Name: 並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ インデックスソーティングと内皮細胞共培養を組み合わせたマウス胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析法。単一細胞レベルで表現型と移植能を評価し、発生造血の理解に貢献します。

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フレッド ハッチンソン流れ Cytometry コア援助を FACS でアンドリュー ・ ベルガー、ステイシー堂園とブライアン螺鈿に感謝したいと思います。この作業は、付属の共同助成金 #HL099997 と NIDDK 付与 #RC2DK114777 国立機関の健康 NHLBI UO1 グラント #HL100395、によって支えられました。ブランドン Hadland をサポートするには、アレックスのレモネードは、財団スタンドとホイール基礎現代希望。

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
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<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
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<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
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<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
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<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
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<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
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萌芽期の開発中に HSC 創世記の研究は、まだ移植成人レシピエントにおける血液造血系長期を提供する能力の欠けている hemogenic 前駆体の潜在的な HSC を検出するための手段を必要とします。このプロトコルで提案するクローン胚 hemogenic 前駆体法血管ニッチ ECs に間質の混合培養による HSC の前駆体の成熟化をサポートするには、AGM から移植アッセイで後続の機能解析と.設立許可の並べ替えインデックスのアッセイの表現型の pre-HSC 表面マーカーによって定義されているプロパティを特徴付けるパラメーターの回顧の分析が含まれています。このアプローチにより一括の効率的なスクリーニングの潜在的なマーカーを有効にする再 aggregation ベース HSC の試金4,5,10、前駆体集団の並べ替えに依存するその他の方法上の利点個々 のセルの表面のマーカーの相対的な表現のレベルについての情報を提供すると同時に、pre HSC。この方法を使...

クローン研究は、高齢化1時に HSC サブタイプと HSC の動作の変更に新しい洞察力を提供する大人の HSCs の長期生着特性における不均一性を明らかにしました。ただし、胚性造血の研究およびその前駆物質によっては、難しくされています。初期胚の中に造血前駆細胞呼ばれる非定常過程の hemogenic 内皮細胞として知られている人口から生じる内皮細胞から造血転移2として。最初の HSC では、エアコンの成人のレシピエントに移植に続く堅牢で、長期の多能生着を提供するために彼らの能力によって定義されている超低周波3 でマウスの胚の胚日 10.5 (E10.5) 後まで検出されません。.HSC (pre-HSC) hemogenic 内皮細胞から発生する前駆物質開発の間に移植の試金4,5で効率的な生着を可能にする大人の HSC のプロパティを取得する前に成熟を受ける必要があります。,6。 まれな HSC の起源、赤芽球系、造血前駆細胞の多数の研究を隠すこと、骨髄性とリンパの可能性がすでに前 HSC7,8から HSC の出現する前に検出されました。したがって、事前 HSC を区別する他の造血前駆細胞クローン細胞を分離し、HSC では、移植の試金でその生着プロパティを検出するために十分な成熟のための信号を提供するためのメソッドが必要です。
Hsc の前のヴィヴォや生体内での成熟によって前 HSC の検出を実現するアプローチの数が記載されています。前のヴィヴォメソッドは、AGM 地域、開発9で最初の HSC を検出する場所などの萌芽期ティッシュの文化に依存しています。これらのメソッドは、プロトコルは、解離を組み込む建物並べ替え、および再集計 AGM 組織の許可している傍大動脈内 E11.5 E9.5 から開発中に HSC 前駆体を含む並べ替えられた個体群の特性評価splanchnopleura (P Sp)/AGM 地域4,5,10;ただし、これらのアプローチはクローン解析に必要な単一セルのレベルで前駆物質のハイスループット解析に従順ではありません。同様に、新生マウスへの移植による生体内で成熟、微小環境は HSC の前駆体の初期の段階のサポートに適して見なされどこにも有効な卵黄嚢と AGM から並べ替えられた個体群の研究/P Sp (P Sp は AGM に前駆体領域) pre-HSC では、これらのメソッドの特性とも単一の堅牢なプラットフォームを提供するために失敗する細胞分析11,12。
Rafiiらの研究は、その Akt 活性化血管内皮細胞 (EC) 間質は大人 HSC の自己複製の in vitro13,14,15のサポートのためニッチ基板を提供することができますを示しました。我々 は最近、AGM 地域 (AGM-EC) から派生した Akt 活性化 EC は適した体外ニッチ、分離早くも大人接が hsc の開発で E9 およびそれに続くのと同様、hemogenic の前駆体の成熟化の判断生成された HSC16の自己更新します。このシステムは、単純な 2次元の共培養を採用し、それは個々 に絶縁されて hemogenic 前駆体の HSC 可能性のクローン解析の容易に適応可能であります。
我々 は最近インデックスの AGM EC 共培養と移植後の機能分析とマウス胚からの個々 の hemogenic 前駆体の並べ替えを組み合わせることによりクローン hemogenic 前駆体の HSC の可能性を試金する方法を報告しています。17をの試金します。蛍光活性化のモードなどそれぞれの個別に並べ替えられたセルの表現型パラメーター (すなわち、前方散乱 (FSC-A)、側散布 (SSC-A)、蛍光パラメーター) すべて (インデックス) を記録する (FACS) をソートするセル インデックスの並べ替えは、これらの並べ替えを次以降の機能解析機能を遡及的に関連付けることができます。FACS ソフトウェアは、各セルに配置された 96 ウェル プレートの位置/よく表現型情報の両方を記録します。この手法は以前エレガントな大人の HSC の不均一性を識別、さらの HSC では、長期的な engrafting のサブセットを豊かにし、転写と HSC の表現型のパラメーターを関連付ける表現型のパラメーターを確認する使用されて1 つのプロパティはセル レベル18,19です。ここでは、胚の開発の初期段階中にユニークな表現型のパラメーターの同定と pre HSC の系統貢献を可能にするこの方法の詳細な方法論を提供します。

<table><tbody><tr><td>AGM-ECの培養媒体strong<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Materials for culture of endothelial cellsTrypLE</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>AGM-EC単層</td></tr>ゼ<tr><td>ラチン0.1%を水で</td>解離するために使用 <td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>AGM-EC単層をプラスチック</td></tr><tr><td>に接着するために使用96ウェル組織培養プレート</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>AGM-EC単層およびインデックスソーティングクローンの共培養に使用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>解剖およびFACS染色に使用</td></tr><tr><td>500mlフィルターボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>9741202</td><td>滅菌フィルターに使用 内皮培</td></tr>地<tr><td><ストロング>AGM-EC培養培地(500ml)</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 mls</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg 10 mls 培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td> <td>に溶解StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Endothelial Mitogen (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>10 mls培地を溶解し、AGM</td></tr><tr><td>インデックスソート</td>コラゲナーゼ(0.25%)のための材料<td></td><td></td><td></td>Materials</tr>を追加<tr><td></td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>胚組織の解離に使用</td></tr><tr><td>3mlシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.22 &microの抗体溶液を滅菌するために使用します。Mシリンジ駆動フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナーキャップ付きFACS 5 mlポリスチレンチューブ</td>用のフィルター抗体溶液を滅菌するために使用 <td>コーニング</td><td>352235</td><td>FACS DAPIの前に細胞塊を除去するために使用</td></tr><tr><td>(H2Oで1 mg/mlストックとして調製)</td><td>ミリポア</td><td>268298</td><td>死細胞をソート</td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32(FcRブロック)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>AGMのFcのレセプター抗体への非特異的な染色を阻止するために使用</td></tr> <tr><td>SORT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG1 κa Isotype Control, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>CD144 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td> <td>のアイソタイプコントロールeBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>染色</td></tr><tr><td>ラット IgG2b κ アイソタイプ制御、PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>抗マウス CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>染色</td></tr><tr><td>ラット IgG1 κ アイソタイプ制御、PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>CD41</td></tr><tr><td>PE 抗マウス CD45 FITC</td> <td>のアイソタイプ制御eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-serum free media (10mls)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 mls</td></tr><tr><td>recombinant mouseine stem cell factor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml ストック) 最終濃度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えヒト FLT3 リガンド (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml ストック) 最終濃度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えヒトトロンボポエチン (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml ストック) 最終濃度 20 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えマウス インターロイキン-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml ストック) 最終濃度 20 ng/</td></tr><tr><td>mlMaterials for Staining co-cultured cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Use for FACS analysis</td></tr><tr><td>Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>ラットIgG2bκアイソタイプ制御、PE-シアニン5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>アンチマウスCD201(EPCR)PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td></td></tr>染色<tr><td>ラットIgG2bカッパアイソタイプ制御、PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>CD201 PE</td></tr><tr><td>アンチマウスLy-6A / E(Sca-1)のアイソタイプ制御APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Isotype control for Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC</td> のアイソタイプコントロール<td>BD Biosciences 553127</td><td></td><td>染色</td></tr><tr><td>ラット IgG2b κ アイソタイプ制御、FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Ly-6G/C および CD3 FITC</td></tr><tr><td>移植用尾静脈注射用材料 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml インスリン注射器、29G 1/2 インチ針付き</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>309306 移植用尾静脈注射に使用</td></tr> translant<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Ly-6G/C PerCP Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色後の末梢血分析のための抗体ラットIgG2aκアイソタイプコントロール、PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>F4/80 PE</td></tr><tr><td>アンチマウスCD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td></td></tr>染色 <tr><td>アンチマウスCD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>550992染色</td></tr><tr><td>ラットIgG2aカッパアイソタイプコントロール、APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td>アンチマウスCD45.1(A20)PE-シアニン7のアイソタイプコントロール</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>ラットIgG2aκアイソタイプコントロール、PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>CD45.1のアイソタイプ制御 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>抗マウスCD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>ラットIgG2aカッパアイソタイプコントロール、APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>CD45.2 APC-eFluor780のアイソタイプコントロール</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II DIVAソフトウェア付き</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II プレートリーダー付き</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>細胞数え用</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>用分注細胞</td></tr><tr><td>FACS解析ソフトウェア</td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

萌芽期の開発中に造血幹細胞 (HSC) の起源を調査する機能は、初期胚における HSC 前駆体の希少性と長期生着能性を識別する機能の試金の不足によって制限されており個々 の推定 HSC の前駆体。ここでは、分離・単一セルのレベルで機能的に検証された HSC 前駆体の同定を可能にする方法論について述べる。まず、駆使し個別に並べ替えの各セルの正確な表現型パラメーターをカタログにインデックス並べ替え HSC の前駆物質の実験的分析のための追加のマーカーと豊かに表現型マーカーの組み合わせを使用しています。第二に、インデックスの並べ替えの各セルは非接が HSC 前駆体多能、長期生着の潜在性と機能的な HSC の成熟を支える大動脈性腺発生 (AGM) 地域から血管性ニッチ間質との共培養移植の試金。この方法論により、機能性生着に秘めたクローン hemogenic 前駆体の表現型のプロパティまたは転写プロファイル、HSC 前駆体の詳細な分析手段を提供するなど他のプロパティの相関単一セルのレベルで開発。

図 1 aは、実験的なデザインの概略を示しています。P-Sp/AGM 組織は、解剖をプールし、コラゲナーゼで解離が、一度インデックス ソートの VE カドヘリンおよび EPCR に抗体と染みが。Pre HSC は、VE カドヘリン+EPCR高(図 1 b) 細胞で濃縮されています。他の蛍光色素標識された抗体遡及的各セルのインデックス ソート中に記録された追加の表現型パラメーターを分析することができます。E11 AGM から代表的な実験の結果, セルは FITC 標識抗 CD45 と PE 共役アンチ CD41 抗体も汚れます。これらの造血固有マーカー VE カドヘリン+EPCR高い人口内の不均一性が観察 (図 1) このステージ5で造血の開発で知られている非同期...

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

この方法の全体的な目標は、マウスの胚発生中のクローン造血幹細胞またはHSC前駆細胞の表現型特性と生着の可能性を特定することです。この方法は、胚発生におけるクローン性HSC前駆体のユニークな系統寄与に関する発生造血の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、造血性前駆体が単一細胞レベルで分析されることです。これにより、希少なHSC前駆体を区別するユニークな表現型特性を同定することができます。まず、性交後9.5〜11.5日の間に胚から解剖した組織である大動脈-生殖腺-メソネフロス(AGM)を、10ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルの円錐管に氷上に10%FBSを添加します。組織がチューブの底に落ち着いたら、上清を吸引し、すぐに0.25%コラゲナーゼ1ミリリットルをサンプルに加えます。摂氏37度の水浴中で25分後、1ミリリットルのPBSとFBSで反応を停止し、1ミリリットルのピペットチップを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで組織を20〜30回回転させます。次に、さらに8ミリリットルのPBSとFBSで細胞を希釈し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを500マイクロリットルのブロッキングバッファーに氷上で5分間再懸濁します。次に、目的の抗体カクテルを500マイクロリットル追加します。氷上で15〜20分間インキュベートした後、細胞を8ミリリットルのPBSとFBSで洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮なPBSとFBSに再懸濁します。35マイクロメートルのセルストレーナーで細胞をろ過して5ミリリットルのチューブに入れ、さらに3ミリリットルのPBSとFBSでストレーナーを洗浄して、すべての細胞を回収し、細胞を再度遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルのPBSとFBSに再懸濁し、細胞を氷上に置きます。シングルセルおよびインデックスソーティングモードでソーティング用のゲートを設定するには、少量の細胞をフローサイトメーターにロードし、取得を最低流量に設定します。前方散布図領域と側面散布図のプロットを開き、さまざまなサイズのセルが含まれるようにゲートを設定します。前方散布図面積と前方散布図の幅のプロットと、横散布図の面積と側面散布図の幅のプロットを開き、各プロットにダブレットを除外するゲートを設定します。前方散布区対DAPIプロットを設定して、生細胞をゲートします。次に、抗血管内皮カドヘリンと抗内皮タンパク質C受容体プロットを作成し、血管内皮カドヘリン陽性および高内皮タンパク質C受容体発現細胞をゲートします。大動脈-生殖腺-メソネフロス細胞をインデックスソーティングするには、AGM無血清培地とサイトカイン中のAGM内皮細胞で予備培養した96ウェルプレートをフローサイトメーターのプレートブロックに置き、実験サンプルをロードします。サンプル取得を開始し、96ウェルプレートの各ウェルにシングルセルをソーティングするために、インデックスソーティングシングルセルモードが選択されていることを確認します。1つの細胞をプレートの各ウェルに選別したら、プレートを摂氏37度、CO25%に設定した組織培養インキュベーターに最大7日間入れます。共培養期間の終わりには、さまざまなサイズと形態の造血コロニーを倒立顕微鏡で100倍の倍率で視覚化できます。フローサイトメトリーでクローンを解析するには、マルチチャンネルピペットを使用して、内皮細胞を剥離することなく、造血細胞を内皮層から解離します。次に、100マイクロリットルの細胞を新しい96ウェルV底プレートの個々のウェルに移し、残りの100マイクロリットルの細胞を含む元の96ウェルプレートを組織培養インキュベーターに戻します。V底プレートの細胞を遠心分離でペレット化し、プレートを反転させてフリックすることで上清を1回の高速動作で除去します。各ウェルのペレットを50マイクロリットルのブロッキングバッファーで摂氏4度に再懸濁します。5分後、目的の抗体カクテルを各ウェルに加え、摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、各ウェルを200マイクロリットルのPBSとFBSで洗浄し、遠心分離の終わりにプレートをフリックして上清を捨てます。ペレットを50マイクロリットルのPBSとFBSに再懸濁し、標準的なフロー分析プロトコルに従って細胞を分析し、造血幹細胞電位を含むコロニーをスクリーニングします。フロー解析により造血幹細胞の表現型を有する細胞を含むウェルを選抜し、マルチチャンネルピペットを使用して元の共培養から残りの100マイクロリットルの細胞を再懸濁し、100マイクロリットルのPBSと2%FBSの4番目のレスキュー骨髄細胞に5回10を各ウェルに加えます。各クローンを個々の致死放射線照射レシピエント動物に養子として移植した後、移植後定期的に生着動物から末梢血サンプルを採取する。長期の生着状態にあるクローンを同定するには、標準的なフロー解析プロトコルに従ってフローサイトメトリーでサンプルを解析します。その後、各クローンの表現型特性をその生着特性と相関させることができます。造血前幹細胞は、血管内皮カドヘリン陽性と高レベルの内皮タンパク質C受容体発現によって濃縮できます。他の蛍光色素標識抗体で染色することで、インデックスソーティング中に各細胞について記録できる追加の表現型パラメーターの遡及的解析が可能になります。大動脈-生殖腺-中皮細胞共培養物へのインデックスソーティング後、個々のクローンは大動脈-生殖腺-中皮細胞層に統合され、クローンが丸まって造血クラスターを形成し始めます。5〜7日間の共培養後、さまざまなサイズと形態のコロニーを検出できます。ここでは、共培養後に得られた4つの異なるコロニーが示されており、3つのコロニーは表現型の造血幹細胞と他のより分化した細胞タイプと異なる割合を示し、4番目のコロニーは造血幹細胞マーカー発現を持つ細胞を欠いています。クローン細胞子孫の養子移植により、レシピエントの末梢血の骨髄BおよびT細胞コンパートメントへのドナーの寄与に続く各クローンの長期的な多系統生着能力を経時的に評価することができます。造血幹細胞の表現型を持つ細胞を含むコロニーのほとんどが長期の生着を達成しましたが、一部のクローンは時間の経過とともに生着を失うため、機能的な多系統の生着を確認するためには移植が必要です。その後、各クローンの機能的造血幹細胞電位を、そのクローンの元のインデックスソーティングパラメータに相関させて、その正確な表現型特性を特定することができます。この手順に続いて、in vitroでB細胞およびT細胞の発生をサポートする間質上の造血子孫の二次培養などの他の方法を実行して、個々の造血前駆体のリンパ球電位に関する追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

このビデオでは、骨髄からHSPCを分離し、蛍光活性化細胞選別技術を使用してHSPCを選別するプロトコルについて説明しています。これは、一重に選別されたHSPCを取得する方法です。これらの選別された細胞を培養してHSPCクローンを得ます。...

HSPCクローンの培養と採取:シングルソーティングされたHSPCクローンの入手方法

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

遺伝子操作マウスモデルから初代腫瘍特異的内皮細胞を分離し、培養する信頼性の高い方法を報告します。...

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。...

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。...

ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

学ぶ インデックスソーティングと内皮細胞共培養を組み合わせたマウス胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析法。単一細胞レベルで表現型と移植能を評価し、発生造血の理解に貢献します。

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

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