人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

この方法の全体的な目標は、半自動プロトコルを使用して、母乳やその他の低バイオマスサンプルから16のSRRNAを増幅することです。この方法は、健康と病気の両方に関連するヒトマイクロバイオームの発生と摂動における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、半自動化されており、比較的簡単に実行でき、分泌物、綿棒、便などの複数のサンプルタイプに適応できることです。

テキストプロトコルに従って全乳を解凍し、アロコートした後、サンプルをGの5000倍、摂氏4度で10分間回転させ、細胞をペレット化します。プラスチック製のヘラまたは大口径のピペットチップを使用して、上部の脂肪層を取り除きます。次に、ペレットを乱さずに、100マイクロリットルを除くすべての上清を取り除きます。

1ミリリットルのPBSで、ペレットを再懸濁して洗浄します。次に、5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの滅菌PBSを追加して、ネガティブコントロールを準備します。懸濁液をきれいな1点5ミリリットル遠心分離管に移し、室温でGの5000倍で1分間回転させます。

次に、1000マイクロリットルの滅菌フィルター付きピペットチップを使用して、上清脂肪層全体を廃棄します。サンプルを破壊および均質化するには、ベータメルカプトエタノールを含む600マイクロリットルの溶解緩衝液をペレットに加え、懸濁液をビーズチューブに移します。溶解バッファーと20マイクロリットルの細菌模擬サンプルを含む1つのポジティブコントロールを調製します。

すべてのビーズチューブを15秒間激しくボルテックスします。次に、温度制御されたボルテクサーでサンプルを摂氏37度、700〜800RPMで10分間加熱します。チューブを自動サンプルディスラプターアダプターセットにロードします。

次に、ビーズでサンプルを30ヘルツで1分間叩きます。アダプターセットを分解し、サンプルプレートを装置の左ロボットアームから右ロボットアームに手動で切り替えます。ビーズは30ヘルツでチューブをさらに1分間叩き、次にチューブを17、Gの200倍、摂氏25度で3分間遠心分離しました。

200マイクロリットルのピペットを使用して、サンプルの上部にある脂肪層や下部のビーズ残留物を取らないように注意しながら、すべての上清を取り除きます。上清をホモジナイザーカラムに塗布します。次に、カラムを最高速度で摂氏25度で3分間遠心分離します。

350マイクロリットルの溶汁を2ミリリットルのメーカーのマイクロ遠心チューブに移します。テキストプロトコールに従ってDNAを単離するには、蓋を切り取り、DNAとRNAの個々のスピンカラムの端を滑らかにします。コレクションチューブのないDNAスピンカラムをローターアダプターに挿入します。

次に、収集チューブを廃棄します。次に、メーカーの指示に従って、自動DNA/RNA精製装置のローディングチャートに従って、ボルテックスされた2ミリリットルのチューブをシェーカーに挿入します。ワンポイント5ミリリットルのコレクションチューブにラベルを付け、ローターアダプターに挿入します。

次に、自動DNA/RNA精製装置のローディングチャートに従って、ローターアダプターを遠心分離機にセットします。フィルターチップ、RNaseフリー水、および試薬を装置の試薬ブロックに挿入した後、装置の蓋を閉じ、装置上でカスタムDNA精製プログラムを実行します。反応が完了したら、シェーカーからチューブ入りのサンプルを採取し、サンプルが残っている場合は、短期保存の場合はマイナス20°C、長期保存の場合はマイナス80°

作業領域とPCRマスターミックスを準備した後、テキストプロトコルに従って、50〜100マイクロリットルのDNAサンプルを96ウェルプレートマップに従って32ウェル機器サンプルアダプターにロードします。各PCRプレートについて、清潔な1ポイント5ミリリットルの収集チューブに30マイクロリットルのPCR水をピペッティングすることにより、2つのネガティブコントロールを設定します。次に、すべてのサンプルをキャップを開いた位置にロックした状態で32ウェル装置サンプルアダプターに置きます。

装置の試薬アダプターで、特定のバーコード番号が付けられた各リバースプライマーのキャップを1つずつ取り外します。ロボットリキッドハンドラーをロードするには、エッジ効果を避けるために試薬アダプターを B1.In 位置に置き、アダプターの一方の端をグリップ側に慎重に置き、もう一方の端をゆっくりと下に下げます。アダプターのすべての角を必ず押してください。

サンプルアダプターをC1の位置に置き、アダプターのすべての角を押すようにします。次に、5ミリリットルのマスターミックスを渦巻きます。キャップを開けて、装置のマスターミックスおよび試薬ブロックのAの位置に置きます。

PCRプレートを、ハーフスカートのPCRプレートを保持するための96ウェル装置のアダプターに置きます。次に、実行を開始し、新しいファイルとして保存します。実行が完了したら、エラーがなかったことを確認します。

次に、12個または8個のストリップキャップを使用してプレートをシールします。激しくボルテックスし、96ウェルプレートスピナーを使用してプレートを1分間スピンダウンします。最後に、プレートを氷の上に置いて、プレートをポスト増幅室に移動し、サーマルサイクラーにロードします。

PCR増幅後、テキストプロトコールに従って品質管理とライブラリ調製を行います。プロトコールの最初のQCステップは、16SV4領域のPCR増幅に続くものです。ここに示すように、各サンプルから1マイクロリットルのPCR産物を電気泳動により分析し、予想されるサイズ対である350〜450塩基対の範囲内にあることを確認しました。

一部の母乳サンプルでは、特定の生成物の生成量が少なく、これらのサンプル中の抽出された微生物DNAのレベルが低いか、抽出中にPCR阻害剤がキャリーオーバーしたことが示唆されています。各サンプルの特定の製品の定量は、シーケンシングのためのサンプルの均等なモルプーリングに必要な容量を決定するために不可欠でした。ターゲットシーケンシング用のプール型ライブラリは、通常、特定のPCR産物によって支配されます。

ライブラリーに大量の非特異的製品がある場合は、ゲル精製ステップをワークフローに追加する必要があります。シーケンシングの結果は、母乳マイクロバイオームに関連する分類群の多様性が高く、各サンプルのシーケンシングリードカウントの数にばらつきがあることを示しています。対照的に、バクテリアモックの分類群の組成とリード数は、以前のワークフロー実行でモックで得られた結果と同等であり、母乳サンプルで観察された変動性は本物の実験結果であり、固有のワークフロー変動性の関数ではないことが示唆されています。

シーケンサーを一晩中稼働させておく場合、この手法は、すべてのサンプルが最初のPCRランに増幅されれば、12〜24サンプルに対して2日で実行できます。そうでない場合は、別のシェルの日が必要です。この手順を試みるときは、汚染を避けるために、PCR前の領域からPCR後の領域に移動するだけであることが重要です。

また、クロスコンタミネーションを避けるために、手袋を頻繁に交換することも重要です。ヒトサンプルの取り扱いは危険であり、適切な保護具やバイオセーフティキャビネットなどの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。