S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

この手順の全体的な目標は、X線結晶構造解析と小角X線散乱の両方によるハイブリッド構造解析のために、秩序ドメインと無秩序ドメインの混合物で構成される組換えタンパク質を作製することです。この方法は、すべての溶液の決定がタンパク質の構造を維持するように生物学的機能を置くことに関する構造生物学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、X線結晶構造解析では解決できないタンパク質または高分子の動的領域をモデル化するために使用できることです。

一般に、この方法に不慣れな人は、SAXSデータの品質を適切に評価する方法を学ぶのに最初は苦労するでしょう。手順を開始するには、Nsa1発現プラスミドを適切な大腸菌発現株に変換します。細胞を培養し、Nsa1の発現を誘導し、細胞を回収します。

細胞を25ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤1錠を含む4°Cに予冷します。細胞を摂氏4度で7分間超音波処理し、2秒オン、2秒オフのサイクルで行います。次に、ライセートを26、900倍の重力で摂氏4度で45分間遠心分離します。

遠心分離中に混合物が凍結しないことを確認してください。次に、10 mLの固定化コバルトアフィニティー樹脂を含む重力フローカラムを溶解バッファーで平衡化します。清澄化したライセートをカラムにロードし、4°Cで樹脂中を流します。

次に、100mlの溶解バッファーでレジンを2回洗浄します。20 mLの溶出バッファーを含むカラムからNsa1を溶出します。4〜15%SDS-PAGEゲルでエルエールの15mclアリコートを実行し、タンパク質の溶出を確認します。

次に、1 mg / mlのTEVプロテアーゼストック溶液1 mlをエルエールに加えます。エルエールを摂氏4度で一晩インキュベートし、MBPタグを取り除きます。その後、10キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用して、MBP切断されたNsa1を約5mlまで濃縮し、濃縮しすぎないように注意してください。

Buffer A.で事前に平衡化したゲルろ過カラムで濃縮タンパク質を精製します。この手順の重要なステップの1つは、精製中にすべての凝集体を確実に除去することです。凝集体は、結晶化およびSAXSデータの取得と分析を妨げます。各カラムフラクションの 15mcl サンプルを SDS-PAGE で分析し、MBP と Nsa1 の分離を確認します。

Nsa1 分数を結合します。10キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用して、組み合わせた画分を約8mg / mlに濃縮します。289ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質濃度を計算します。

直ちにタンパク質分解スクリーニングおよび結晶化試験に進んでください。タンパク質分解性スクリーニングを開始するには、α-コモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カパイン、セプチリシン、およびエンドプロテイナーゼGluCの1 mg/mLストック溶液を調製します。各ストック溶液を希釈バッファーで1:10、1:100、および1:1, 000に希釈します。

Nsa1の8mg/ml溶液をバッファーAで1mg/mlに希釈し、プロテアーゼ希釈ごとに1mclのプロテアーゼ希釈液と9mclの希釈タンパク質ストックを併用します。溶液を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、10mclの2x SDS-PAGEサンプルを各溶液にバッファーとして加え、溶液を摂氏95度で5分間加熱します。

4〜15%SDS-PAGEゲルで溶液を解析し、プロテアーゼ耐性ドメインを同定します。プロテアーゼ不安定領域を除外する切り捨てられた発現コンストラクトを作成します。これらのタンパク質を発現および精製して、結晶化を最適化します。

Nsa1タンパク質のSAXSデータをある範囲の濃度で取得した後、末端シェルファイルのパスをデータを含むディレクトリに設定します。次に、解析ソフトウェアを起動します。散乱曲線を解析ソフトウェアに読み込みます。

自動 RG ツールを使用して、各カーブの回転半径と前方散乱強度を決定します。次に、各散乱曲線のKratkyプロットを生成して、コンパクト性の程度を決定します。自律ツールを使用して、回転半径の 3x の開始最大寸法を使用して、各曲線のペアワイズ分布関数を計算します。

最大次元を最適化して、実験的な散乱曲線と一致する滑らかなペアワイズ分布関数曲線を取得します。濃度間で構造パラメータを比較して、放射線損傷や濃度依存の影響がないことを確認します。旋回半径、分子量、前方散乱、濃度シリーズ全体のペア距離分布関数など、主要な構造パラメータを比較することが重要です。

そして、それは放射線による損傷や濃度の影響がないことを確認するためです。次に、開始タンパク質結晶構造ファイル、標的タンパク質配列ファイル、および実験用SAXSデータファイルを使用して、アンサンブル最適化法のユーティリティを実行します。開始結晶構造ファイルとアンサンブル ファイルのカイ二乗値を比較して、アンサンブル モデルが実験データによく適合するかどうかを判断します。

分子可視化ソフトウェアを使用して、生成された配座異性体と結晶構造をオーバーレイします。配座異性体の総数と、散乱曲線に寄与する各配座異性体の割合に注意してください。Nsa1のプロテアーゼ不安定性C末端のタンパク質分解性切断により、斜方晶が形成されました。

新たに精製されたNsa1は立方晶を形成したが、不安定なc末端の電子密度はまだ結晶構造に欠けていた。Nsa1のn末端7ブレーションベータプロペラWD-40ドメインは、両方の構造で良好に分解された。Nsa1 WD-40ドメインだけでは、実験的なSAXSデータには適していませんでした。

剛体モデリングとC末端のアビリューシャル再構築の組み合わせにより、フィット感が大幅に向上しました。アンサンブルモデリングにより、適合度がさらに大幅に向上し、溶液中のC末端テールの確認サンプリングが明らかになりました。SAXSは低解像度の構造技術ですが、X線結晶構造解析などの高解像度構造研究を非常によく補完します。

そのため、柔軟な領域と無秩序な領域をモデル化できます。高分子のSAXSデータを収集・解析することで、このビデオを見た後、X線結晶構造解析とSAXSの両方によって、秩序と無秩序な領域からなるタンパク質の構造を解く方法について、確認上の変化を理解し始めることができます。