Name: 効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶ CRISPR/Cas9を用いたゼブラフィッシュの遺伝子ノックアウト手法。マイクロインジェクションとヘテロ二重鎖移動度アッセイで変異を同定し、発生生物学における遺伝子機能を解明する効率的なプロトコルです。

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この仕事は健康の国民の協会によって支えられた (ジョーに R21CA182197)、ラルフ ・ w ・とグレース ・ m ・ ヘンチ研究の信頼、パーデュー大学の農業科学および経済開発 (AgSEED) プログラムの拡張子。サンガー シーケンス データに P30 CA023168 でサポートされているパーデュー大学ゲノム中核施設によって買収されました。メアリー Witucki はキャロル郡の癌協会によってサポートされているがん研究夏学部研究プログラムのパデュー大学センターによって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。原稿の重要なフィードバックを提供するためベンジャミン ・ カーター、エレン ・ デニング、テイラー サバトをありがとうございます。この作業のサポートのための生物化学の部門とケアと私たちのゼブラフィッシュの植民地の福祉に奉仕するパデュー大学ゼブラフィッシュ研究センターに感謝します最後に、我々 はパーデュー大学ゲノムの中核施設に感謝し、フィリップ ・ サン ・ ミゲルの貢献について NGS サービス。

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、CRISPR Cas9 技術を用いたゼブラフィッシュ脊椎動物のモデル システムの遺伝子のノックアウトの生産を説明します。プロトコルの番号は、ゼブラフィッシュ15,25,26,50,51,52CRISPR を介したゲノム工学に着手する以前記載されています。このプロトコルが特にシンプルで再現性をもって一貫した実験技術の数を組み合わせることによって、以前の努力ビルド HMA と複数の簡単な経済的なを作成する、ヘテロ接合体の魚と実験的堅牢なプロトコルの NGSゼブラフィッシュの CRISPR を介した突然変異誘発の研究所が教育研究所と同様に、トレーニングと経験の範囲でスタッフの適切なです。
Rna は、このプロトコルに含まれているガイドの設計と合成に関する推奨事項。ガイド RNA のデザインの主要な考慮事項は、オフターゲット効果の最小化です。CRISPR-ユーザーが両方のターゲットにガイドの活動とオフのターゲット効果34,のチャンスを予測するユーザーフレンドリーなグラフィカル ・ インタ フェースを持つ計算ツールにアクセスできるようにするいくつかの予測アルゴリズムが開発されて35,36。ゼブラフィッシュ システムの特定の利点は、Cas9 を胚に注入し、したがって式は一時的な減少のオフターゲット効果53が発生するマウスで示されているにオフターゲット効果の低下率。それにもかかわらず、ゼブラフィッシュ54で発生するオフターゲット効果を実証されています。オフターゲット効果の制御方法の 1 つは、これらのガイドは非常に異なるをターゲット ・ サイトに影響を与える可能性が高いだろうと同じ遺伝子を対象とする 2 つの独立したガイド Rna によって生成されている表現型創始者ゼブラフィッシュすることです。このプロトコルに記載されていないいるオフターゲット効果を最小限に抑える方法として、高効率で修理はターゲット DNA の一本鎖切断を生成する変異 Cas9 の使用。逆に相補的互いに近接内 DNA のニックネームをペアリング希望の軌跡で効果的な塩基形成の結果の鎖、オフターゲット効果55,56を最小限に。
オフターゲット効果の異なるレートだけでなく、異なる sgRNAs は対象57,58,59の突然変異誘発の異なる速度を持つことができます。このプロトコルは、HMA を使用してヘテロ二本鎖バンド形成33,40を使用して指定された sgRNA の突然変異誘発の効率性を分析します。ヘテロ二本鎖バンドは、ミスマッチを含むとゲル電気泳動を使用して簡単に解決することができますの PCR による DNA 鎖の交配によって作成されます。塩基形成を測定するために一般的に使用される他の方法とは異なり T7 エンドヌクレアーゼのアッセイまたは高解像度溶融分析25,26, HMA、dna 塩基のミスマッチをカットする高価な酵素を必要としないなどを必要としません。PCR の複雑な分析では、曲線を溶かします。重要なは、HMA を使用して挿入された人口の塩基形成率が高いを確認する調査官の突然変異を識別するコストを削減するノック アウト線の後続の生産に必要な魚の数を最小限に抑えることができます、必要な特性。
オクターリピートの CRISPR ベースを生成する相対的な容易さは、一度に複数の遺伝子の複数の対立遺伝子の作成をできます。Web ベースのソフトウェアはサンガーを用いたヘテロ接合体の魚から単一の突然変異の分析のため利用可能な PCR の製品の49のシーケンスします。3 つ以上の CRISPR 変異の対立遺伝子が分析される場合、塩基の性質を特徴付ける NGS がこのアプローチとして塩基の性質を特徴付けるよりコスト効果的である o で特徴付けられる最大 50 の異なる対立遺伝子のプールをことができます。nce (材料の表を参照)60,,6162。規模のような経済は、特に学部実験室の設定で役に立つでしょう。
要約すると、このプロトコルは、再現性をもってその作成し、正常に関心の突然変異体の対立遺伝子を識別するために分析する必要があります少ない成魚 (特に sgRNA) の高品質 CRISPR 試薬を生成するためのステップバイ ステップの指示を提供します。また時間と希望する行を生成するコストを削減します。重要なは、このプロトコルは、手頃な価格の方法でゼブラフィッシュ変異体を生成する限られた資源と研究所で適用できるように設計されています。さらに、我々 は、このアプローチは大学生に適しており、CRISPR ベース ゲノム編集の体験に興味がある学部学生の教育と訓練のための機会が広がることを発見しました。

真核生物の分子機械の保全研究のためのモデル有機体の使用の力の基礎となります。これらのモデルのシステムの多くは興味の生物学的または病気プロセスに遺伝子産物の貢献を特徴付けるための目標とされた遺伝子ノックアウトなど逆遺伝学的アプローチの使用を促進します。ゼブラフィッシュなど生物の遺伝子破壊技術は、Dsb1,2の不正確な修理に起因するフレーム シフト変異のターゲット導入に頼ってきました。ゲノムに、DSB を導入すると、ほぼすべてのセル型の生物に普遍的に存在する 2 つの経路のいずれかを介して DNA 損傷は修復: 非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR)3,4.NHEJ 機械の不正確な性質はよく様々 な長さ5,6,7,8,9オクターリピートを生成します。遺伝子のコーディング シーケンスのフレーム シフト変異の導入は、しばしばレンダリング遺伝子が機能しない時期尚早停止コドンを作り出すことができます。
すべての利用対象とする特定のゲノムにヌクレアーゼ DNA 蛋白質の相互作用、転写活性化因子のようなエフェクター核酸、亜鉛指核酸 meganucleases オクターリピートを促進するゼブラフィッシュの初期のゲノム工学戦略が含まれてターゲットそれは DSB10、11,12,13,14,15を導入します。しかし、これらの技術は興味の DNA シーケンスを対象とするヌクレアーゼを生成するために必要な骨の折れると複雑な工学のために適用することは困難で、しばしば。以前の戦略とは異なり CRISPR 遺伝子編集に依存しないターゲット蛋白質 DNA の相互作用。興味16,17,18,19 のゲノムのサイトを対象とする塩基対形成相互作用が基本を使用して RNA ガイドを介して CRISPR 関連 (Cas) エンドヌクレアーゼを指示する代わりに、 ,20,21。RNA のデザインのシンプルさのためガイド目的ベースの対形成相互作用それの対象とは、目的の軌跡に Cas エンドヌクレアーゼを対象とする比較的簡単です。タイプ II CRISPR システム特に広く培われた a エンドヌクレアーゼ活性を刺激するために DNA との相互作用を必要とする単一マルチ ドメインの Ca ヌクレアーゼ (Cas9) の使用を含むいくつかの有利な特徴によるゲノム編集用同種の DNA シーケンス18を対象とする 1 つのガイド RNA (sgRNA) の使用します。同種の sgRNA のターゲットに必要なシーケンス条件がよく分かって19と希望 sgRNA が簡単に生体外のトランスクリプションによって生成されます。シンプルさと堅牢性 CRISPR/Cas9 アプローチの大幅のゼブラフィッシュとさまざまな他の有機体で目標とされた遺伝子組み換えを容易になります。
中枢神経系の開発など脊椎動物の有機体の象徴的なプロセスを勉強する機会が増えて大幅に CRISPR ベースの試薬の開発の結果としてのゼブラフィッシュの標的ゲノム編集を引き受ける能力を強化システム。ゼブラフィッシュ ゲノムには人間22で病気と関連付けられる遺伝子の 84% と同様、人間のゲノムで見つけられた蛋白質のコーディングの遺伝子の 70% が含まれています。ゼブラフィッシュの開発が逆の遺伝学的研究での利用を高めるいくつかのキーの資質を展示: 大型クラッチにおける胚のレイアウト、マイクロインジェクションと大人のゼブラフィッシュによる遺伝的に操作をさせる母親から外部開発希望する行23の急速な伝播を可能にする、生後 3 か月で性的に成熟しました。
多数のプロトコルが利用可能な様々 な生成し、ゼブラフィッシュ24,25,26,27,28,29 CRISPR 派生オクターリピートの識別にアプローチを記述します。 ,,3031。ただし、これらの手順の多くは集中的な時間、高価な機器へのアクセスを必要とする、限られた専門知識を持つ研究所の挑戦することができます。本明細書に記載されている手順戦略を提供するシンプルで堅牢、かつ経済的な CRISPR/Cas9 - エンジニア ゼブラフィッシュ ノックアウト線に。32に説明したにされている他のアプローチと同様、このプロトコルは DNA オリゴヌクレオチド (oligos) を使用して sgRNAs を合成する非常に効率的なキットの使用を説明します。記述されていたプロトコルが特に 2 つの手順を含む CRISPR 変異線路の解析を大幅に簡素化: ゲノムの変更の有無とのシーケンス解析を簡単に決定する PCR に基づく HMA33のステップバイ ステップの使用ヘテロ接合体のゼブラフィッシュ迅速かつ容易には、経済的な方法で複数オクターリピートの性質を決定します。さらに、ステップバイ ステップの手順が堅牢な選択、信頼性の高い生産ガイド Rna の注射に含まれています。ここに示す手順は、ゼブラフィッシュの遺伝子のノックアウトの同定に貢献する専門知識の範囲で研究者を可能にする強力な比較的安価なプロトコルを例示します。

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA解析ソフトウェア. http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA解析ソフトウェア. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA解析ソフトウェア. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCRプライマーデザイン. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>RNaseフリー技術</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td>RNaseフリー水 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>任意のブランド</td><td></td><td>ガイドRNAの合成。サーモフィッシャーとキアゲンはどちらも適切な水を運びます。</td></tr><tr><td>Rnaseフリーのエタノール</td> どの<td>ブランド</td><td></td><td>でも、分子生物学グレードのエタノールはRnaseフリーです。フィッシャー、VWRは適切なエタノールを販売しています。</td></tr><tr><td>Cas9</td>タンパク質 <td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>核局在シグナルを持つCas9タンパク質。</td></tr><tr><td>ターゲット特異的オリゴ</td><td>Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td></td><td>ガイドRNAを合成します。</td></tr><tr><td>PCRプライマー隣接ガイドRNAカットサイト</td><td>Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td></td><td>ヘテロデュプレックス分析に使用、100-300 bp製品。</td></tr><tr><td>PCRプライマー隣接ガイドRNAカットサイト</td><td>Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td></td><td>CRISPR対立遺伝子のシーケンシングに使用、300-600 bp製品を推奨します。</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>In vitro トランスクリブガイドRNA.</td></tr><tr>核酸の電気泳動用の<td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>RNaseフリーバッファー。</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>エレクトロフェレーシス用DNAのローディング。</td></tr><tr><td>5M酢酸アンモニウム</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAM9071</td><td>ガイドRNAの精製のための試薬をクリーンアップします。</td></tr><tr><td>エタノール(200プルーフ、ヌクレアーゼフリー)</td><td>任意のブランド</td><td></td>ガイド<td>RNAの精製のためのクリーンアップ試薬。分子グレードの材料はRNaseフリーです。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>ガイドRNAの合成と精製用。</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>表面、機器、ガラス器具からのRNase汚染を排除します。</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>DNAのゲル電気泳動のための分子量標準物質。</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>DNA のゲル電気泳動のための分子量標準。</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>一本鎖RNAマーカーで、全長のsgRNAが合成されたことを確認します</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>キャスティングポリアクリルアミドゲル。</td></tr><tr><td>40% ポリアクリルアミド (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>キャスティング変性ポリアクリルアミドゲル。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>鋳造変性ポリアクリルアミドゲル。</td></tr><tr><td>RNA ゲルローディング色素 (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>ガイドRNAを変性ゲルにローディングし、電気泳動を行います。</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>核酸の可視化。</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中のdsDNAを検出するための臭化エチジウムの代替法。</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNAクリーンアップ、PCR精製。</td></tr><tr><td>MyTaq ポリメラーゼ</td><td>バイオライン</td><td>BIO-21105</td><td>PCR を使用した DNA の増幅用。</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>あらゆるブランドの</td><td></td><td>PCR増幅。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>DNA/RNAの量を定量化する任意のブランドの</td><td></td><td></td>NanoDropまたは関連製品。</tr><tr><td>E3胚培</td>地 <td>胚</td><td></td><td>を育て、インジェシトンプレートを作るための社内培地。レシピ:</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 メチレンブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M9140</td>を<td>1x E3培地に追加して、胚の真菌の増殖を防ぎます。</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FB0875711Z</td><td>ストア胚、キャストインジェクションプレート。</td></tr><tr><td>アガロースデン</td><td>ビル</td><td>CA3510-8</td><td>鋳造注入プレート、アガロースゲル。</td></tr><tr><td>マイクロインectionモールド</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>注入時に胚を保持するためのウェルを作成します。</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P0290&nbsp;</td><td>注射の視覚化のための染料。</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>針の注入量を校正します。</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>胚を移動します。</td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー11295-10</td><td>カット注射針、テールクリッピング成魚。</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>28.5 oCで胚を維持しています。</td></tr><tr><td>バーティクルピペットプーラー</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>注射用ジェネレートニードル。追加の針引っ張り手順:</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long 毛細管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>注射用針を生成。</td></tr><tr><td>マイクロローダーのヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td>溶液を注射針にロードします。</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>胚の注入。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>胚の注入。</td></tr><tr><td>30% ポリアシルアミド (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>ヘテロデュプレックスゲルキャスティング。</td></tr><tr><td>MS-222 (トリカイン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>ゼブラフィッシュのテールクリッピングと胚からのgDNA抽出のための麻酔薬。レシピ:電子レンジ</td></tr><tr><td></td><td>https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE 任意のブランドの</td><td></td><td>鋳造注入プレート、アガロースゲル。</td></tr><tr><td>スケール</td><td>あらゆるブランドの</td><td></td><td>キャスティングインジェクションプレート、アガロースゲル。</td></tr><tr><td>グローブ</td><td>どんなブランド</td><td></td>でも <td>プロトコルのすべての側面に対応します。</td></tr><tr><td>N2</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>胚注入のために毛細血管から液体を排出すること。</td></tr><tr><td>1,000 & マイクロ;L&nbsp;ヒント</td><td>どんなブランド</td><td></td><td>でも プロトコルのすべての側面に。</td></tr><tr><td>200 &micro;Lのヒント</td><td>どんなブランド</td><td></td><td>でも プロトコルのすべての側面に対応。</td></tr><tr><td>10 &micro;Lのヒント</td><td>どんなブランド</td><td></td><td>でも プロトコルのすべての側面に対応。</td></tr><tr><td>PCRストリップチューブ</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>プロトコルのすべての側面に対応します。</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>あらゆるブランド</td><td></td><td>プロトコルのあらゆる側面に対応します。</td></tr><tr><td>NGSシーケンシングプラットフォーム:Wideseq</td><td></td><td></td><td>あなたの機関がこのサービスを提供していない場合、訪問:https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/(外部費用:$ 35)。</td></tr><tr><td>配列解析</td><td></td><td></td>用ソフトウェア <td>ヘテロ接合魚のサンガーシーケンシング用。参照:http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>配列解析</td><td></td><td></td>用ソフトウェア <td>SnapGene Viewer、NGSシーケンシングの解析用シーケンシングスキャナー。</td></tr></tbody></table>

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に crispr 識別/cas9 生成遺伝子のノックアウト

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

クラスター化された特性が定期的に空間、短い、回文繰り返し化膿連鎖球菌の (CRISPR) システムが急速の様々 な遺伝子の変更を生成するためのカスタマイズ可能なプラットフォームの開発を有効にゼブラフィッシュを含む生物。CRISPR ベース ゲノム編集を使用して単一ガイド RNA (sgRNA) 関心のゲノム DNA (gDNA) ターゲットに CRISPR 関連 (Cas) エンドヌクレアーゼをターゲットに Cas エンドヌクレアーゼが二重鎖切断 (DSB) を生成します。エラーが発生しやすいメカニズム リードの挿入または削除 (オクターリピート) による Dsb の修復。したがってタンパク質 null 対立遺伝子を作成するコーディング シーケンス内では時期尚早停止コドンをしばしば導入フレーム シフト突然変異があります。CRISPR ベース ゲノム工学は分子のいくつかのコンポーネントだけを必要として、微量注射によるゼブラフィッシュ胚に導入が簡単に。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ マイクロインジェクションの CRISPR 試薬を生成して魚類の CRISPR 変更遺伝子の生殖を識別するために使用するメソッドについて説明します。これらのメソッドは、sgRNAs、マイクロインジェクション CRISPR 試薬のヘテロ二本鎖移動性試金 (HMA) と、オクターリピートのキャラクタリゼーションと呼ばれる PCR 法を用いたターゲット ・ サイトの誘導オクターリピートの同定の生体外のトランスクリプションスループットが低いと強力な次世代シーケンス (NGS) の両方を使用して-ヘテロ接合体の魚から収集した複数の PCR の製品を分析することができます基づきます。このプロトコルは、必要な魚の数との種類の分析を実行するために必要な機器の両方を最小限に抑えるために合理化されています。また、このプロトコルに CRISPR ベースの実行に興味を持って研究グループによって経済的に採用するこの強力なツールを有効にする、大学生を含む経験のすべてのレベルの研究所個人使用しやすくする設計ゼブラフィッシュにおけるゲノムの変更。

このプロトコルで記述されている実験的アプローチは、ゼブラフィッシュ ノック アウト行 CRISPR/Cas9 技術を使用しての効率的でコスト効果の高い生産ができます。次の図は、解釈し、このプロトコルを使用して得られた結果のトラブルシューティングを容易にするためにこの資料に含まれています。次の成功した生産、CRISPR 試薬のマイクロインジェクション ゼブラフィッシュ胚はあからさまな表現型と塩基形成 HMA を使用して分析できます。CRISPR 実験の成功を視覚化する有用なコントロールは色素を産生遺伝子を対象とする手順 1.5 で説明した sgRNA の使用チロシナーゼ。チロシナーゼに Cas9 誘起塩基形成色素沈着が失われる結果し、48 である簡単に獲得した hpf (図 1)。注入が成功している CRISPR 試薬の準備を確保する別の有用なコントロール、その実物大を確認します (120 nt) sgRNA は、変性ポリアクリルアミドゲル (図 2レーン 1 と 2) を使用して合成されています。RNA の低下それが表示されます、塗抹標本としてたとえばレーン 3 (図 2) が注入に適さない劣化した RNA を示しています。
チロシナーゼなどあからさまな表現型で起因しない CRISPR Cas9 の対象となる遺伝子の塩基形成頻度を分析するには、HMA 分析、シンプルで信頼性の高い方法です。sgRNA/Cas9 注入された胚のヘテロ二本鎖バンドの形成と homoduplex バンド (図 4) の強度の減少の結果 HMA を使用して分析します。ヘテロ二本鎖バンドの存在は更に大人 (図 4および図 5) 創設者 (の生殖細胞の伝達効率を分析して microinjected の胚から潜在的な創設者魚を識別するためにこのプロトコルで利用されます。図 6)、およびヘテロ F1 魚 (図 7) に塩基の存在を確認します。塩基を含むヘテロ接合体の魚は、NGS、塩基の性質を識別し、時期尚早停止コドンがターゲット遺伝子のコーディング領域に存在かどうかの候補です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> 図 1: ゼブラフィッシュ胚展示 1 細胞期でチロシナーゼをターゲット sgRNA で注射されたとき色素欠損。(A) 野生型、uninjected 48 胚 hpf と (B) は 48 で胚を注入した hpf。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> 図 2: 合成キットを使用して sgRNA のin vitro転写します。Oligosの in vitro転写 sgRNA 合成キットの手順に従ってを使用して合成。500 RNA の ng は、前述の尿素/ページのゲルで実行されました。sgRNA 1 と 2 レーンのロードは、完全な長さ、そのまま 120 nt RNA に対応するバンドを示しています。レーン 3 の sgRNA の注入には適していません、劣化した RNA のサンプルを示しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> 図 3: 24 hpf 注入胚の状態を比較します。生きている胚 (A) 開発 24 hpf は (B) の開発が中止された胚から容易に区別します。(B) のように、または大幅に胚 (a)、脊柱の彎曲などの機能の変更や目の開発は、皿から除去されるべき頭に変更します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> 図 4: SgRNA Cas9 のヘテロ二本鎖移動性試金 microinjected ゼブラフィッシュ胚。サンプルあたり 5 胚のプールは 72 で収集された hpf と gDNA を抽出しました。ヘテロ二本鎖分析を行ったサンプルが 500 と同じように読み込まれた前述のように、DNA の ng。車線: M = 100 bp マーカー;1 = uninjected コントロール2 = 注入例 1;3 インジェクション サンプル 2 を =。バンドのサイズを予想 = 98 bp。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> 図 5: 大人の CRISPR 注入ゼブラフィッシュの尾部から抽出された gDNA のヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。SgRNA と Cas9 タンパク質を注入した胚は大人 (3 ヶ月) に成長しました。魚 B と C ヘテロ二本鎖バンドを展示し、その後送信される生殖オクターリピート; を識別するために繁殖しました。魚 A は、肯定的なヘテロ二本鎖バンドは発生しませんので、その後の分析で使用されませんでした。車線: 1 = 野生型制御;2 = 魚。3 = 魚 B;4 バンドのサイズの魚 C. 期待を = = 98 跪く<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> 図 6: 送信生殖オクターリピートを識別するために野生型魚に F0 CRISPR 注入ゼブラフィッシュの繁殖によって生成された単一の胚のヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。ゼブラフィッシュを交配、72 h 単一胚の成長 F1 胚を採取したと説明したヘテロ二本鎖解析を実行します。車線: 1 = 野生型制御;2-10 レーンあたり 1 つの F1 胚を =。このゲルは、7 のうち 10 胚が、塩基の 70% の生殖伝送率を示す肯定的なヘテロ二本鎖バンドを表示されています。バンドのサイズを予想 = 98 跪く<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> 図 7: アダルト F1 ゼブラフィッシュ尾クリップのヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。F1 成魚オクターリピートを識別する HMA でスコア化しました。肯定的なヘテロ二本鎖バンドの展示魚が突然変異の性質を決定するための PCR 増幅し、広いシーケンス解析のために提出します。(A) 車線: 1 = 野生型制御;2 = 魚、(削除、bp 4 1 bp が一致しません)。(B) これらの F1 魚は同じ創設者から識別され、まだ異なるヘテロ二本鎖パターン、単一の創業者から変更された対立遺伝子複数の生殖を示すを表示します。車線: 1 = 野生型制御;2 魚 (4 bp の挿入、7 bp 不一致), B = 3 = 魚 C (4 bp 削除, 4 bp 不一致)。これらオクターリピートの各は、ターゲット遺伝子のコード配列の NGS によって決定されるへの早期停止コドンを作成しました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュでCRISPR/Cas9技術を使用して標的ゲノム編集を行い、堅牢で安価な方法で遺伝子ノックアウトを操作することです。この方法は、遺伝子が高次真核生物の発生過程にどのように寄与するかなど、脊椎動物モデルシステムの文脈における遺伝子の生物学的役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらのシンプルで堅牢な手順により、学部生を含むあらゆるレベルの経験を持つ研究室の担当者が、ゼブラフィッシュの標的ゲノム改変を行うことができます。この方法を初めて使用する個人は、CRISPR突然変異誘発の最適なゲノムターゲットを特定し、ゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクションを実施し、修飾対立遺伝子を同定するための段階的な指示に従うことができるはずです。この方法は、必要な手法の1つ以上に慣れていない可能性のある学部生を対象としているため、この方法を視覚的に示しておくことが重要です。ガイドRNA産生のためのテンプレート特異的オリゴの設計に関するガイドラインは、テキストプロトコルに記載されています。まず、Cas9タンパク質をバッファーに懸濁して、1ミリグラム/ミリリットルの溶液を生成します。この溶液は、後で使用するために摂氏マイナス80度の注射用アリコートに保管してください。次に、製造元の指示に従って、この記事の資料で提案されているようなin vitro転写キットでsgRNAを合成します。RNAse遊離酢酸アンモニウム沈殿物を用いて、合成したsgRNAを精製します。合成したRNAに25マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウムを加え、ボルテックスして溶液を混合します。次に、150マイクロリットルの200プルーフヌクレアーゼフリーエタノールをサンプルに加えます。そして、反応をマイナス80°Cの冷凍庫に少なくとも20分間置きます。その後、サンプルを最高速度で遠心分離します。RNAペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用して上清を取り除きます。次に、70%エタノールを1ミリリットル加え、チューブを数回反転させてチューブから残留塩を洗い流します。再び最高速度で摂氏4度で7分間遠心分離します。P1000ピペットを使用して、ほとんどの溶液を取り出します。次に、P200ピペットを使用して、ペレットを乱さずに残りの溶液をできるだけ多く除去します。RNAseの汚染を避けるように注意しながら、チューブ内に液滴が見えなくなるまで、清潔なスペースでペレットを乾燥させます。ペレットを30マイクロリットルのRNAseフリー水に再懸濁し、分光光度計を使用して製品を定量します。マイナス80°Cで長期保存するための溶液を分注します。次に、300〜500ナノグラムのsgRNAを等量の2X RNAゲルローディング色素と混合します。次に、P1000ピペットを使用して、アガロースゲルウェルの破片をそれぞれ流動バッファーで数回取り除きます。溶液をアガロースゲルウェルにロードし、ゲルを10ボルト/センチメートルで十分な時間泳動し、ゲル上のRNAバンドを分離します。時間は電気泳動装置によって異なる場合があります。一般に、染料のフロントはゲルの長さの2/3sまで実行する必要があります。次に、核酸染色剤を使用してバンドを視覚化します。インタクト RNA は、ここに示すレーン 1 と 2 のように 1 つのバンドとして表示されます。分解されたRNAは、レーン3のような塗抹標本として実行されます。まず、テキストプロトコルに記載されているように、注射を行う前夜にゼブラフィッシュの被験者を繁殖させる準備をします。次に、Cas9タンパク質とsgRNAを2対1の比率で組み合わせます。溶液を室温で5分間インキュベートし、Cas9とsgRNAがリボ核タンパク質複合体を形成します。次に、十分なRNAseフリー水に0.5マイクロリットルの2.5%フェノール赤色溶液を加えて、最終容量を5マイクロリットルにします。注射針を準備するには、マイクロピペットプーラーを使用して1ミリメートルのガラスキャピラリーを引っ張ります。次に、得られたガラス針の先端をかみそりの刃で切断して、角度のついた開口部を取得します。マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置きます。光学顕微鏡を使用して、針がペトリ皿に1ナノメートルの溶液を一貫して注入するまで、注入圧力を調整します。胚マイクロインジェクションを行う前に、色素のみの溶液を使用して針を準備し、コントロール胚を注入する練習をし、発生の24時間後の生存率を記録します。注射されていないコントロールと比較して、90%以上の生存率を得ることができるはずです。次に、コントロール集団として10〜15個の胚を選択し、それらを別の標識シャーレに配置します。トランスファーピペットを使用して、残りの胚を室温の注入プレートに慎重に並べます。解剖顕微鏡下で、各胚の卵黄嚢に1ナノリットルの溶液を注入します。次に、注入した胚を標識されたペトリ皿に戻し、メチレンブルーの1X E3培地で覆います。注入した胚を摂氏28度のインキュベーターに24時間置きます。次に、注入された胚を検査して、死亡した個体または異常に発達している個体を切除します。まず、注入された胚を含むプレートから5つの72時間齢の胚を2セット、および注入されていない対照群から5つの72時間経過の胚を1セットをマイクロ遠心チューブに収集します。各胚セットから培地を静かにピペットで取り出し、麻酔をかけます。2分後に麻酔薬を取り外し、45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを追加します。次に、サンプルを95度で10分間インキュベートします。次に、インキュベーターからサンプルを取り出し、室温まで冷まします。5マイクロリットルの1モルpHトリス塩酸塩を加え、サンプルを激しくボルテックスします。次に、溶液を室温で最高速度で3分間遠心分離します。ゲノムDNAを含む上清を新しい標識チューブに移し、gDNAをマイナス20°Cで保存します。本文に記載されているように、sgRNA標的領域の周囲を増幅するように設計されたプライマーを使用して、ヘテロデュプレックス解析用のPCRフラグメントを増幅します。PCRクリーンアップキットを使用して、PCR反応の産物を精製します。サンプルを30マイクロリットルの水で希釈し、分光光度計を使用してDNAを定量します。PCRアンプリコンの入ったチューブを沸騰水浴のフローティングラックに入れます。次に、30%ポリアクリルアミドを使用して15%ポリアクリルアミドTBEゲルを調製します。ゲルが固まったら、TBEランニングバッファー付きの電気泳動装置に入れます。次に、500ナノグラムの再アニーリングされたPCR産物をロードし、sgRNAサンプルの各セットの隣にコントロールをロードします。ゲルを150ボルトで2時間半、または染料の前面がゲルの底に来るまで泳がせます。ゼブラフィッシュの胚を注入して成体になるまで成長し、HMAにヘテロデュプレックスバンドを示します。HMAを解釈するには、野生型の非注入コントロールのPCRからのホモデュプレックスバンドの強度を、対応する注入サンプルと比較します。十分な切断が行われた場合、注入された魚からのバンドの強度は、野生型コントロールよりも約50%低くする必要があります。潜在的な創設者の親魚にインデルの存在を確認するには、0.004%トリカインで魚を麻酔し、きれいなカミソリの刃を使用して尾びれの1/2〜3/4を取り除きます。次に、尾を45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムに入れます。魚を回収タンクに戻し、前述のようにgDNA抽出を行います。次に、テールクリップgDNAでHMAを行い、CRISPR注入によって個体が正常に修飾されたかどうかを判断します。次に、尾部DNAにヘテロデュプレックスバンドを示す成体を野生型の魚に繁殖させます。ファウンダーフィッシュを選択して、プールのHMA分析に基づいてF1フィッシュを生成します。最後に、目的の魚のgDNAを配列決定して、インデルの性質を特徴付けます。CRISPR試薬の作製とマイクロインジェクションが成功した後、ゼブラフィッシュの胚の明白な表現型とインデル形成についてHMAを用いて分析しました。Cas9はチロシナーゼでのインデル形成を誘発し、色素沈着の喪失をもたらし、受精後48時間で容易にスコアリングされます。明白な発生表現型をもたらさないCRISPR修飾対立遺伝子の同定は、HMAを用いて行われる。目的遺伝子の標的化が成功すると、ヘテロ二本鎖バンドが形成され、レーン3や4などのホモデュプレックスバンドの強度が減少します。脊椎動物と協力することには倫理的な責任が伴うことを忘れないでください。このプロトコルでは、ノックアウトを得るために必要なゼブラフィッシュの数を最小限に抑える戦略を説明しています。この目標は、この手順を実行する際に考慮すべき目標です。この手法を習得すれば、CRISPR修飾対立遺伝子を保有するゼブラフィッシュを迅速に生成し、同定することができます。ゼブラフィッシュは、生殖細胞系に高効率で伝達されます。重要なことに、この手法は、学部生や経験の少ない他の人に適した低コストのアプローチになるように最適化されています。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュを使用してCRISPRベースの遺伝子ノックアウトアプローチを簡単に設計し、実装する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

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Genetics

遺伝学

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学ぶ CRISPR/Cas9を用いたゼブラフィッシュの遺伝子ノックアウト手法。マイクロインジェクションとヘテロ二重鎖移動度アッセイで変異を同定し、発生生物学における遺伝子機能を解明する効率的なプロトコルです。

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