人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

この手順の全体的な目標は、ヒト腸オルガノイドの上皮バリア透過性を経時的に測定することです。この方法は、特定の毒素、細菌製品、さらには薬理学的治療が上皮バリア透過性をどのように変化させるかなど、消化器病学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトの腸上皮組織を使用して、上皮バリア透過性をリアルタイムで視覚化し、定量的に測定できることです。

ヒト腸オルガノイドをマイクロインジェクションする前に、マイクロインジェクターをセットアップし、テキストプロトコルに記載されているようにマイクロキャピラリーを準備、設置、およびテストする必要があります。マイクロキャピラリーを注入材料で満たすには、ガラスマイクロキャピラリーの先端をFITC-デキストラン注入懸濁液に浸し、マイクロキャピラリーの先端がチューブの側面または底部に当たらないように注意します。鉱油シリンジを引き戻して、約10マイクロリットルのFITC-デキストラン懸濁液をマイクロキャピラリーに引き込みます。.

マイクロインジェクション懸濁液がガラスマイクロキャピラリーの長さの90%を満たしたら、マイクロキャピラリーの充填を停止します。マイクロキャピラリーをマイクロインジェクション溶液から引き抜く前にシリンジを少し押し下げて、マイクロキャピラリーの先端に空気のポケットが含まれていないことを確認します。.ヒト腸管オルガノイド培養プレートを細胞培養インキュベーターから取り出し、マイクロインジェクターでバイオセーフティキャビネットに移します。

培養プレートから蓋を取り外し、最初のウェルを顕微鏡ステージの中央に配置して、スコープの接眼レンズを通して最低倍率設定ではっきりと見えるようにします。マイクロマニピュレーターアームを回して、マイクロキャピラリーが顕微鏡ステージに対して45度を超える角度で培養ウェルに向けられるようにします。マイクロキャピラリーの先端を、培地の表面から約1cm上の第1の培養ウェルの上に配置します。

ガラスフィラメントの先端とヒト腸オルガノイドの両方が接眼レンズを通して見えることを確認します。マイクロインジェクションを成功させる秘訣は、マイクロインジェクションを試みる前に、マイクロキャピラリーをオルガノイドと慎重に並べることです。また、新しいユーザーは、重要な実験を試みる前に、予備の組織で練習することを常にお勧めしています。

z軸コントロールノブを時計回りに回して、マイクロキャピラリーをゆっくりと進めます。ヒト腸オルガノイドにマイクロキャピラリーチップを突き刺します。ヒト腸オルガノイドの外面は、マイクロキャピラリーが圧力をかけ始めるとわずかに下がり、先端が内腔を貫通すると元の形状に戻ります。

内腔内のマイクロキャピラリーの先端が見えにくい場合は、解剖顕微鏡の照明設定や倍率設定を調整してください。マイクロキャピラリーの先端がヒト腸オルガノイドの中心近くにくるようにマイクロキャピラリーが正しく配置されたら、マイクロマニピュレーターのコントロールから手を離します。鉱油を充填したシリンジをわずかに押し下げて、マイクロインジェクション溶液をマイクロキャピラリーからヒトの腸オルガノイド内腔に押し出します。

ヒト腸オルガノイドは、注射の量に合わせてわずかに拡張することがあります。操作中にヒト腸オルガノイドが偶発的に損傷を受けるのを避けるために、マイクロキャピラリーをメディアの上に配置して、次のヒト腸オルガノイドターゲットに移動します。治療の合間や破損の場合は、マイクロキャピラリーを交換してください。

クランプを緩めますamp マイクロマニピュレーターアームの端にあり、マイクロキャピラリーをマイクロピペットホルダーから取り外します。頂端上皮に送達された化合物をテストするには、化合物を1ミリリットルあたり2ミリグラムのFITC-デキストランを含む滅菌PBSに再懸濁する必要があります。この代表的な実験では、クロストリジウム・ディフィシル毒素TcdAを再懸濁し、マイクロインジェクションの前にFITC-デキストランを含むPBSに1マイクロリットルあたり12.8ナノグラムを追加します。

前のセクションで示したように、化合物をヒト腸オルガノイド内腔にマイクロインジェクションします。基底側コンパートメントに送達された化合物をテストするには、FITC-デキストランのマイクロインジェクション後、外部培養培地を、ポジティブコントロールとして2ミリモルEGTAを含む新しい培地、ネガティブコントロールとしてPBSビヒクルのみ、または他の実験化合物と交換します。マイクロインジェクションの直後にライブイメージングを開始します。

この代表的な明視野画像は、FITCデキストランのマイクロインジェクション後の組織由来のヒト腸管オルガノイドを示しています。蛍光シグナルは、特定のフィルターセットを使用しなくても明らかです。幹細胞由来のヒト腸管オルガノイドに、PBSに懸濁した4キロダルトンのFITC標識デキストラン、またはクロストリジウム・ディフィシル毒素TcdAを含むPBSをマイクロインジェクションしました。

ポジティブコントロールとして、EGTAを、PBSおよびFITC-デキストランを注射したヒト腸オルガノイドのサブセットのヒト腸オルガノイド培養培地に加えました。ヒト腸管オルガノイドを20時間イメージングしました。これらの画像が示すように、PBSを注入したヒト腸オルガノイドは、Tゼロに存在するほぼすべての蛍光シグナルを保持していました。

しかし、TcdAを注射した、またはEGTAで処理したヒト腸オルガノイドは、マイクロインジェクション後8時間で蛍光強度の大幅な減少を示しました。イメージングデータは、すべての時点ですべてのヒト腸オルガノイドについて定量化され、各実験条件における経時的な蛍光強度の相対的な変化を表す高解像度データセットを生成しました。一度習得すると、この手法は実験条件の数にもよりますが、約30分から1時間で行うことができます。

この手順を試みる際には、マイクロインジェクションの前にヒト腸オルガノイドをマイクロキャピラリーに合わせる際には、忍耐強く、時間をかけて行うことが重要です。この手順に続いて、PCR、ウェスタンブロット、RNAシークなどの他の方法を実行して、注入された材料に対するヒト腸オルガノイドの応答に関する追加の質問に答えることができます。この技術の開発により、細菌毒素、薬理学的薬剤、サイトカイン、さらには生きた微生物がヒト腸オルガノイドの上皮バリア機能に及ぼす影響を調べることができました。

このビデオを見れば、蛍光標識されたデキストランやその他の実験材料をヒト腸オルガノイドの内腔にマイクロインジェクションする方法を十分に理解できるはずです。細菌毒素や生きた生物を扱う場合、非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に適切なPPEを使用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。そして最後に、マイクロキャピラリーは非常に鋭いので、穿刺傷を避けるために特に注意してください。