭くし、綿先端が 3 倍の局所麻酔薬リドカイン (2%) を適用します。</li>
	<li>滅菌手術用のナイフを使用して、脛骨を公開する膝のすぐ下の皮膚に小さな切開 (約 5 mm) を作る。脛骨、0.8 mm のマイクロ ドリルを使用して膝の下約 2 mm のピンホールをドリルします。両方の脛骨の皮質ドリルスルーはがれる恐れがあります。</li>
	<li>26 ゲージの針を使用して穴にゆっくりと (約 5 秒) で 1 μ L 細胞懸濁液 (約 2 x 10 の5セル) を挿入します。懸濁液の逆流を防止する組織接着剤の液滴と穴を閉じます。</li>
	<li>モノフィラメント縫合糸と組織接着剤の一滴で肌を閉じます。よく加熱された環境 (熱ランプを使用) で動物の回復をしましょう。放置しないでください動物まで胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しています。動物が完全に麻酔から回復後に、のみ、自分のケージに戻します。</li>
	<li>腫瘍接種後 2 日間注入教育 EV または素朴な GFP 陽性 MSCs (100 μ L の pbs は、10 の6セルは、ステップ 3.5 を参照)、マウスの尾静脈で 0.5 mL インスリン注射器で静脈内投与。</li>
	<li>腫瘍の成長を生物発光イメージングの26週二回に続きます。このため、150 μ L でマウス i. p. を注入 D-ルシフェリン (30 mg/mL) をインスリン注射器。注入後、10 分生物発光イメージング システムに動物を配置し、腫瘍細胞によって生成される光束を測定します。</li>
	<li>また、キャリパーと骨腫瘍の直径を測定します。(Mm3) の腫瘍体積は、長さ2 × 0.5 × 幅によって推定されます。</li>
	<li>注記: 人道的エンドポイントは腫瘍径として定義されます > 15 mm や減量 > 15%。</li>
</ol>7. 肺結節数の評価
<ol><li>動物の 1 つ (約 3-4 週間) でステップ 6.14 で定義される人道的エンドポイントに達すると、実験を終了して収集し、すべての関連する組織を分析します。</li>
	<li>Euthanization、前に 10 分を 150 μ L 注入 D-ルシフェリン (30 mg/mL) を 0.5 mL インスリン注射器。</li>
	<li>イソフルレン吸入麻酔と動物の麻酔 (手順 6.7 を参照してください)。つま先ピンチにマウスの反応の欠如によって麻酔の深さを確認します。頚部転位27でマウスを安楽死させます。</li>
	<li>肺、肝臓、脾臓、腎臓滅菌ハサミとピンセットを使用してを収集します。血のトレースを削除し、シャーレに入れて PBS で臓器を洗います。</li>
	<li>生物発光イメージング システムの臓器とペトリ皿を配置します。器官の両側発光信号を測定します。測定後すぐに将来の組織学的解析の 4% ホルマリン (24-72 時間、RT) をじっと見つめることで臓器を突入します。</li>
	<li>手動閾値処理によって適切なイメージング ソフトウェアを使用して得られた写真を処理します。各画像上肺結節の数をカウントします。肺の両側肺結節の合計数をカウントします。</li>
</ol>8. 組織学的解析
<ol><li>肺組織の組織学的解析。<ol>
<li>パラフィンのホルマリン固定臓器を埋め込み、6 μ m 組織スライドを準備します。</li>
		<li>Deparaffinate 肺組織はスライドし、それらを 0.01 M クエン酸バッファー (pH 6) で 15 分間煮沸して抗原検索を実行します。</li>
		<li>抗ビメンチン抗体 (200 μ G/ml) 希釈 1: 150 抗体希釈液 (市販) でと、HRP 標識二次抗体 (0.5 mg/mL、希釈 1: 500) その後室温で水平方向にスライドを孵化させなさい。3'-ジアミノベンジジン (軽打) とヘマトキシリン カウンター染色組織を染色します。</li>
		<li>対応するカメラとイメージ ソフトウェアと結合した光学顕微鏡による染色組織スライドを観察します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス脛骨の GFP 陽性 MSCs の存在を評価。<ol>
<li>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 0.24 M、pH 7.2 7.4 で脛骨をめし。骨が柔軟になる (約 1 週間) まで毎日 EDTA バッファーを更新します。</li>
		<li>脛骨を脱水し、パラフィンとそれらに侵入します。パラフィン ブロックに脛骨 (骨肉腫組織を含む) を埋め込みます。</li>
		<li>ミクロトームを使用して、6 μ m のパラフィン切片を準備します。スライド ガラスの上にパラフィン セクションに配置します。乾燥後、室温で一晩スライドを保存します。</li>
		<li>クエン酸バッファーを使用して熱を介した抗原検索を実行 (8.1.2 を参照) 抗体希釈液で 1:900 希釈の抗 GFP 抗体 (抗血清を全体) と組織を染色します。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と組織を counterstain します。</li>
		<li>対応する画像処理ソフトウェアと結合した蛍光顕微鏡を用いた組織スライドを観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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腫瘍分泌細胞小胞 (Ev) は、腫瘍支援環境を生成するローカルと遠隔の間葉系細胞の生理学を変更できます。ここで腫瘍細胞の EV を介した相互作用の郭清ができる骨肉腫のマウスの前臨床モデルの生成について述べるし、間葉系幹細胞 (MSCs)生体内で。ひと腫瘍マウス骨肉腫異種移植片を強く付け EV 教育 MSCs の全身投与は、IL-6/STAT3 シグナリング経路7をアクティブにして癌の増殖と転移の形成を促進することを示す.
最近の研究は、がん EVs がローカルまたは骨髄由来間質細胞16,28,29の動作を変更することにより前転移のニッチの形成で助けることができる示されています。これらの研究は、細胞型腫瘍促進効果に責任の識別を複雑に受信者のマウス癌由来の小胞を直接注射することによって主に行われています。我々 のプロトコルでがん EVs...

腫瘍微小環境は転移巣形成および1の治療に抵抗性の発達を含む腫瘍と癌の進行のすべてではない、ほとんどの面で積極的に参加しています。これは腫瘍のニッチ市場で発生している複雑な腫瘍間質相互作用の郭清ができる臨床同所性同種癌マウス モデルの必要性を強調します。
腫瘍微小環境の多くの細胞コンポーネント間で間葉系幹細胞 (Msc) は強く乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、骨肉腫2 など複数のがんの種類の癌の進行に貢献します。 ,3,4,5,6,7。MSCs は、8,9骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血、およびその他を含むさまざまな成人および胎児組織に存在する多能性幹細胞です。がんによる炎症性シグナルに応答、MSCs は腫瘍のサイトへの移行、腫瘍微小環境に組み込む、最終的に細胞のがんサポート10に分化します。これら癌関連付けられている MSCs は腫瘍の進行腫瘍細胞と周囲間質2,の両方の演技 (すなわち、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、免疫メディエーター) 本質的な要因を提供します。3,11,12,13。 癌関連付けられている MSCs の発癌促進効果が多数癌モデルで検討されてきた中、腫瘍細胞は、癌促進のニッチを形成する MSCs を再プログラムするメカニズムはよく理解され。ここで具体的には細胞小胞 (Ev) を介して骨がん細胞と MSCs の pro 発癌性の相互作用の研究ができる直交異方性異種移植モデルの生成について述べる.
EVs は、腫瘍と間質細胞14細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。EVs は、細胞が起源、蛋白質、脂質、規制 Rna などの生体機能分子を運ぶ。これらの小胞周囲の細胞によってとることができる、血液やリンパの循環を介して遠隔部位に運ばれるや標的細胞の行動に深く影響を与える細胞外スペースに解放されて、一度。15,16,17たとえば、間質線維芽細胞による癌 EVs の取り込みがあります myofibroblast 分化血管新生をサポートし、腫瘍成長体内18,19, 内皮細胞によって内面化を加速細胞が腫瘍の血管新生を刺激して血管透過性16,20、増加し、免疫細胞との相互作用は、21抗腫瘍免疫応答の抑制につながる可能性があります。
我々 は最近示した、骨肉腫、腫瘍細胞がプロ発癌性およびプロ転移性表現型を取得する MSCs を促す EVs を多量を解放する発光同所性同種異種移植マウス モデルを用いたします。この効果は MSC サイトカイン発現プロファイル (「MSC 教育」と呼ばれる)、の劇的な変化により、治療インターロイキン 6 受容体 (IL-6 r) 抗体7の管理によって防ぐことができます。私たちの仕事は、がん EVs が骨肉腫の進行を停止する微小環境をターゲットとしたアプローチの理論的根拠を提供、MSC の動作の重要な変調器であることを示した。ここで、EV を介した腫瘍 MSC の相互作用、生体内で調査するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる.このモデルは、するものです: 1) 特に腫瘍微小環境におけるがん EV 誘起 MSC の動作変更を定義する、2) 評価に干渉するかどうかこの相互作用が骨腫瘍の成長と転移巣の形成、3) 研究に貢献する方法生体内でEV を介したクロストークは、癌の進行を防ぎます。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>オプティマL-90K</td><td></td></tr><tr><td>ローター SW32Ti</td><td>ベックマン</td><td>369650</td><td>原稿では超スイングバケットローター</td></tr>と呼ばれています <tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>EM109</td><td>または同様のTEM</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td>DMX1200F</td><td>または同様のカメラ</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア TEM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>または類似の 蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R-80</td><td></td></tr> <tr><td>冷凍庫</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>または同様のフローサイトメーター</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>0.8 mmドリル付き</td></tr><tr><td>HSSマイクロツイストドリル、0.8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0.8 mmドリル</td></tr><tr><td>IVISカメラ</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>原稿では生物発光カメラと呼ばれています。Xenogen は Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living イメージ ソフトウェアの一部になりました 2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen は Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 & micro の一部になりました。L シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>ニューロス モデル 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>針: ハミルトン RN 注射針用、26 ゲージ、Pointstyle AS、カスタム長さ 2 cm</td><td>ハミルトン</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>キャリパー</td><td>ミツトヨ</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>アステル</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td>フィリップス</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>培養培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>血小板溶解液</td><td>n.a.n.a.IMDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ミディアム</td><td>ロンザ</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>α-MEM ミディアム</td><td>ロンザ</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ミディアム</td><td>ロンザ</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌/グルタミン</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adipose deriverd MSCs</td><td>n.a.n.a.GFP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>陽性MSCs</td><td>n.a.n.a.human</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fibroblasts</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>143B細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>FLUC-143B細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>形質導入</td></tr><tr><td><ストロング>ディスポーザブル</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>凍結チューブ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>超透明チューブ</td><td>ベックマン</td><td>344058</td><td>原稿では超遠心チューブ</td></tr><tr><td>0,22 &micro;m フィルター</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL インスリン注射器 29G ニードル</td><td>テルモ</td><td>U-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>濾紙&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>試薬/キット</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>アルファ エーザー</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ブラウン</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>シュウラニル</td><td>EMS (電子顕微鏡)Sciences)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ユラ</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>原稿ではGFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - human inflammatory cytokine kit</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼の外科用刃</td><td>スワン・モートン</td><td>206</td><td>原稿では外科用ナイフとして言及</td></tr>されている <tr><td>抗ヒトビメンチン抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc-6260</td><td>クローン V9</td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP 標識抗マウス IgG 抗体</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td></td><td>Sigma GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buffer</td> n.a.n.a.Citrate <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>buffer</td><td>n.a.n.a.rabbit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polyclonal anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>n.a.Ab290</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズD1306</td><td></td></tr><tr><td>パラセタモール、120 mg / 5 mlシロップ</td>バイ<td>エル</td><td>n.a.Sinaspril</td><td>、子供用パラセタモール溶液</td></tr><tr><td>イソフルラン1000 mg /</td><td>gVumc薬局</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノフィン塩酸塩、0.3 mg / ml</td><td>インディビオールUKリミテッド</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン-HCL 2%</td><td>Vumc薬局</td><td>n.a.70</td><td></td></tr><tr><td>%エタノール</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>組織接着剤</td><td>Derma + Flex、処方された医療用シアノアクリレート</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>点眼薬:Vidisec Carbogel、2 mg / ml</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.a.D</td><td></td></tr><tr><td>-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジーLUCK-1</td><td></td></tr>ガラス<tr><td>スライドThermo</td><td>scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ループ&nbsp;</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Mice experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&nbsp; 女性、到着時6週間、細菌の状態はFELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.Paper-pulp</td><td></td></tr> <tr><td>smart home (cage enrichment)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.Alpha-dri</td><td></td></tr> <tr><td>bedding material</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>マウスフード:Tekladグローバル18%タンパク質げっ歯類ダイエット</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸Ethicon</td><td></td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>(または類似)</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>(または類似)</td></tr></tbody></table>

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

腫瘍微小環境の内で居住者又は採用した間葉系幹細胞 (MSCs) は、複数のがんの種類で悪性進展に貢献します。特定環境シグナルの影響を受けて、これらの成体幹細胞は加速の腫瘍の成長と転移につながるパラクリン メディエーターを解放できます。腫瘍と MSCs 間のクロストークの定義は、癌の進行のメカニズムを理解し、治療的介入のための新しいターゲットを識別する重要です。
がん細胞標的細胞腫瘍微小環境、遠隔部位の動作に深く影響を与える細胞小胞 (Ev) の大量に生産します。腫瘍の EVs は、炎症性の Rna と間質細胞のがん細胞の転移の特性を高めるためにまたは前転移のニッチ形成に参加することができます教育 (新規) タンパク質を含む生体機能分子を囲みます。この記事で EV を介したクロストーク腫瘍と間葉系幹細胞との間の具体的な評価を可能にする臨床癌のマウスモデルの開発について述べる.まず、浄化と腫瘍分泌 EVs のキャラクタリゼーションと MSCs によって EV 内面の評価について述べる。我々 はそれから作るがん EVs による多重ビード ベース イムノアッセイ MSC サイトカイン発現プロファイルの変化を評価するための使用。最後に、腫瘍 MSC の相互作用を繰り返す骨肉腫の発光同所性同種異種移植マウス モデルの生成を説明し、腫瘍の増殖と転移形成に MSCs を EV 教育の貢献を示します。
私たちのモデルは、がん EVs が腫瘍支援の環境を形づけるかを定義し、腫瘍と MSCs の EV を介したコミュニケーションの封鎖は癌の進行を防止するかどうかを評価する機会を提供します。

本研究では、我々 はプロ発癌性およびプロ転移性表現型に向かって MSCs を教育する骨肉腫分泌される電気自動車の能力を探った。骨肉腫細胞が MSCs によって内在化されているエキソソームのような EVs を解放することを示す.がん、EVs による MSC サイトカイン発現プロファイルの変化を測定し、, EV 教育 MSCs の腫瘍の成長と転移巣形成に及ぼす影響を評価した.研究デザインの一般的な表現を図 1に示します。
制御線維芽細胞は、差動遠心分離によって精製したまたは EVs 解放 143B 骨肉腫細胞によって。EV の純度は 40 ~ 100 nm (図 2A) の間で及ぶ直径準備は小胞主に含まれている明らかに電子顕微鏡によって確認されました。がん EVs は、MSCs と対話するかどうかを評価す...

癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ プロトコルをについて説明します。

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

この実験的手順の全体的な目標は、腫瘍と間葉系幹細胞との間の細胞外小胞媒介性コミュニケーションの役割を研究するための前臨床マウスモデルを開発することです。この方法は、腫瘍と間葉系幹細胞が細胞外小胞を介してどのように通信するか、そしてこれががんの進行をサポートするかどうかについて、がん生物学分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、がんEVによる間葉系幹細胞の適応がin vivoでの進行と転移形成に果たす役割を研究できることです。この手順の意味は、GSAを使用してEV通信を妨害し、アンドロゲンシグナル伝達を妨害してがんの進行を阻害できるため、がんの治療にまで及びます。この方法は、骨肉腫におけるEV媒介性コミュニケーションに関する洞察を提供するだけでなく、他の多くの種類のがんにも適用できます。実際、間葉系幹細胞に由来する骨髄は、がん支持細胞に分化できるより多くの部位に容易に動員されます。まず、175平方センチメートルのフラスコ8個に、それぞれ300万個の143B細胞を播種します。EV枯渇培地を用いて細胞を36〜48時間培養します。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、EV分離のために8つのフラスコから上清を回収します。次に、示差遠心分離を使用して、上清からすべての細胞と細胞破片を取り除きます。これは、摂氏4度で遠心分離を繰り返し、最大の加速と減速を行うことで構成されます。各遠心分離ステップの後、上清を収集し、遠心分離チューブに上清の1ミリリットルを残します。次に、事前にクリアした上清を超遠心チューブに38.5ミリリットル/チューブでロードします。次に、超遠心分離機を使用して 70, 000g で 1 時間、ゆっくりと休憩し、摂氏 4 度で EV を分離します。超遠心分離後、上清を慎重に取り除き、約1ミリリットルを残します。次に、EV含有ペレットを残りの容量に再懸濁します。すべてのサスペンションをプールします。そして、プールされた懸濁液をPBSで洗います。チューブを38.5ミリリットルまで満たします。その後、超遠心分離サイクルを繰り返しますが、休憩は使用しないでください。ローターは約1時間後に回転を停止します。次に、ペレットを乱さないように上澄みを慎重に取り除き、100〜200マイクロリットルの溶液を残します。最後に、EVペレットを再懸濁し、PBSで最終容量を200マイクロリットルに調整します。その後、EVはTEMで特性評価したり、取り込み実験のために色素で標識したり、in vivo実験のために間葉系幹細胞の教育に使用したりできます。がんEVに曝露する前に、一次MSCが適切な細胞密度にあることが重要です。セルは、最適なセルEV比を達成し、教育期間中の過成長を防ぐために、約70%のコンフルエントである必要があります。この実験で

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に...

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

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マウスモデルにおける蛍光ガイド下腫瘍切除とMSCシード足場移植:マウスモデルにおける脳腫瘍切除腔内治療用間葉系幹細胞送達の外科的手技

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腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

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李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

ここでは、骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞における間葉系幹細胞における、メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、LINE-1要素のメチル化レベルを解析する。ウシ胎児血清から細胞外小胞を分離するための一般的な手順である超遠心分離も実証されている。...

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

ここでは、転移生物学の前臨床調査や新規治療薬の開発に使用できる自発的な肺転移を伴う骨肉腫の切断手順に続く同種の同一性の好交性移植法について説明する。...

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

本プロトコールは、同所性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射を記載する。...

同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射

プロトコルは例として骨肉腫のマウス モデルのYiqi Jieduの煎じ薬の煎じ薬の煎じ薬の方式および強制経口の技術の詳しい標準化プロセスを提供する。動物保護について説明し、研究データの信頼性を向上させ、in...

骨肉腫モデルマウスにおける漢方薬の煎じ薬の強制経口投与戦略

本プロトコールは、ヒト骨肉腫組織を用いて患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルを確立する方法を記載している。...

ヒト骨肉腫組織を用いた患者由来異種移植マウスモデルの樹立

学ぶ 骨肉腫マウス前臨床モデルで腫瘍由来細胞外小胞と間葉系幹細胞の相互作用を探索する方法。EV教育MSCが腫瘍進行と転移形成に寄与するメカニズムを解明し、がん治療戦略への応用可能性を示します。

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

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