Name: S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶX線結晶解析とSAXSを組み合わせたハイブリッド構造解析法。S. cerevisiae由来Nsa1の非構造化領域をモデル化し、タンパク質の動的構造と機能を解明する手法です。

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回折データは、東南地域共同アクセス (SER 猫) チーム 22 ID および 22 BM ビームラインの高度な光子ソース (AP)、アルゴンヌ国立研究所で収集されました。SIBYLS ビームライン事前光ソース (ALS)、ローレンス ・ バークレー国立研究所での小角 x 線散乱データを収集しました。リモート データの収集と処理の SIBYLS ビームラインでのスタッフに感謝したいと思います。タンパク質ドメインの境界を決定する助けのための環境健康科学の国立研究所 (NIEHS) 質量分析法による研究およびサポート グループに感謝しております。この作品によって、米国国立研究所の健康学内研究プログラムをサポートされていました米国立環境健康科学 (NIEHS) 研究所 (r. e. s. に ZIA ES103247) とカナダ保健研究 (機構、M.C.P に 146626) 機構。AP の使用は、米国エネルギー省、科学局、契約番号の下で基本的なエネルギー科学のオフィスによって支えられました。W-31-109-Eng-38。高度な照明のソース (ALS) の使用はディレクター、科学局、事務所のエネルギーの基礎科学、契約番号の下で米国エネルギー省によって支えられました。デ-AC02-05CH11231。追加サポート SIBYLS 小角 x 線散乱ビームラインは、国立衛生研究所からなるプロジェクト ミノス (R01GM105404) とハイエンド計装グラント S10OD018483。我々 もこの原稿の彼らの重要な読書のアンドレア ・月と博士サラ アンドレスに感謝したいと思います。

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このプロトコルを使用すると、酵母から組換え Nsa1 は、x 線回折・小角 x 線散乱による構造研究に対して生成されました。Nsa1 は、ソリューションの行儀と複数の結晶形に結晶化されました。これらの結晶の最適化、中に Nsa1 の C 末端がプロテアーゼ分解に敏感であったことが発見されました。高解像度 Nsa1 の柔軟な C 末端が結晶の充填を妨げるために、斜方晶系の結晶形を Nsa1、可能性の C 末端切り捨てのバリエーションに複製のみでした。Nsa1 の構造の高分解能 x 線結晶学によって解決されたが、それが順序付けされていないので、C 末端をいずれかの結晶形の構築できませんでした。しかし結晶学はいくつかの制限を持って任意のメソッドと同様、結晶構造解析、Nsa1 のサイズは約高分子の原子分解能の構造を決定するためプレミア手法です。結晶学の主要な制限の 1 つは蛋白質40,41の無秩序領域を解決することができないことです。
Nsa1 の C 末...

リボソームは、mRNA にすべての生きている細胞の蛋白質翻訳の重要な役割を果す大きいリボ核蛋白質マシンです。リボソームはリボソーム生合成1,2,3,4と呼ばれる複雑なプロセスで作り出される 2 つのサブユニットで構成されます。真核生物のリボソームの組み立ては不可欠なリボソーム アセンブリ要因2,3、5の何百もの援助に依存しています。Nsa1 (Nop7 には 1 が関連付けられている)、リボソーム大サブユニット6, の生産のために特に必要がある真核生物のリボソーム アセンブリ要因であり、WD リピートとして知られているを含む 74 (WDR74) より高い有機体7で。マウス8で胚盤胞の形成のため必要となる WDR74 が示されているし、WDR74 プロモーターよく癌細胞9で変異します。ただし、関数とリボソームの組み立ての Nsa1/WDR74 の正確なメカニズムはまだ主として知られています。まず真核生物のリボソーム成熟中に Nsa1/WDR74 の役割を明らかにするため、x 線回折・小角 x 線散乱法 (SAXS)10をなど複数の構造解析は実行されました。
X 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) 分光法、電子顕微鏡、小角 x 線散乱は、高分子の構造を勉強してすべての重要な手法です。サイズ、形状、可用性、および安定性に適した特定の高分子が最高になる構造生物学方式高分子の影響を受けて、しかしいわゆる「ハイブリッド」アプローチを通じて複数のテクニックを組み合わせることになっている、ますます有益なツール11。特に x 線回折・小角 x 線散乱は、高分子12の構造決定のための強力かつ相補的な方法です。
結晶学小分子から、リボソームなど大規模な細胞機械装置に至るまで高解像度の原子構造を提供し、蛋白質等の生体機能の理解に多くの進歩をもたらした高分子13。さらに、構造ベース創薬の発見と開発の14に重要なディメンションを追加する計算の方法によって分子ドッキングの結晶構造のパワーを活用します。柔軟で乱れたシステムにもかかわらず、広範な応用結晶学結晶の充填が妨害されたり、電子密度マップを完了できない場合がありますので、質の悪いを評価するために挑戦しています。逆に、小角 x 線散乱、ソリューション ベースと低解像度構造アプローチ天然変性タンパク質12,,1516乱れたループ テルミニからまで柔軟なシステムを記述することが可能です。粒子サイズ12の広い範囲と互換性がある考慮した、小角 x 線散乱は結晶構造の研究で対処することができます生物の質問の範囲を拡大すると相乗的に働くことができます。
続いて、機能ですが柔軟な C 末端は x 線結晶構造解析法に従う well-structured WD40 ドメインが含まれているために、Nsa1 はハイブリッド構造的アプローチに適しています。次に、クローニング、表現、およびハイブリッド x 線結晶構造解析により構造決定の出芽酵母Nsa1 ・小角 x 線散乱の浄化のためのプロトコル。このプロトコルは、秩序・無秩序領域の組み合わせで構成されていますが他の蛋白質の構造を勉強する合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 parallel vector</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>我々は、N末端Hisタグ(pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiaeゲノムDNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td>を含むpMBP2の改変版を使用した<><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 and various truncations</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenomethionine</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG、ジオキサンフリー</td><td>プロメガ</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カレドン ラボラトリー・ケミカルズ</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝液、1 M pH7.5</td><td>KD メディカル</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M イミダゾール、pH 8.0</td><td>テクノバ</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>タロン アフィニティー樹脂</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 遠心フィルター (MWCO 10K)</td><td>ミリポア</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 プレップグレードゲルろ過カラム</td><td>GE-Healthcare 28989335</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIEHS Protein Expression</td><td>NCIが提供するコア発現プラスミド (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization, Proteolytic Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリスタルスクリーン</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルスクリーン2</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>ソルトRxハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>インデックススクリーン</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>PEG/イオンスクリーン</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>分子寸法</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>ウィザード 沈殿物 相乗効果</td><td>分子寸法</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96 ウェル 3 ドロップ UVP シッティング ドロップ プレート</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3 インチ ワイド クリスタル クリア シーリング テープ</td><td>ハンプトン リサーチ</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>プロティエース キット</td><td>ハンプトン リサーチ</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>分子寸法</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>分子寸法</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/水酸化ナトリウム pH 7.5</td><td>分子寸法</td><td>MD2-011-</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム 三塩基性</td><td>分子寸法</td><td>MD2-100-127</td> 22 mm x 0.22 <td></td></tr><tr><td>mm シリコン処理カバースライド</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>シーラント付き 24 ウェルプレート (VDX プレートシーラント)</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mMマウントナイロンループ(0.05 mm〜0.5 mM)</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-945、HR4-947、HR4-970、HR4-971</td><td></td></tr>シード<tr><td>ビーズキット</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>磁気結晶キャップハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td>HR4-779</td><td></td></tr>磁気<tr><td>クライオワンド</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>極低温フォームデュワー</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルパックシステム</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>フルスカート96ウェルクリアプレート</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMatシーリングマット</td><td>VWR10011-130</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite 分光光度計</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/WebsitesHKL2000</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Otwinoski and Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo and Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&ouml;ディンガー、LLC。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov and Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

s. 酵母から nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

リボソーム アセンブリ因子 Nsa1酵母 (出芽酵母)からのフルレングスの構造の決定は、乱れたため挑戦とプロテアーゼ活性タンパク質の C 末端。本稿では、x 線回折・小角 x 線散乱による構造解析出芽酵母から遺伝子組換え Nsa1 を浄化する方法について説明します。Nsa1 のよく整理された N 末端 WD40 ドメインの構造を解決するために x 線結晶解析を用いて、小角 x 線散乱ソリューションの Nsa1 の C 末端の構造を解決する使用だった。散乱データのソリューションは、ソリューションでフルレングスの Nsa1 から採取しました。WD40 ドメインの高分解能結晶構造から算出した理論の散乱振幅と剛体と第一原理計算モデリングの組み合わせが Nsa1 の C 末端を明らかにし。このハイブリッド アプローチを通じて、全体蛋白質の第四紀構造が再建されました。紹介した方法は、他の蛋白質の構造化および非構造化ドメインのミックスの作曲のハイブリッド構造決定の一般的に適用される必要があります。

Nsa1 は、出芽酵母ゲノム DNA の増幅と subcloned MBP と TEV プロテアーゼ サイト続いて N ターミナル 6 x ヒスチジン親和性タグを含むベクトルに PCR をだった。Nsa1 は大腸菌BL21(DE3) 細胞に変換され、IPTG 誘導および 25 ° c 一晩 (図 1 a) 成長タンパク質発現の高収率が得られました。Nsa1 は、固定化コバルト親和性樹脂、TEV プロテアーゼと MBP の開裂によって続いて、サイズ排除クロマトグラフィー (図 1 b) 最終的に解決のアフィニ ティー精製をだった。Nsa1 を含むサイズ排除クロマトグラフィーから分数をプール、8 mg/mL に濃縮し、結晶化ロボットによる結晶化試験に使用されます。初期のスパース マトリックス液晶画面 (図 2 a) Nsa1、立方晶と斜方晶系の 2 つの異なる結晶...

このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1 の精製をについて説明し、他のタンパク質のハイブリッド構造解析の適用両方を含む注文し、無秩序なドメイン。

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

この手順の全体的な目標は、X線結晶構造解析と小角X線散乱の両方によるハイブリッド構造解析のために、秩序ドメインと無秩序ドメインの混合物で構成される組換えタンパク質を作製することです。この方法は、すべての溶液の決定がタンパク質の構造を維持するように生物学的機能を置くことに関する構造生物学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、X線結晶構造解析では解決できないタンパク質または高分子の動的領域をモデル化するために使用できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、SAXSデータの品質を適切に評価する方法を学ぶのに最初は苦労するでしょう。手順を開始するには、Nsa1発現プラスミドを適切な大腸菌発現株に変換します。細胞を培養し、Nsa1の発現を誘導し、細胞を回収します。細胞を25ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤1錠を含む4°Cに予冷します。細胞を摂氏4度で7分間超音波処理し、2秒オン、2秒オフのサイクルで行います。次に、ライセートを26、900倍の重力で摂氏4度で45分間遠心分離します。遠心分離中に混合物が凍結しないことを確認してください。次に、10 mLの固定化コバルトアフィニティー樹脂を含む重力フローカラムを溶解バッファーで平衡化します。清澄化したライセートをカラムにロードし、4°Cで樹脂中を流します。次に、100mlの溶解バッファーでレジンを2回洗浄します。20 mLの溶出バッファーを含むカラムからNsa1を溶出します。4〜15%SDS-PAGEゲルでエルエールの15mclアリコートを実行し、タンパク質の溶出を確認します。次に、1 mg / mlのTEVプロテアーゼストック溶液1 mlをエルエールに加えます。エルエールを摂氏4度で一晩インキュベートし、MBPタグを取り除きます。その後、10キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用して、MBP切断されたNsa1を約5mlまで濃縮し、濃縮しすぎないように注意してください。Buffer A.で事前に平衡化したゲルろ過カラムで濃縮タンパク質を精製します。この手順の重要なステップの1つは、精製中にすべての凝集体を確実に除去することです。凝集体は、結晶化およびSAXSデータの取得と分析を妨げます。各カラムフラクションの 15mcl サンプルを SDS-PAGE で分析し、MBP と Nsa1 の分離を確認します。Nsa1 分数を結合します。10キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用して、組み合わせた画分を約8mg / mlに濃縮します。289ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質濃度を計算します。直ちにタンパク質分解スクリーニングおよび結晶化試験に進んでください。タンパク質分解性スクリーニングを開始するには、α-コモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カパイン、セプチリシン、およびエンドプロテイナーゼGluCの1 mg/mLストック溶液を調製します。各ストック溶液を希釈バッファーで1:10、1:100、および1:1, 000に希釈します。Nsa1の8mg/ml溶液をバッファーAで1mg/mlに希釈し、プロテアーゼ希釈ごとに1mclのプロテアーゼ希釈液と9mclの希釈タンパク質ストックを併用します。溶液を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、10mclの2x SDS-PAGEサンプルを各溶液にバッファーとして加え、溶液を摂氏95度で5分間加熱します。4〜15%SDS-PAGEゲルで溶液を解析し、プロテアーゼ耐性ドメインを同定します。プロテアーゼ不安定領域を除外する切り捨てられた発現コンストラクトを作成します。これらのタンパク質を発現および精製して、結晶化を最適化します。Nsa1タンパク質のSAXSデータをある範囲の濃度で取得した後、末端シェルファイルのパスをデータを含むディレクトリに設定します。次に、解析ソフトウェアを起動します。散乱曲線を解析ソフトウェアに読み込みます。自動 RG ツールを使用して、各カーブの回転半径と前方散乱強度を決定します。次に、各散乱曲線のKratkyプロットを生成して、コンパクト性の程度を決定します。自律ツールを使用して、回転半径の 3x の開始最大寸法を使用して、各曲線のペアワイズ分布関数を計算します。最大次元を最適化して、実験的な散乱曲線と一致する滑らかなペアワイズ分布関数曲線を取得します。濃度間で構造パラメータを比較して、放射線損傷や濃度依存の影響がないことを確認します。旋回半径、分子量、前方散乱、濃度シリーズ全体のペア距離分布関数など、主要な構造パラメータを比較することが重要です。そして、それは放射線による損傷や濃度の影響がないことを確認するためです。次に、開始タンパク質結晶構造ファイル、標的タンパク質配列ファイル、および実験用SAXSデータファイルを使用して、アンサンブル最適化法のユーティリティを実行します。開始結晶構造ファイルとアンサンブル ファイルのカイ二乗値を比較して、アンサンブル モデルが実験データによく適合するかどうかを判断します。分子可視化ソフトウェアを使用して、生成された配座異性体と結晶構造をオーバーレイします。配座異性体の総数と、散乱曲線に寄与する各配座異性体の割合に注意してください。Nsa1のプロテアーゼ不安定性C末端のタンパク質分解性切断により、斜方晶が形成されました。新たに精製されたNsa1は立方晶を形成したが、不安定なc末端の電子密度はまだ結晶構造に欠けていた。Nsa1のn末端7ブレーションベータプロペラWD-40ドメインは、両方の構造で良好に分解された。Nsa1 WD-40ドメインだけでは、実験的なSAXSデータには適していませんでした。剛体モデリングとC末端のアビリューシャル再構築の組み合わせにより、フィット感が大幅に向上しました。アンサンブルモデリングにより、適合度がさらに大幅に向上し、溶液中のC末端テールの確認サンプリングが明らかになりました。SAXSは低解像度の構造技術ですが、X線結晶構造解析などの高解像度構造研究を非常によく補完します。そのため、柔軟な領域と無秩序な領域をモデル化できます。高分子のSAXSデータを収集・解析することで、このビデオを見た後、X線結晶構造解析とSAXSの両方によって、秩序と無秩序な領域からなるタンパク質の構造を解く方法について、確認上の変化を理解し始めることができます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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学ぶX線結晶解析とSAXSを組み合わせたハイブリッド構造解析法。S. cerevisiae由来Nsa1の非構造化領域をモデル化し、タンパク質の動的構造と機能を解明する手法です。

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

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