Name: 生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学ぶ、生きたアフリカツメガエル胚の単一細胞から代謝物をマイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析法で迅速に分析する方法です。最小侵襲で細胞代謝の動態を解明し、発生生物学研究に貢献します。

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この作品は (P.N.) に健康補助金 GM114854 の国家機関によってサポートされて、(P.N.) に CA211635、アーノルドとメイベル ベックマン財団ベックマン若い調査官 (P.N.) に付与 (P.N.) にデュポン若い教授賞大量のアメリカの社会分析研究賞 (P.N.) を (R.M.O. および E.P.P.) にコスモス クラブ財団奨学金。意見と結論この書において表明のだけは、著者の資金源の公式見解を必ずしも表さない。

著者が明らかに何もありません。

マイクロ プローブ MS-CE は、ライブ、自由に開発の胚の単一細胞における代謝物の直接評価できます。アプローチの中心に 2 つの技術的なサブコンポーネント、すなわちその場で毛細管特定と高感度 CE ESI さんに比べて細胞解離、毛細管特定高速動作 (5 分対数秒という利点があります。/郭清による細胞)、胚、および開発の後の段階でより小さいセルにスケーラビリティの複雑な三次元形態との互換性。解離とは異なりマイクロ プローブ サンプリングはそのまま胚の他のセル以降の分析のため。興味深いことに, microsampled 細胞が分裂し続ける, 細胞分化.の長期的な研究の可能性を高めるプローブの先端のサイズを制御する機能は、プローブ細胞およびゼブラフィッシュ、マウスなど、他のモデル生物を用いた発達過程における代謝の役割を研究するための汎用性の高いツールとして CE ESI MS もできます。信頼できる結果を保証するために、興味のセルは、正確に、正確に、かつ一貫して識別にし、サンプリングが重要です。吸引 (例えば、毛細管の寸法、圧力、および時間) の実験的パラメーターは、セルの所望の部分をサ...

萌芽期の開発の包括的な理解には、発展途上の生物のすべてのセルに展開するすべての分子変化の特性評価が必要です。単一細胞トランスクリプトーム1開発システム2,3, かなり少ないの深い測定がより小さい分子のスイートについて知られている分子の増幅による次世代シーケンスが可能タンパク質と、特に、代謝産物などを含む単一の胚細胞で生産される (分子量 &#60; 〜 1,500 Da)。組み込みと外因性のイベントに速い動的応答、メタボロームをセルの分子状態の強力な記述子として提供しています。したがって、単一細胞メタボロームは初期胚における細胞多様性の空間的で、一時的な開発を追跡する、機能研究のための新しい分子を識別する可能性を発生させます。しかし、これらの分子の分子増幅せず、メタボロームの検出要求卓越した感度の代謝物質の分析のための選択技術である質量分析法 (MS) を使用します。
単一セルの MS は (参照してくださいレビュー 4,5,6,7,8,9 単一細胞における代謝物の測定に十分な感度と技術のコレクション ,,1011,12,13,14,15)。細胞の再現性の高いサンプリングと代謝産物の効率的な抽出成功した単一細胞における代謝物の検出に不可欠です。アフリカツメガエル胚から細胞を特定の細胞解離は、低分子化合物やペプチド16の特性を可能にしました。他のアプローチは、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) MS を用いた検出続く個々 の生きているセルのサンプルをマイクロ ピペットを採用しています。たとえば、代謝物は流体力顕微鏡20、その他技術21、間、単一のプローブ19, 圧力プローブ18単一セル ビデオ MS17によって植物や哺乳類細胞で測定しました。 22,23,24。さらに、単一セルの MS ワークフローにイオン化する前に化学分離の定款は効率的にメタボローム、したがって検出前にイオン生成中に潜在的な干渉を軽減することを簡素化します。重要なは、分離はまた分子の同定を支援する化合物に固有の情報を提供します。キャピラリー電気泳動 (CE) は、単一切り裂かれた25,26または microsampled27ニューロン、ニューロン表現型の小分子の違いをキャプチャの代謝物を検出するために使用されています。我々 は最近、ESI タンデムアフリカツメガエル16,28の初期胚から切除した個々 の細胞における代謝物の何百ものトレース レベルの検出を有効にするには、MS に CE を適応しました。これらの研究は驚くべき代謝開発の初期段階に胚細胞の違いを明らかに、不明な発達影響16以前と代謝産物の発見につながった。
ここでは、直接マイクロ プローブによる単一細胞 CE ESI MS29,30を使用して生きている脊椎動物の胚の単一細胞における代謝物の検出を有効にするプロトコルを提供します。選択モデル有機体はセル 32 にまでの制限 8 X. laevis胚のアプローチが開発、その他各種モデル生物の後の段階に適用されるも。このプロトコルは、識別された細胞その場で形態学的に複雑な胚での ~ 10 nL 部分を吸引するのに高解像度イメージング システムによる多軸並進制御の指導の下でのシャープの毛細血管を使用します。このプローブは、小さいセルまで拡張可能、胚における細胞系譜を追跡するために十分な速さである数秒以内に、動作します。極の抽出や極冠小分子、代謝産物など 4 〜 5 で収集したサンプル由来のペプチドの後ハイフン ESI 質量分析計と特注の CE プラットフォームで得られた抽出液の nL を分析 ~ 10 μ L 抽出ソリューション。CE ESI MS プラットフォームの構築と運用は、他の場所で説明されているプロトコルに基づいています。31,32コーアクシャル CE esi は他の場所で説明されているように構築されます。31 4-5 ログ順ダイナミック レンジ (相対28,29,30 で定量化のための機能を備えたトレース レベルの感度を達成するためにコーン ジェット スプレー政権でこのプラットフォームを維持します。または絶対16)。CE ESI MS プラットフォームが 10 のテスト範囲で定量で 8% 相対標準偏差 (RSD) で検出下限 60 amol を提供しています小さな分子の16 X の内因性代謝物の特性を十分である 1 μ M に nM。学細胞。Microprobed 細胞は胚開発30、細胞代謝の時間的、空間的分解解析を可能にするにつれて分裂し続けます。確かに、単一セル MS-CE は代謝の違いの背腹軸16,29、動物植物16、および左右28発達軸だけでなく、セルを占有するセルを検索する使用ことができます。X. laevis30の共通前駆細胞から神経組織運命背側系統を形成します。ここで説明されているプロトコルは、生体分子の広範な配列に適用されることを期待してX. laevis胚30のさまざまな発達段階で個々 の萌芽期細胞の代謝の違いを照会するほか、単一細胞 microsampled 細胞やモデル生物の他の種類と同様に、萌芽期の開発のさまざまな段階から。さらに、分離や生体分子の特性の非常に小さいサンプルと互換性のある別のプラットフォームを使用できますが、特定のため、プローブが使用できます。

<table><tbody><tr><td>胚培養用試薬Reagents for Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>システイン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>代謝物抽出溶媒</強/アセ</td>トニトリル><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>メタノール(LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>水(LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>CE-ESI-MSの溶媒と標準</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギ酸(LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>メタノール(LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>水(LC-MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>アセチルコリン塩化</td>物<td>アクロス有機159170050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Microprobe製造セットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸毛細血管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>細かい鋭利な鉗子: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>耐腐食性およびオートクレーブ可能。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microprobeサンプリングセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>振動的に絶縁されている必要があります。</td></tr><tr><td>イルミネーター(例:グースネックス</td>、<td>ニコン、</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>、マイクロインジェクター</td><td>、ワーナーインスツルメンツ、ハンデム、CT</td>、<td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>、トランスファーピペット(プラスチック、使い捨て)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 60 mm & 80 mm</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製パスツールピペット(ホウケイ酸、使い捨て)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>CE-ESI-MS Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高電圧電源</td><td>スペルマン</td><td>CZE1000R</td><td>HVPSは、パソコンで生成された低電圧プログラムを使用してリモート制御できます。注意: 高電圧は感電の危険をもたらします。すべての接続部品は、ユーザーが誤って露出するのを防ぐために、接地するか慎重にシールドする必要があります。</td></tr><tr><td>シリンジポンプ (2)</td><td>ハーバード装置</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>4.5倍以上の倍率が可能な実体顕微鏡で、CE-ESIインターフェースの噴霧モードを監視するための照明器を装備しています。</td></tr><tr><td>XYZトランスレーションステージ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZトランスレーションステージ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>このプラットフォームは、流体力学的な注入によりナノリットル量のサンプルを分離キャピラリーにロードし、CE用のBGEを供給することができます。この作業で説明した両方のインターフェイスは、6&ndash を注入することができました。1 mの分離キャピラリーに1分以内に10 nL</td></tr>のサンプル <tr><td>ステンレス製サンプルバイアル</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td>の</tr><tr><td>ステンレス製BGEバイアル</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td>の</tr><tr><td>フューズドシリカキャピラリー(40 & micro;M/105 & マイクロ;m ID / OD;100 cm)</td><td>ポリミクロテクノロジー</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>溶融シリカキャピラリー(75 &M/360 & マイクロ;m ID / OD;100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>鈍い先端を備えたステンレス鋼エミッター (130/260 & マイクロ;m ID/OD)</td><td>ハミルトン(株)</td><td>21031A</td><td>パフォーマンスを向上させるには、エミッター先端をレーザー切断して微調整します。</td></tr><tr><td>シリンジ(気密):500 - 1000 &micro;L</td><td>ハミルトン株式会社</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>デジタルマルチメーター</td><td>フルーク</td><td>117</td><td></td></tr><tr><td>高分解能質量分析計</td><td>ブルカー・ダルトニクス</td><td>Maxis Impact HD</td><td>ESI用に構成された大気圧インターフェースを装備した高分解能タンデム質量分析計</td></tr> 質量<tr><td>分析計校正用チューニング混合物</td><td>アジレント技術</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>データ分析ver. 4.3 ソフトウェア</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ancillary Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum コンセントレーター 4&ndash;10°C;C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 >C)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫(-80°C;C)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>ベンチマーク</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

単一細胞における小分子の定量化は、萌芽期の開発の根底にある基本的なプロセスを理解の新たな可能性を発生させます。異なるセルのサイズは、敏感な選択的、定量的、堅牢で、スケーラブルな特に有効にする単一セル調査で直接ライブ胚、分析の新しいアプローチが必要です。ここでは、自由に南アフリカ爪カエル (アフリカツメガエル)、細胞および進化の生物学の強力なモデルの胚の開発に単一細胞における代謝の場解析を可能にするプロトコルを提案する.このアプローチは、隣接する細胞そのままその後の分析のための胚の単一の識別されたセルからの定義された部分を吸引するキャピラリー マイクロ プローブを使用します。高解像度のタンデム質量分析計を結合マイクロ キャピラリー電気泳動エレクトロ スプレー イオン化 (ESI-CE) インターフェイスによって収集されたセルの内容が分析されます。このアプローチは様々 なセル サイズにスケーラブルな成長の胚の複雑な三次元構造と互換性があります。たとえば、そのマイクロ プローブによる単一細胞 MS-CE により繰り広げられる前駆細胞は胚の開発の間に子孫を生じ、代謝細胞の多様性の解明を紹介します。細胞・発生生物学、以外にもここで説明した単一細胞解析プロトコルは、他のセル サイズ、セル種類、または動物モデルに従う。

最近マイクロ プローブによる単一細胞を用いて自由にアフリカツメガエル胚29,30の開発に個々 の特定細胞代謝産物を特徴付ける CE ESI MS。マイクロ プローブにより、高速 (~ 5 sec/セル)、~ 10 の場で吸引個々 のセル、同じセルの複数の願望またはライブ胚 (図 1 b) の同じまたはそれ以降の段階でいくつかの異なる細胞から nL。適当な溶媒を使用して吸気の携帯電話コンテンツが抽出され、代謝物はそれから分かれている特注の CE esi を使用してイオン化しアプローチ (削除後 〜 300 非冗長代謝物の信号が得られますさん Typically によって検出されました。同位体ピークをクラスターと) 各セルから。分離は、図 2 aの分子の選択例示です。移行時間に基づく小型の極性代謝産物として...

高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々 のセルの小さな部分の高速の場サンプリングを有効にする手順を述べる。特注の単一セルのキャピラリー電気泳動と質量分析プラットフォームを用いた胚を住んでいます。

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

このプロトコルの全体的な目標は、in situマイクロサンプリングキャピラリー電気泳動質量分析によって、発生中の胚の生細胞中の代謝産物を特徴付けることです。この方法は、生きた発生中の胚における単一細胞の代謝を直接解析できるため、細胞および発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高速で、さまざまな細胞サイズに拡張可能であり、生きた胚の個々の細胞の低侵襲サンプリングを可能にすることです。胚が比較的速く発達し、特注のキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化装置が使用されるため、一部のステップは習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順は、1X Steinbergの溶液1つに2%アガロースを調製することから始めます。まだ液体のまま、60ミリメートルのシャーレの底に溶液をコーティングします。アガロースゲルが冷えて固まったら、6インチのパスツールピペットの端をボールになるまで火にかけます。次に、加熱した端に軽く触れて、アガロースに約1ミリメートルの深さの5〜10個のウェルを刻印します。テーパーチップマイクロピペットを作製するには、まず、テキストプロトコルの設定を使用して、Flaming/Brownタイプのキャピラリープーラーでホウケイ酸キャピラリーをプルします。次に、引っ張ったマイクロピペットの先端を一対の細い鋭利な鉗子で切断し、毛細管先端の外径約20ミクロンを得ます。このステップを実体顕微鏡で行い、精度と再現性を高めます。ゴナドトロピン誘発性成体xenopus laevisの自然交配を通じて、またはテキストプロトコルで参照されているように体外受精を介して胚を取得します。胚が2細胞段階に切断され始めると、最初に胚をデゼリー溶液に2分間休ませることにより、胚を囲むゼリーコートを取り除きます。次に、胚がコレクション皿の表面に付着するのを防ぐために、さらに2分間それらを静かに回転させます。皿の中身を清潔なビーカーにそっと注ぎ、ビーカーから脱ゼリー溶液をすばやくデカントします。すぐに卵を0.1倍のスタインバーグ溶液で覆い、残りの脱ゼリー溶液を洗い流します。穏やかに渦巻き、次に溶液をデカントします。この手順を4回繰り返して、胚を完全に洗います。脱脂した胚をペトリ皿の1X Steinberg溶液に移します。プレート内の混雑を最小限に抑えるために、100ミリメートル皿あたり約100個の胚を配置します。2細胞段階での切断胚を別の皿に選別し、ステレオタイプの色素沈着が背側腹側アクセスを自信を持ってマークし、硫酸塩マップを確立します。中矢状面を示す最初の切断溝が、暗く色素沈着した動物の引っ張りと軽く色素沈着した動物の引っ張りを二分し、2つの半分が鏡像になるようにすることで、胚を正しく切断します。次に、作製したマイ

microprobe-capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-for-single

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アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

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発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

このプロトコルは、揮発性塩溶液洗浄、急速液体窒素急冷、凍結乾燥、および-8°C保存を組み合わせることにより、単一細胞質量分析(SCMS)用の細胞代謝産物を保存することを目的としています。これは、液体窒素の急冷が代謝産物プロファイルを維持するために不可欠である一方で、代謝の変化を防ぐために長期の冷蔵保管を最小限に抑える必要があることを示しています。...

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学ぶ、生きたアフリカツメガエル胚の単一細胞から代謝物をマイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析法で迅速に分析する方法です。最小侵襲で細胞代謝の動態を解明し、発生生物学研究に貢献します。

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析法

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