クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

この手法の全体的な目標は、面倒な手動測定を自動化することです。この方法は、カプセルや細胞体のサイズとの関係、病原性のさまざまな側面など、クリプトコッカス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、膨大な量のサンプルを疲労なく分析できることです。

この技術の意味は、カプセルと細胞体のサイズが病原体の重要な側面であるため、クリプトコッカス症の治療にまで及びます。India Ink Slideを調製するには、まず10マイクロリットルのクリプトコッカスサンプルをスライドにピペッティングします。仕事を伴う任意の円形yiひずみですが、この実験では、H99が使用された唯一のひずみでした。

2マイクロリットルのインドインク染色をサンプルにピペットで移し、ピペットチップを物理的にサンプルに押し込み、インドインクが均一に分布するまで円を描くように動かして混合します。カバースリップの左端をスライドの表面に押し付けて、サンプルの上にカバースリップを置きます。次に、カバーの反対側をサンプルの上に静かに均等に下げます。

スライドを5分間風乾させます。次に、カバースリップの境界線にマニキュアの薄い層を塗り、シールを形成し、墨の汚れを保持します。サンプルをイメージングするには、カメラアタッチメントと既知のピクセルからミクロンへの変換を備えたスライドを明視野顕微鏡の下に置きます。

フィルター、対物レンズ、コントラストを調整し、視野が密集しているが、過密ではないことを確認し、細胞嚢と背景との間に明確なコントラストを持つクリプトコッカス細胞を使用し、細胞体が暗いバンドとして視覚化されるように適切に焦点を合わせます。画像を撮影した後は、測定アルゴリズムが単一のディレクトリ内の画像に対して実行され、出力データは画像ファイルの名前に従って整理されるため、明確なタイトルを付けて単一のディレクトリに保存します。テキストプロトコルに従ってアルゴリズムを設定したら、QCA.py をダブルクリックしてアプリケーションを実行します。

プログラムで説明されている手順に従って、画像ファイルの拡張子タイプを入力し、前にピリオドを付け、セミコロンで区切ります。次に、Enterボタンをクリックします。「ディレクトリを選択」ボタンをクリックして、画像ファイルが配置されているディレクトリを選択し、画像を含むフォルダを選択します。

ディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成するには、[Generate Image List] ボタンをクリックします。画像は右側のテキストボックスに表示されます。リストが正確かつ完全であることを確認してください。

次に、リストからランダムな画像を選択してプレビューとして使用するには、[ランダム画像の選択]ボタンをクリックします。次に、顕微鏡の対物レンズとビニング設定を入力します。デフォルト設定が使用しているマイクロスコープと一致しない場合は、「カスタムピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセルからマイクロメートルへの変換を入力します。

選択したら、[変換の計算]ボタンをクリックし、右側のテキストボックスに従って変換が正しいことを確認します。円検出のアルゴリズムパラメータを入力するには、外側のカプセル検出で検出可能な最小半径と最大半径を、最小および最大カプセル半径エントリとして入力します。次に、セル本体検出で検出可能な最小半径と最大半径を、最小および最大セル本体半径エントリとして入力します。

次に、カプセルと細胞本体の感度スライダーを動かして、アルゴリズムの感度しきい値を調整します。感度を低くすると、厳密になり、誤検出の円の検出が減少しますが、実際の円の検出が少なくなる可能性もあります。逆に、感度が高いと検出率は高くなりますが、偽陽性の円が生じる可能性もあります。

検出されるボディとカプセルの数を最大化し、円が正しくフィットしているように見えるかどうかを視覚的に検査します。検出されたカプセル内の遺体の数は、右側のテキストボックスに表示されます。それ以外の場合は、結果が正確になるまでアルゴリズム パラメーターを操作します。

画像ファイルのディレクトリ全体に対して検出アルゴリズムを実行するには、[分析の開始] ボタンをクリックします。各画像が分析され、すべての画像が分析されると、プログラムは右側のテキストボックスに「完了」と表示します。次に、[一致してクリーンアップ]ボタンをクリックします。

これにより、検出された細胞体と検出されたカプセルが照合され、カプセルから体を差し引いて真のカプセル半径が計算されます。イメージ ディレクトリで、完了したデータを CleanedOutput で見つけます。csv ファイル。

1 つのデータのみを選択した場合、ファイルには CleanedBodies. csv または CleanedCapsules.csv というラベルが付けられます。この顕微鏡画像で見られるように、インドのインクスライドでは、細胞は分離されており、視野を圧倒しないように十分に低密度になっています。

また、セルと背景の間にコントラストを作り出すために、十分な染色が使用されています。このアルゴリズムは、平均強度値を取得し、標準偏差を加算することにより、各画像に固有のしきい値を決定します。しきい値よりも高い強度のピクセル強度は白と見なされ、強度が低いピクセル強度は黒と見なされます。

細胞体は、カプセルの白い背景に堅牢な黒い円として視覚化する必要があります。使用するのに最適な焦点面は、細胞体が暗く集中したバンドとして表示される焦点面です。この焦点面は、細胞に適切に焦点を合わせるため、標準として許容されます。

これは、UVITEXで細胞壁を視覚化することで確認されましたが、これは、中央に弱いシグナルを持つ鮮明で焦点の合った細胞壁である一種の染色剤です。プロトコルに正確に従い、最適な画像が得られると、アルゴリズムは正確で信頼性があります。ただし、プロトコルに誤って従い、染色不良、過密、またはその他の前述のパラメーターが原因で最適でない画像が得られると、アルゴリズムは精度を失い、人間の測定値を再現できなくなります。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約10分で完了します。この手順を試行する際は、最適な画像を取得するための感覚を事前につかむことを忘れずに覚えておくことが重要です。これにより、実際のサンプルを取得する際の準備が整います。開発後、この技術は、クリプトコッカス研究の分野の研究者が、カプセルと細胞体のサイズが明確に視覚化される任意のイメージングシステムで探求する道を開きました。

このビデオを見れば、クリプトコッカス嚢と細胞体の測定方法についてよく理解できるはずです。クリプトコッカスでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、基本的なBSL2の安全性などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。