Name: クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶCryptococcus neoformansのカプセルと細胞体サイズの自動測定法。インドインク染色と画像処理アルゴリズムを用いて、疲労なく大量サンプルを正確に解析し、病原性因子の研究を効率化します。

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そのスライドが第三人間サイド バイ サイドと 2 番目の顕微鏡比較として使われたサブリナ ノーランと同様、スライドの 2 番目の人間サイド ・ バイ ・ サイド比較として使われていたアンソニー ・ ボーエンを認識したいと思います。

1. インドのインク スライドの準備
<ol><li>スライドにクリプトコッカス サンプルの 10 μ L をピペットします。すべての円形の酵母が動作しますが、この実験のため H99 は使用される唯一のひずみ。 注: 文化メディアから直接サンプルの場合は、1:2 PBS または水で希釈すること防ぐことができますインドのインク群生します。</li>
	<li>2 μ L のサンプル上にインドのインク汚れをピペットし、ミックスを物理的にピペット チップをサンプルにプッシュおよびインドのインクが均等に配置された表示されるまで円を描くように移動します。</li>
	<li>サンプルに、やさしく均等にサンプル上、coverslip の反対側を下げる、スライドの表面に対して coverslip の左端を押しながら観察を置きます。</li>
	<li>5 分間乾燥空気にスライドを許可します。</li>
	<li>軽くシールを形成およびインドのインク汚れを保持する coverslip 罫線にマニキュアの発光層を適用します。</li>
</ol>2. 画像スライド
<ol><li>カメラの付属品および知られているピクセル-ミクロン変換明視野顕微鏡でスライドを配置します。細胞カプセルが明確と細胞体は焦点を当て、暗いバンド フィルター、目標、およびコントラストを調整します。 注: さまざまなフィルターがあり、目的、およびコントラストの設定は、動作しますが、目的、Ph1 のフィルター、および 2 × 2 ビン × 20 が推奨されます。</li>
	<li>ビューのフィールドは密がクリプトコッカス細胞、細胞カプセルと背景のコントラストがはっきりとない過密、暗いバンドとして視覚化細胞体で正しく焦点を確認します。 注: サンプルや使用目的に応じて最適な画像のための細胞の正確な数が異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。</li>
	<li>単一ディレクトリ内の画像の計測アルゴリズムが実行され、出力データをイメージ ファイルの名前によると整理すると明確なタイトルを持つ単一のディレクトリに画像を保存します。</li>
</ol>3. アルゴリズム設定
<ol><li>Python のバージョン 2.7 をインストールします。</li>
	<li>「Pip インストール枕」コマンドを実行して追加 python ライブラリをインストールし、"pip は、openpyxl をインストール"します。</li>
	<li>次の手順に従って、MATLAB をインストールします。</li>
	<li>ビルド https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html で提供される指示に従い、MATLAB の python ライブラリ。</li>
	<li>この原稿の補足資料 ("QCA.py"、"Analysis2.m"、"TestRun.m") に含まれている 3 つの必要なファイルをダウンロードします。 メモ: これらのファイルは任意の場所に解凍することができますが、すべての 3 つは、同じディレクトリにある必要があります。</li>
</ol>4. アルゴリズムの使用
<ol><li>QCA.py をダブルクリックして、アプリケーションを実行します。 注: アプリケーションを起動するのに数分をかかる場合があります。"QCA.py"ファイルには、実際のアルゴリズムを実行する".m"ファイルを呼び出すプログラムの構造が含まれています。</li>
	<li>プログラムに記載されている手順に従います。<ol>
<li>入力画像ファイルの拡張子の前にピリオドをセミコロンで区切る (ex.」。TIF;。"jpeg) し、 Enterボタンをクリック。</li>
		<li>画像ファイルがあるディレクトリの選択]ボタンをクリックすると画像が含まれているフォルダーを選択するディレクトリを選択します。</li>
		<li>イメージ リストの生成ボタンをクリックしてディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成します。画像は、右側のテキスト ボックスに表示されます。確認し、リストが正確で完全なことを確認します。</li>
		<li>ランダム イメージの選択] ボタンをクリックしてプレビューとして使用するリストからランダムな画像を選択します。 注: イメージは「誤ったイメージ モード エラー」のために開くことができる、アルゴリズムがまだ正しく動作にもかかわらず画像が表示されません。4.2.7 のステップの後、テスト画像が表示されます。</li>
		<li>対物レンズとビニング設定を入力します。既定の設定で使用される顕微鏡が一致しない場合「カスタム ピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセル-に-um 変換を入力します。一度選択すると、変換の計算ボタンをクリックし、変換が右側のテキスト ボックスによると正しいを確認します。 注: x 倍率と 2 × 2 ビン選択 40 と図 1に示すように代表的な画像を求めた。</li>
		<li>円検出のアルゴリズム パラメーターを入力します。<ol>
<li>Min と Max カプセル半径エントリとして外側のカプセル検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。小さい範囲はより正確な結果になります。</li>
			<li>Min と Max の細胞体半径のエントリとして細胞体検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。 注: これらのエントリのすべての 4 つは、ソース画像によるとそれぞれの値 (ピクセル単位) を表す番号をする必要があります。</li>
			<li>アルゴリズムの感度閾値を調整するカプセルと細胞体感度のスライダーを移動します。低感度に厳格される偽の肯定的な円検出の削減、少ない真円の検出可能性がありますも。逆に、感度の高い検出率は増えますが、偽肯定的なサークルもあります。 注: 代表的な結果は、7 の最小カプセル半径、最大 45 カプセル半径、最小体半径 4、30 の本文の最大半径、87、カプセルの感度と 87 の体感度が得られました。</li>
		</ol>
</li>
		<li>テストの実行ボタンをクリックして、ランダムに選択したイメージのパラメーターをテストします。結果は、元のイメージの交換プログラムの上部中央に表示されます。正確な検索の結果場合は、同様に選択したパラメーターはすべて選択した画像に収まることを確認しようとする追加のランダムなイメージを選択することをお勧めします。<ol>
<li>ボディの数を最大化し、カプセルが検出され、正しく収まるように円が表示されるかどうかを目視で確認します。検出されたカプセル内に遺体を数は、右側にテキスト ボックスに表示されます。それ以外の場合、結果が正確になるまでは、アルゴリズム パラメーターを操作します。 注: 濃い色のついた丸は、可視化を支援するだけです。測定用に生成された実際のサークルは、HCT アルゴリズムによって計算される数学的な曲線です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像ファイルのディレクトリ全体に検出アルゴリズムを実行するには、 [分析の開始] ボタンをクリックします。各イメージ分析を行い、プログラムが表示されます「終了」、右側のテキスト ボックスにすべての画像の分析が完了したとき。</li>
		<li>一致およびクリーンアップ] ボタンをクリックします。彼らは内に存在する検出されたカプセルに検出された細胞体に一致、カプセルから身を引いて真のカプセルの半径を計算します。 注: 蛍光を検出するアルゴリズムが使用されている場合のみ 1 つの円がある別の状況はこの手順を検出必要はありません。代わりに引いて体のみまたはプル カプセルのみボタンそれぞれのみ、青または緑の円のみのデータを収集するをクリックします。カプセルのデータが取得される場合にのみ、半径が参照するセルの合計半径細胞体の半径を引かれませんよう注意することが重要です。</li>
		<li>画像ディレクトリの"CleanedOuput.csv"ファイルに完成品のデータを検索できます。1 つのデータを選択した場合にのみ、ファイルは"CleanedBodies.csv"または"CleanedCapsules.csv"ラベルがされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii%2C+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).</li>
<li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).</li>
<li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.neurology.org/content/80/7_Supplement/P04.007">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).</li>
<li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
<li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li>
<li>Araujo, G. deS., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561(2012).</li>
<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
<li>Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2891871/">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li>
<li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC219591/">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li>
<li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

この手法の重要なステップはインドのインク スライドを準備、顕微鏡画像を取得します。さまざまなスライドと画像技術が正常にテストされてアルゴリズム間の推奨プロトコルはこの原稿で説明されます。これらの粒子が大きすぎて多糖類の線維ネットワークに侵入すると、カプセルのドメインからインドのインク粒子の排除に基づく多糖類カプセルが検出されました。インドのインク除外は、暗い背景の上に明るい円の結果します。アルゴリズムでは、どれだけうまく彼ら彼らの背景とは対照的に基づく円を検出します。このように、重いインドのインク汚れは多糖類のカプセルと背景、信号対雑音比を向上、改善結果品質の高いコントラストになります。逆に、細胞体は明るい背景の上に暗いサークルとして検出されます。細胞体がフォーカル プレーン顕微鏡を設定する拡散反射光として表示される灰色の上部の円または下端とセルの中心に凝縮した濃いバンドとしてに基づいて外観が変更されます。同じ理由ですでに説明した、この結果円検出の最も正確な、細胞体が凝縮、暗いバンドとして表示される焦点面はイメージ獲得のため使用してください。
ここで報告する方法は、いくつかの変更と...

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス免疫抑制の人口に主にひと疾患に関連付けられている世界中で普遍的見つける病原性酵母です。クリプトコッカスは、特に感染症1のためのサハラ以南アフリカで合計年間死亡の重要な原因を占めています。クリプトコッカス感染症の主な臨床症状は髄膜脳炎は、感染させた大食細胞 (トロイの木馬方法) の輸送によって中枢神経系の侵略に続くまたは血液-脳関門の直接交差。クリプトコッカスは、人間の体温、ウレアーゼ活性、メラニン化、多糖類カプセル2の形成で複製する機能を含むいくつかの病原因子を表しています。多糖類のカプセルは、環境ストレス、ホスト免疫反応2等に対する防護壁として glucuronoxylomannan と glucoronoxylomannangalactan ポリマーおよび関数を繰り返しので構成されます。
クリプトコッカス多糖類カプセルのサイズが一貫して関連付けられていない病原性、病態2,3,4、5の要因であることの証拠があります。 6,7。カプセル サイズ髄膜炎病理学6に関連付けられて、クリプトコッカス感染症5を制御するマクロファージの機能に影響を与えることができます、8不在の場合の病原性の低下を招きます。したがって、クリプトコッカスの研究では、一般的なカプセルのサイズ測定がカプセル測定方法の標準的な fieldwide はありません。
現在、クリプトコッカス多糖類のカプセル測定、顕微鏡画像の手動測定に基づいており、画像と計測の両方の買収の正確なメソッドは、研究所9,10、間で異なります 11。このメソッドの当面の関心事は、いくつかの研究では、精度と信頼性の維持を困難にする個々 の測定の何千もの取得を必要とします。さらに、結果を公開するときにもしばしばある測定法の不十分な説明。多くの出版物は彼らの測定値が得られた方法を説明しないかどうか、彼らは 1 つの測定を使用またはいくつか、または他の平均、半径または直径が使用されるかどうか、彼らはカプセルの識別のためのしきい値を決定する方法は、どのような焦点平面が使用されました。詳細。いくつかの出版物だけの状態プログラムとしての法を用い, 例えば、「Adobe Photoshop CS3 使用されたセルを測定する「11。標準化およびレポートの詳細のこの欠乏、再現困難不可能ではない場合。人間の視力、コンピューターの明るさ、顕微鏡設定の違いは、照明、スライドおよび他の要因は、ピクセルの明度の値の比率に基づいて計算は一定になりますが、個人間だけでなく、サンプル、間変わることができるとサンプルとの間に適用されます。この手法は、カプセルの前にどれもなかったフィールドのサイズを測定する標準化された、正確、迅速、簡単な手法を提供することのコンテキストで生成されました。
前述したように、CHT アルゴリズムは, 老舗し、サークルを自動的に検出するスクリプトは、前に書かれています。このメソッドは、他のスクリプトの短い秋、2 つの分野で向上します。まず、円を検出するだけ十分ではない、クリプトコッカス細胞 2 つの明瞭な円は互いに関連して検出する必要がありますので。このメソッドは具体的にカプセル内の細胞体を検出し、両者の差別、関連体カプセル ペアでのみ計算を実行します。第二に、でもときに続いて同じプロトコル、別の捜査官で終る異なる画像を取得しました。捜査官すべてアルゴリズム パラメーター制御を許可すると、このツールは、取得方法の広い範囲を一致するように調整できます。標準化されたスコープ、目的、フィルターの必要はありません。
この手法は、調査官がその背景とは対照的イメージ内の円の検出する必要がありますどのような状況に容易に適用できます。両方円軽量化とその背景を検出できるより暗くカウント、およびこの手法を用いて測定します。

<table><tbody><tr><td>インディアインク</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td></td><td></td>261194</tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>フィッシャーファイネスト プレミアム カバー ガラス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>サリー ハンセン HardasNails エクストリーム ウェア ネイルポリッシュ</td><td>サリー ハンセン</td><td>N/A</td><td>109 インビジブル</td></tr><tr><td>SAB メディア</td><td>シグマ</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>クリプトッカスneoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 strain</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>販売終了 ;Bright Field Microscope</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>販売終了 ;カメラ 顕微鏡アタッチメント</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>該当なし</td><td>最新バージョン推奨</td></tr><tr><td>Python プログラミング言語</td><td>Python</td><td>該当なし</td><td>バージョン 2 必要 2.7</td></tr><tr><td>推奨 Microsoft Excel</td><td></td><td>Microsoft 該当なし</td><td>最新バージョン推奨</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

このテクニックの目的は、多数多糖類カプセル測定の一貫性のある、正確、かつ管理可能なプロセスを提供することです。
まず、一意に各イメージの計算された強度値に基づくしきい値のイメージが生成されます。その後、円は、オブジェクトと老舗サークル Hough 変換 (CHT) アルゴリズムを使用して背景のコントラストに基づいて検出されます。最後に、検出された細胞カプセルとボディ中心座標と半径のサイズと一致し、データが管理可能なスプレッドシートのユーザーにエクスポートします。
この手法の利点は、シンプルだが重要なです。最初に、これらの計算は人間ではなく、アルゴリズムによって実行されるので精度と信頼性を向上します。 正確性や信頼性に関係なく、どのように多くのサンプルは、分析の減少はありません。第 2 に、このアプローチは、クリプトコッカスフィールド カプセル測定がラボによって現在の状況ではなく潜在的な標準操作手順を確立します。第三に、手動カプセル測定されますがゆっくりと単調なため、オートメーションは高スループット データ解析およびますます強力な統計を円滑に多数の酵母細胞の迅速な測定ができます。
この技術の主要な制限方法から来るアルゴリズム関数。まず、アルゴリズムだけ円が生成されます。クリプトコッカス細胞と彼らのカプセルで円形の形態にかかる、非円形オブジェクトを検出するこの手法を適用することは困難でしょう。第二に、円を検出する方法のため、CHT アルゴリズムはクラスター化されたいくつかの円の外側のエッジに基づく巨大な擬似円を検出できます。ただし、擬似サークル内でキャッチすべての誤って細胞体簡単に検出できその結果のデータ セットから削除されます。
この手法は、インドのインク明視野顕微鏡に基づくクリプトコッカス属円形多糖類のカプセルを測定用適用される可能性が他のコントラストは円形オブジェクトの測定を用いた。

画像は、カメラ (図 1A) と相まって明るいフィールド顕微鏡を使用してインドのインク スライドの顕微鏡観察によって得られる最初。細胞分離とセルと背景のコントラストを作成する十分な汚れを使用して、ビューのフィールドを同様負荷をかけないように十分に低密度を持つことが重要です。プロトコルで述べたように、最適な画像のための細胞の正確な数はサンプル、顕微鏡、および使用する目的によって異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。これらの指示は、平均画素の輝度値、標準偏差により各画像に固有のしきい値を決定するアルゴリズムを許可します。当該しきい値を上回る強度値を持つピクセルは白と見なされ、低い強度の値を持つ任意の黒と見なされます。結果の画像は、カプセルが (図 1...

この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

この手法の全体的な目標は、面倒な手動測定を自動化することです。この方法は、カプセルや細胞体のサイズとの関係、病原性のさまざまな側面など、クリプトコッカス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、膨大な量のサンプルを疲労なく分析できることです。この技術の意味は、カプセルと細胞体のサイズが病原体の重要な側面であるため、クリプトコッカス症の治療にまで及びます。India Ink Slideを調製するには、まず10マイクロリットルのクリプトコッカスサンプルをスライドにピペッティングします。仕事を伴う任意の円形yiひずみですが、この実験では、H99が使用された唯一のひずみでした。2マイクロリットルのインドインク染色をサンプルにピペットで移し、ピペットチップを物理的にサンプルに押し込み、インドインクが均一に分布するまで円を描くように動かして混合します。カバースリップの左端をスライドの表面に押し付けて、サンプルの上にカバースリップを置きます。次に、カバーの反対側をサンプルの上に静かに均等に下げます。スライドを5分間風乾させます。次に、カバースリップの境界線にマニキュアの薄い層を塗り、シールを形成し、墨の汚れを保持します。サンプルをイメージングするには、カメラアタッチメントと既知のピクセルからミクロンへの変換を備えたスライドを明視野顕微鏡の下に置きます。フィルター、対物レンズ、コントラストを調整し、視野が密集しているが、過密ではないことを確認し、細胞嚢と背景との間に明確なコントラストを持つクリプトコッカス細胞を使用し、細胞体が暗いバンドとして視覚化されるように適切に焦点を合わせます。画像を撮影した後は、測定アルゴリズムが単一のディレクトリ内の画像に対して実行され、出力データは画像ファイルの名前に従って整理されるため、明確なタイトルを付けて単一のディレクトリに保存します。テキストプロトコルに従ってアルゴリズムを設定したら、QCA.py をダブルクリックしてアプリケーションを実行します。プログラムで説明されている手順に従って、画像ファイルの拡張子タイプを入力し、前にピリオドを付け、セミコロンで区切ります。次に、Enterボタンをクリックします。「ディレクトリを選択」ボタンをクリックして、画像ファイルが配置されているディレクトリを選択し、画像を含むフォルダを選択します。ディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成するには、[Generate Image List] ボタンをクリックします。画像は右側のテキストボックスに表示されます。リストが正確かつ完全であることを確認してください。次に、リストからランダムな画像を選択してプレビューとして使用するには、[ランダム画像の選択]ボタンをクリックします。次に、顕微鏡の対物レンズとビニング設定を入力します。デフォルト設定が使用しているマイクロスコープと一致しない場合は、「カスタムピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセルからマイクロメートルへの変換を入力します。選択したら、[変換の計算]ボタンをクリックし、右側のテキストボックスに従って変換が正しいことを確認します。円検出のアルゴリズムパラメータを入力するには、外側のカプセル検出で検出可能な最小半径と最大半径を、最小および最大カプセル半径エントリとして入力します。次に、セル本体検出で検出可能な最小半径と最大半径を、最小および最大セル本体半径エントリとして入力します。次に、カプセルと細胞本体の感度スライダーを動かして、アルゴリズムの感度しきい値を調整します。感度を低くすると、厳密になり、誤検出の円の検出が減少しますが、実際の円の検出が少なくなる可能性もあります。逆に、感度が高いと検出率は高くなりますが、偽陽性の円が生じる可能性もあります。検出されるボディとカプセルの数を最大化し、円が正しくフィットしているように見えるかどうかを視覚的に検査します。検出されたカプセル内の遺体の数は、右側のテキストボックスに表示されます。それ以外の場合は、結果が正確になるまでアルゴリズム パラメーターを操作します。画像ファイルのディレクトリ全体に対して検出アルゴリズムを実行するには、[分析の開始] ボタンをクリックします。各画像が分析され、すべての画像が分析されると、プログラムは右側のテキストボックスに「完了」と表示します。次に、[一致してクリーンアップ]ボタンをクリックします。これにより、検出された細胞体と検出されたカプセルが照合され、カプセルから体を差し引いて真のカプセル半径が計算されます。イメージ ディレクトリで、完了したデータを CleanedOutput で見つけます。csv ファイル。1 つのデータのみを選択した場合、ファイルには CleanedBodies. csv または CleanedCapsules.csv というラベルが付けられます。この顕微鏡画像で見られるように、インドのインクスライドでは、細胞は分離されており、視野を圧倒しないように十分に低密度になっています。また、セルと背景の間にコントラストを作り出すために、十分な染色が使用されています。このアルゴリズムは、平均強度値を取得し、標準偏差を加算することにより、各画像に固有のしきい値を決定します。しきい値よりも高い強度のピクセル強度は白と見なされ、強度が低いピクセル強度は黒と見なされます。細胞体は、カプセルの白い背景に堅牢な黒い円として視覚化する必要があります。使用するのに最適な焦点面は、細胞体が暗く集中したバンドとして表示される焦点面です。この焦点面は、細胞に適切に焦点を合わせるため、標準として許容されます。これは、UVITEXで細胞壁を視覚化することで確認されましたが、これは、中央に弱いシグナルを持つ鮮明で焦点の合った細胞壁である一種の染色剤です。プロトコルに正確に従い、最適な画像が得られると、アルゴリズムは正確で信頼性があります。ただし、プロトコルに誤って従い、染色不良、過密、またはその他の前述のパラメーターが原因で最適でない画像が得られると、アルゴリズムは精度を失い、人間の測定値を再現できなくなります。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約10分で完了します。この手順を試行する際は、最適な画像を取得するための感覚を事前につかむことを忘れずに覚えておくことが重要です。これにより、実際のサンプルを取得する際の準備が整います。開発後、この技術は、クリプトコッカス研究の分野の研究者が、カプセルと細胞体のサイズが明確に視覚化される任意のイメージングシステムで探求する道を開きました。このビデオを見れば、クリプトコッカス嚢と細胞体の測定方法についてよく理解できるはずです。クリプトコッカスでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、基本的なBSL2の安全性などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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私たちは、微生物のエクソ多糖類の同定と特性評価のための自動化されたモジュール式のハイスループット法を提示します。この方法は、分泌された多糖類の総量を分析するための迅速な事前選択と詳細な炭水化物フィンガープリントを組み合わせて、新たに分離された細菌株または全株コレクションの迅速なスクリーニングを可能にします。...

自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2...

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。...

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。...

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。...

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

ここでは、分裂酵母を異種宿主として利用し、FtsZやMreBなどの細菌細胞骨格タンパク質をGFPとの翻訳融合タンパク質として発現させ、それらの重合を可視化します。また、重合に影響を与える化合物は、蛍光顕微鏡を用いたイメージングによって同定されます。...

細菌の細胞骨格タンパク質を標的とする抗菌薬スクリーニングのプラットフォームとしての分裂酵母

学ぶCryptococcus neoformansのカプセルと細胞体サイズの自動測定法。インドインク染色と画像処理アルゴリズムを用いて、疲労なく大量サンプルを正確に解析し、病原性因子の研究を効率化します。

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

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