白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

この落射蛍光生体内ビデオ顕微鏡法、または血管のIVMプロトコルの全体的な目標は、マウスのアンジオテンシンII誘発性高血圧症の腐食した動脈における白血球の転がりと接着を視覚化し、定量化することです。この方法は、白血球、特にリソソームと陽性細胞との間の相互作用のメカニズム、血管の働きなど、血管機能障害と動脈性高血圧症の病理における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、循環血液細胞と血管の理解との間のin vivoの相互作用を見ることができることです。

テキストprotolに従って、浸透圧ポンプによるアンジオテンシン2治療の7日後に手術用の雄マウスを準備します。手術中に目を保護するために、眼科用軟膏を目の上に塗ります。麻酔をかけた動物を摂氏39度の手術用プレート上の背側横臥位に置き、直腸プローブを挿入して温度を維持します。

綿棒を使って脱毛クリームを伸ばし、髪の毛が抜け始めるまで首にこすりつけます。次に、さらに2分後、へらを使って毛とクリームを取り除きます。その後、アルコール性皮膚消毒剤を使用して皮膚を消毒します。

次に、実体顕微鏡で、気管から1cmのところにある首の皮膚に1〜1.5cmの縦切開を行います。次に、最初の切開の両端に2つの垂直な切開を行います。皮膚のすぐ下の組織を慎重に取り除き、左頸静脈と気管を覆っている皮膚片を取り除きます。

次に、2つの湾曲した鉗子を使用して、舌下および顎下腐食腺を関心のあるゾーンから慎重に分離します。腺を切ったり傷つけたりしないように注意しながら、頸静脈と隆起に最もよくアクセスできるように腺を配置します。次に、頸静脈を分離するために、血管と周囲の組織の間に細い鉗子を挿入し、器具をゆっくりと開閉して静脈を組織から穏やかに解放します。

頸静脈が完全にきれいになったら、鉗子を血管の下に置き、その下に長さ10cmの7-0縫合糸を2本入れます。2つの結び目を結び、頭の近位にある縫合糸を閉じ、2番目の縫合糸で1つの結び目を準備しますが、閉じないでください。次に、片手に鉗子を持ち、摂氏37度の滅菌生理食塩水で満たされたカテーテルを持ち、もう一方の手でハサミまたは湾曲した26ゲージの針を使用して血管に小さな切開を行います。

カテーテルを頸静脈に挿入し、結び目を2回閉じます。次に、カテーテルの頭の近位にある縫合糸を閉じて、完全に固定されるようにします。腐食した動脈を分離して準備するには、細い湾曲した鉗子を使用して気管を覆う領域を解剖します。

次に、腐食した部分が周囲の組織から解放されたら、必要に応じて細い鉗子をゆっくりと閉じたり開いたりして、神経を穏やかに動かすために、血管を切断せずに血管からベガス神経を取り除きます。両方の動脈が完全にきれいになったら、鉗子を最初の腐食した動脈の下に置き、血管を伸ばしすぎないように注意しながら、血管の下に小さな黒い3 mm x 2.5cmのプラスチック製容器ホルダーを置きます。血管ホルダーが所定の位置に配置されたら、血流が存在することを確認します。

血管が伸びるのを避けるために、オペレーターの手は、腐食した動脈を隔離するために最初の鉗子を1回動かし、血管の下に穴を開けるために2番目の鉗子の助けを借りて、できるだけ動かないようにする必要があります。容器ホルダーが正しく配置されたら、2番目の動脈をデバイスの上に置きます。マウスを顕微鏡の真下に置かない場合は、腺を気管の上に戻し、ゾーンの乾燥を避けるために摂氏37度の滅菌生理食塩水を適用します。

1 mLシリンジで、アクリジンオレンジの1 mL解凍済みストック溶液2 mgを滅菌生理食塩水で1〜4希釈します。.シリンジを光から保護します。測定を行うには、長距離コンデンサーとモノクロメーター、ビームスプリッター、CCDカメラを備えた10倍水浸対物レンズを使用して、高速広視野蛍光顕微鏡の下にマウスを配置します。

腐食した動脈の中央、内皮表面に対物レンズを合わせることで、リアルタイムで画像を取得します。アクリジンオレンジ50mLをゆっくりと注入します。次に、100枚の画像を記録するようにソフトウェアを設定し、画像あたりの露光時間を120ミリ秒にします。

各ビデオの動脈の異なる場所で、腐食した動脈ごとに4つのビデオを録画します。蛍光シグナルが減少した場合は、さらに50mLのアクリジンオレンジを注入します。.さまざまな条件をテストするには、頸静脈カテーテルが挿入されていない場合は、アクリジンオレンジを外側尾静脈に直接注入し、同じ画像取得を実行します。

対照として、注射されていないlys-Mcre陽性、IRG陽性マウスからの蛍光測定値を記録します。ローリングセルと接着細胞を、各ビデオの容器の中央に配置された200ミクロン×250ミクロンの長方形のビューで定量化し、毎秒10枚の画像の速度で表示します。ローリングセルとアドヒアランスセルをカウントします。

アドヒアランス細胞は、10 秒のビデオ内で内皮から移動または剥離しない細胞として定義されます。定量を簡素化するには、赤色の蛍光が付着したチャネルを除去し、赤色の蛍光のみを使用してローリング細胞と接着細胞をカウントします。本研究では、アンジオテンシン2を注入したlys-mCre陽性マウス、IRG陽性マウスの腐食をIVMを用いて観察した。

ベースラインで見られるように、頸静脈カテーテルの存在により、lys-M陽性蛍光細胞が接着しました。アクリジンオレンジ注射後、内皮細胞も蛍光を発していました。その後、バックグラウンドを縮小して内皮関連の蛍光を抑制したところ、有核接着細胞全てがlys-M陽性であることが明らかになった。

この実験では、アンジオテンシン 2 注入の 1 週間後、lys-M Cre 陽性 IRG 陽性マウスの腐食した動脈における白血球内皮相互作用を、アクリジン オレンジ注射の有無にかかわらず、頸静脈カテーテルまたは尾静脈を介して IVM によって画像化および視覚化されました。カテーテルや注射を行わなかった場合、アンジオテンシン2注入後のlys-M陽性細胞のローリングは、未治療のマウスと比較して有意に増加しました。そして密着性も高められました。

頸静脈カテーテルによるアクリジンオレンジの注射は、アンジオテンシン2で治療したマウスの接着とローリングを、カテーテルなしのマウスと比較して大幅に増加させました。最後に、これらのパネルに見られるように、尾静脈にアクリジンオレンジを注入すると、アクリジンオレンジを注射しなかったマウスと比較して、同様の接着とローリングがもたらされます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば30分で完了します。

この手順を試みるときは、血管の周囲の組織を傷つけないように覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、心血管系および止血系の研究者がin vivoで白血球と血管壁への血小板接着を調査する道を開きます。このビデオを見れば、IVMにおける色素注入と手術の影響を制限する方法についてよく理解できるはずです。

インターカレート蛍光染料の取り扱いは非常に危険であり、手袋などの適切な素材を使用して染料との皮膚接触を避ける必要があることを忘れないでください。