生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

このプロトコルの全体的な目標は、in situマイクロサンプリングキャピラリー電気泳動質量分析によって、発生中の胚の生細胞中の代謝産物を特徴付けることです。この方法は、生きた発生中の胚における単一細胞の代謝を直接解析できるため、細胞および発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高速で、さまざまな細胞サイズに拡張可能であり、生きた胚の個々の細胞の低侵襲サンプリングを可能にすることです。

胚が比較的速く発達し、特注のキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化装置が使用されるため、一部のステップは習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順は、1X Steinbergの溶液1つに2%アガロースを調製することから始めます。まだ液体のまま、60ミリメートルのシャーレの底に溶液をコーティングします。

アガロースゲルが冷えて固まったら、6インチのパスツールピペットの端をボールになるまで火にかけます。次に、加熱した端に軽く触れて、アガロースに約1ミリメートルの深さの5〜10個のウェルを刻印します。テーパーチップマイクロピペットを作製するには、まず、テキストプロトコルの設定を使用して、Flaming/Brownタイプのキャピラリープーラーでホウケイ酸キャピラリーをプルします。

次に、引っ張ったマイクロピペットの先端を一対の細い鋭利な鉗子で切断し、毛細管先端の外径約20ミクロンを得ます。このステップを実体顕微鏡で行い、精度と再現性を高めます。ゴナドトロピン誘発性成体xenopus laevisの自然交配を通じて、またはテキストプロトコルで参照されているように体外受精を介して胚を取得します。

胚が2細胞段階に切断され始めると、最初に胚をデゼリー溶液に2分間休ませることにより、胚を囲むゼリーコートを取り除きます。次に、胚がコレクション皿の表面に付着するのを防ぐために、さらに2分間それらを静かに回転させます。皿の中身を清潔なビーカーにそっと注ぎ、ビーカーから脱ゼリー溶液をすばやくデカントします。

すぐに卵を0.1倍のスタインバーグ溶液で覆い、残りの脱ゼリー溶液を洗い流します。穏やかに渦巻き、次に溶液をデカントします。この手順を4回繰り返して、胚を完全に洗います。

脱脂した胚をペトリ皿の1X Steinberg溶液に移します。プレート内の混雑を最小限に抑えるために、100ミリメートル皿あたり約100個の胚を配置します。2細胞段階での切断胚を別の皿に選別し、ステレオタイプの色素沈着が背側腹側アクセスを自信を持ってマークし、硫酸塩マップを確立します。

中矢状面を示す最初の切断溝が、暗く色素沈着した動物の引っ張りと軽く色素沈着した動物の引っ張りを二分し、2つの半分が鏡像になるようにすることで、胚を正しく切断します。次に、作製したマイクロピペットを多軸マイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロピペットをマイクロインジェクターに接続します。

プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、8細胞胚のうち約5個を吸引し、0.5X Steinbergの溶液が入ったサンプリングディッシュに移します。ヘアループを使用して、サンプリングする胚を個々のウェルに配置し、正しく同定された目的の細胞がマイクロプローブに約90度の角度で向いていることを確認します。実体顕微鏡下で作業しながら、マイクロピペットの先端を生胚内の同定された単一細胞に導きます。

マイクロインジェクターを使用してマイクロキャピラリーに負圧パルスを印加することにより、細胞の内容物の所望の部分を引き出します。マイクロプローブを細胞から静かに引っ込め、その先端をマイクロサイズのバイアルで冷やした4マイクロリットルの代謝物抽出溶媒に移します。次に、マイクロインジェクターを使用してキャピラリーに正の80psiの圧力サージを1秒間加え、吸引液を溶媒に排出します。

蒸発を防ぐためにバイアルをしっかりと閉じ、サンプリングが完了するまでバイアルを氷に戻します。サンプリングが完了したら、微量遠心バイアルを含むサンプルを約1分間ボルテックス混合して、代謝物の抽出を促進します。次に、バイアルを8, 000倍gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞の破片やその他の微粒子をペレット化します。

細胞抽出物を細胞残骸と一緒に保存し、CE-ESI-MSで測定するまで、摂氏マイナス20度で1日、摂氏マイナス80度で最大1ヶ月間沈殿させます。テキストプロトコルで参照されているように、バックグラウンド電解質バイアルとサンプルローディングマイクロバイアルを保持するステージの迅速な垂直変換が可能なCE注入プラットフォームを構築します。最初にエレクトロスプレー金属エミッターを3ポートTユニオンに取り付けて、CE-ESIインターフェースを組み立てます。

次に、分離CEキャピラリーをエレクトロスプレーエミッターに通し、エミッターの先端から約40〜100ミクロン突き出させます。実体顕微鏡下で作業して、精度を高めます。シート溶液キャピラリーを残りのポートに接続して、エレクトロスプレー溶液を供給します。

適切なスリーブと指で締められた接続を使用して、CE-ESIインターフェースを漏れなく操作します。プレートホルダーを使用して、CE-ESIインターフェースを3軸トランスレーションステージに取り付け、エレクトロスプレーエミッターチップを質量分析計のオリフィスから約2mmの位置に配置します。界面の部品を洗浄するには、まずエレクトロスプレーエミッターを介してエレクトロスプレーシート溶液を1分間に1マイクロリットルで供給し、BGEをCE分離キャピラリーに供給します。

シリンジポンプを使用して、安定した速度で溶媒を供給します。次に、各測定の前に、シリンジをキャピラリーインレットエンドに接続して、CE分離キャピラリーをフラッシュします。大型のシリンジを効率的に使用して、溶剤供給ラインの補充とプライミングを最小限に抑えます。

分離キャピラリーを約5分間すすいだ後、その入口をステンレス鋼バイアルにあるBGE溶液に移します。エレクトロスプレーエミッターの先端を質量分析計のオリフィスから約2mmの位置に配置します。平行移動ステージを使用してこの距離を微調整し、実体顕微鏡を使用してスプレーを監視しながら、安定したコーンジェットレジームでエレクトロスプレーを生成します。

全イオン電流またはTICの安定性を約30〜45分間監視して、安定した動作を確保します。約15秒間にわたって電位を徐々に上昇させることにより、BGEバイアルに21±2キロボルトを印加し、通常はBGEとして1%パーセントのギ酸を使用して分離キャピラリー全体に約7.5マイクロアンペアの電流を生成します。各測定の前に、TICプロファイルを約5〜10分間監視し、その後、分離電位をゼロボルトまで段階的に下げて、システムの安定性を確保します。

アセチル冷却標準液1マイクロリットルを注射バイアルにピペットで移し、BGEバイアルから分離毛細血管を注射バイアルに移します。CEインジェクションステージを1秒で15センチ持ち上げます。60秒後、6ナノリットルのサンプルを分離キャピラリーに流体力学的に注入します。

その後、ステージを開始レベルに戻し、キャピラリーインレットの端をBGEにゆっくりと動かします。直後にCE電圧を上げて、電気泳動分離とEMA状態の取得を開始します。標準が検出されたら、データ集録を停止し、分離電圧を段階的に0ボルトまで下げます。

次に、エミッタをオリフィスから 2 cm の位置まで戻します。細胞抽出物を分析する前に、分離キャピラリーを5分間フラッシュします。これらのステップを90秒で繰り返してサンプルを流体力学的に注入することにより、10ナノリットルの単一細胞抽出物を測定します。

ここには、細胞抽出物の代表的なエレクトロフェログラムが示されており、同定された一連の代謝物の分離が示されています。70 種類のシグナルが、標準またはタンデム質量スペクトルライブラリからのシグナルと比較した細胞抽出シグナルの移動時間と MS/MS フラグメンテーションパターンに基づいて、低極性代謝物として高い信頼性で同定されました。代謝物の同定は、サンプルからの未知シグナルの精密質量、移動時間、およびフラグメンテーション挙動を、代謝物標準または代謝物データベースで利用可能なデータと比較することによって行われます。

このステップは、ヒスチジンについて実証されています。ここでは、マイクロプローブCE-ESI-MSを使用して同定およびサンプリングされた個々の背側細胞を、8細胞、16細胞、および32細胞の胚段階で示しています。3つの異なる細胞タイプで同定された代謝物の多変量解析により、細胞ステージ間で異なる代謝プロファイルと複雑な代謝傾向が明らかになりました。

定量的メタデータの主成分分析により、16細胞胚と32細胞胚に分割された8細胞胚の同定された前駆細胞として代謝変化が明らかになりました。特定の代謝物について代表的な傾向が示されています。アセチルコリンなどの代謝産物は細胞分裂とともに存在量が減少しましたが、トロラミンとセリン/アルギニンはこれらの細胞タイプで反対の傾向を示しました。

この手法を習得すると、この手法は非常に速く、通常は各セルで10秒未満で実行できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、初期のXenopus laevis胚における代謝細胞の不均一性のマッピングを開始したときでした。このビデオを見れば、マイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析を使用して単一胚細胞の代謝物を分析する方法について十分に理解できるはずです。

この手順を試みるときは、メタボロームが動的であり、細胞が発生中の胚で迅速に分裂するため、迅速に作業することを覚えておくことが重要です。また、細胞代謝に関する定性的な忠実度の高いデータが収集されるように、分析の詳細を検討します。この手法の意味は、当社のマイクロプローブ質量分析アプローチが迅速に機能し、低侵襲で、小さなサンプルと互換性があるため、生きた標本の診断にまで及びます。

この手順に続いて、組織の仕様に対する代謝物の影響などの追加の質問に答えるために、硫酸塩追跡などの他の方法を実行できます。高電圧電源の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、電化されたインターフェースを電気的に絶縁するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。