Name: 人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぼう、16S rRNAターゲットシーケンス法を用いてヒトミルクなどの低バイオマス試料から細菌DNAを増幅する半自動化プロトコル。この手法はヒトマイクロバイオームの健康・疾病への関与を解明する研究に有用です。

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プロトコルの開発の Helty Adisetiyo 博士と Shangxin 博士はヤンに感謝したいと思います。全体的なサポートのため、国際母性小児思春期エイズ臨床試験グループ (IMPAACT) は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の国立衛生の健康 (NIH) [受賞番号によって提供されました。UM1AI068632 (IMPAACT LOC)、UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) と UM1AI106716 (IMPAACT LC)、児童保健および人間の開発 (NICHD) のユーニス · ケネディ · シュライバーの国立研究所、国立精神衛生研究所 (NIMH) からの共同資金とします。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。

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16S rRNA の対象となる次世代シーケンスは、マイクロバイ評価18の広く使用されている、急速な手法です。バッチの効果、環境汚染、サンプルのクロスコンタミネーション、感度、再現性など、多くの要因が悪影響実験結果に影響を与えるし、その解釈7,19を混同,20. 良い実験的なデザイン、適切なコントロールの使用方法、ワークフロー ステップの空間的な分離とベスト プラクティスの適用に最も堅牢な 16S 解析を容易にする、マイクロバイ ワークフローを組み込む必要があります。ここで説明されているプロトコルはこれらの各パラメーターが組み込まれています上記の課題に対応し、多様なサンプルの 16S ワークフローを実装する重要な実験的なツールを提供しています。
良い実験デザインは 16S マイクロバイ分析にとって重要です。これには、適正な収集、サンプルの保管だけでなく...

人間を植民地化する微生物は人間の健康、代謝、免疫の開発、疾患感受性と予防接種や薬物療法1,への応答に影響を及ぼす疾患はとても重要と考えられて2. 現在細菌叢の人間の健康に及ぼす影響を理解するための努力を強調内のローカライズされたサイトだけでなく、定義された解剖学的なコンパートメント(すなわち皮膚、腸、口腔など)に関連付けられている微生物の同定これらのコンパートメント3,では、4が。これらの調査の努力を支え、急速な出現と増加アクセシビリティ サンプルの微生物の遺伝の内容 (マイクロバイ) の解析の並列プラットフォームを提供する次世代シーケンサー (NGS) 技術です。多くの生理学的なサンプルに関連付けられたマイクロバイは複雑で豊富な (すなわちスツール), しかし、いくつかのサンプル、マイクロバイで表される (すなわち母乳、下気道) の低いバイオマス、感度、実験的工芸品および可能な汚染の主要な問題になります。マイクロバイ研究と適切な実験的なデザインの共通の課題複数レビュー記事5,6,7,8の対象とされています。
ここに記載した NGS の堅牢な実験的パイプラインは母乳のマイクロバイを特徴付ける rRNA の 16S V4 地域9のターゲット シーケンスに基づきます。人間のミルクのマイクロバイ分析は複雑なヒトの DNA レベル背景11,12,13,14の本質的に低いバイオマス10でだけ、また高と抽出した核酸の PCR 阻害剤15,16の潜在的な持ち越し。このプロトコルは、市販の抽出キットおよびサンプル調製バッチの間で変動を最小限に抑え、半自動化されたプラットフォームに依存します。プロトコルの各ステップを検証し、パイプラインの頑健性の独立したメトリックを提供する品質管理としてのサンプルと一緒に処理は、明確に定義された細菌モック コミュニティを組み込まれています。スツール、直腸、膣、皮膚、疎性結合、および経口綿棒10,17, を含む他のサンプル タイプに容易に適応可能であるそれとの開始点として使用できるプロトコルとしては説明母乳サンプルに固有ですが、マイクロバイ解析を実行したい研究者。

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNAミニキット</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA抽出キット</td></tr><tr><td>エリミナーゼ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>435532</td><td>RNase、DNase、DNA除染剤</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック<td>温度制御ボルテクサー</td></tr><tr><td>バッファーRLTと</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>グアニジンチオシアン酸溶解バッファー/Allprepキットの一部</td></tr><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME は、ジスルフィド結合を減少させることによりRNaseを不可逆的に変性する還元剤です</td></tr><tr><td>LME ビーズ</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>ビーズチューブ</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>自動サンプルディスラプターアダプターセット</td></tr><tr><td>QIAshredder カラム</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>キット内のQIAgen RBチューブ</td><td></td><td></td><td>メーカーの微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>QIAcubeおよび関連プラスチック製品</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>自動DNA/RNA精製装置</td></tr><tr><td>DNA exitusプラス</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>非酵素除染ソリューション</td></tr><tr><td>EBバッファー</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>溶出バッファー</td></tr><tr><td>QIAgilityおよび関連プラスチック製品</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>ロボット液体ハンドラー</td></tr><tr><td>PCR 水</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>バーコード付きリバースプライマー</td><td>Eurofin</td><td>カタログなし #s</td><td>設計および注文</td></tr><tr><td>96 ウェル PCR プレート</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 および関連プラスチック製品</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td> Tapestation Agilent 5067-5585用自動<td>DNA/RNAフラグメント</td></tr><tr><td>アナライザーD1000試薬</td><td></td><td></td><td>サンプルバッファーとラダーは、このキットの一部です</td></tr><tr><td>OneStep PCR阻害剤除去キット</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR阻害剤の除去は、製造元の指示に従って行われます。</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNAクリーンアップキット:シリカ膜ベースのPCR産物精製</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HSアッセイキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ32854</td><td>ジメチルスルホキシドベースの希釈バッファーと色素は、このキットの一部です。</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>微量分光光度計</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #'s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

人間のミルクのサンプルのターゲット 16s シーケンス法

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

微生物の研究が比較的安価、迅速、かつ高スループット シーケンスの開発と普及します。しかし、これらのすべてのテクノロジと同様再現性のある結果は適切な予防とコントロールを組み込んだ室のワークフローに依存します。これは、バクテリアの DNA を汚染すると誤解を招く結果を生成できます低バイオマス サンプルと特に重要です。この記事は、低半ば throughput スケールの 16S リボソーム RNA (rRNA) V4 領域のターゲット シーケンスを使用して人間の母乳サンプルから微生物を識別するために半自動化されたワークフローを詳しく説明します。プロトコル記述から全乳を含む試料: 換散、核酸抽出、増幅 16S rRNA 遺伝子と品質への取り組みと図書館準備の V4 領域のサンプルします。重要なは、プロトコルおよび議論は顕著な準備と適切な正と負のコントロール、PCR 阻害物質の除去、サンプルの汚染を含む環境、試薬による低バイオマス試料の分析には、問題を考慮または実験のソース、および再現性を確保するために設計されたベスト ・ プラクティスの実験。前述のプロトコルは母乳サンプルに固有ですが、綿棒、きちんとした、または保全バッファーで安定化を凍結で収集されたサンプルを含む多数の低と高バイオマス サンプル タイプに適応されます。

ここで提示されたプロトコルには、生成されたデータのミートがプロトコルの感度、特異性、および汚染制御のベンチマーク テストを確認する重要な品質管理 (QC) 手順が含まれています。プロトコルの最初の品質管理手順に従います PCR 増幅 16S V4 地域 (図 2)。各サンプルからの PCR の製品の 1 つの μ L は 315 450 bp (図 2の赤い矢印) の予想されるサイズの範囲内だったことを確認するための電気泳動によって分析されました。いくつかの母乳サンプル生成された特定の製品の量を減らす (図 2 a、3 と 9-11 車線の比較レーン 4-8)、抽出中にそれらのサンプル、または PCR 阻害物質のキャリー オーバーで微生物の DNA を抽出のいずれかの低レベルを示唆しています。2.0 倍未満を生成するサンプルを 315 450 bp 範囲 (<strong class="xfig...

人間のミルク、その他低バイオマス サンプル タイプから 16 s rrna ターゲット シーケンスの半自動化されたワークフローが表示されます。

人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

この方法の全体的な目標は、半自動プロトコルを使用して、母乳やその他の低バイオマスサンプルから16のSRRNAを増幅することです。この方法は、健康と病気の両方に関連するヒトマイクロバイオームの発生と摂動における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、半自動化されており、比較的簡単に実行でき、分泌物、綿棒、便などの複数のサンプルタイプに適応できることです。テキストプロトコルに従って全乳を解凍し、アロコートした後、サンプルをGの5000倍、摂氏4度で10分間回転させ、細胞をペレット化します。プラスチック製のヘラまたは大口径のピペットチップを使用して、上部の脂肪層を取り除きます。次に、ペレットを乱さずに、100マイクロリットルを除くすべての上清を取り除きます。1ミリリットルのPBSで、ペレットを再懸濁して洗浄します。次に、5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの滅菌PBSを追加して、ネガティブコントロールを準備します。懸濁液をきれいな1点5ミリリットル遠心分離管に移し、室温でGの5000倍で1分間回転させます。次に、1000マイクロリットルの滅菌フィルター付きピペットチップを使用して、上清脂肪層全体を廃棄します。サンプルを破壊および均質化するには、ベータメルカプトエタノールを含む600マイクロリットルの溶解緩衝液をペレットに加え、懸濁液をビーズチューブに移します。溶解バッファーと20マイクロリットルの細菌模擬サンプルを含む1つのポジティブコントロールを調製します。すべてのビーズチューブを15秒間激しくボルテックスします。次に、温度制御されたボルテクサーでサンプルを摂氏37度、700〜800RPMで10分間加熱します。チューブを自動サンプルディスラプターアダプターセットにロードします。次に、ビーズでサンプルを30ヘルツで1分間叩きます。アダプターセットを分解し、サンプルプレートを装置の左ロボットアームから右ロボットアームに手動で切り替えます。ビーズは30ヘルツでチューブをさらに1分間叩き、次にチューブを17、Gの200倍、摂氏25度で3分間遠心分離しました。200マイクロリットルのピペットを使用して、サンプルの上部にある脂肪層や下部のビーズ残留物を取らないように注意しながら、すべての上清を取り除きます。上清をホモジナイザーカラムに塗布します。次に、カラムを最高速度で摂氏25度で3分間遠心分離します。350マイクロリットルの溶汁を2ミリリットルのメーカーのマイクロ遠心チューブに移します。テキストプロトコールに従ってDNAを単離するには、蓋を切り取り、DNAとRNAの個々のスピンカラムの端を滑らかにします。コレクションチューブのないDNAスピンカラムをローターアダプターに挿入します。次に、収集チューブを廃棄します。次に、メーカーの指示に従って、自動DNA/RNA精製装置のローディングチャートに従って、ボルテックスされた2ミリリットルのチューブをシェーカーに挿入します。ワンポイント5ミリリットルのコレクションチューブにラベルを付け、ローターアダプターに挿入します。次に、自動DNA/RNA精製装置のローディングチャートに従って、ローターアダプターを遠心分離機にセットします。フィルターチップ、RNaseフリー水、および試薬を装置の試薬ブロックに挿入した後、装置の蓋を閉じ、装置上でカスタムDNA精製プログラムを実行します。反応が完了したら、シェーカーからチューブ入りのサンプルを採取し、サンプルが残っている場合は、短期保存の場合はマイナス20°C、長期保存の場合はマイナス80°Cで保存します。作業領域とPCRマスターミックスを準備した後、テキストプロトコルに従って、50〜100マイクロリットルのDNAサンプルを96ウェルプレートマップに従って32ウェル機器サンプルアダプターにロードします。各PCRプレートについて、清潔な1ポイント5ミリリットルの収集チューブに30マイクロリットルのPCR水をピペッティングすることにより、2つのネガティブコントロールを設定します。次に、すべてのサンプルをキャップを開いた位置にロックした状態で32ウェル装置サンプルアダプターに置きます。装置の試薬アダプターで、特定のバーコード番号が付けられた各リバースプライマーのキャップを1つずつ取り外します。ロボットリキッドハンドラーをロードするには、エッジ効果を避けるために試薬アダプターを B1.In 位置に置き、アダプターの一方の端をグリップ側に慎重に置き、もう一方の端をゆっくりと下に下げます。アダプターのすべての角を必ず押してください。サンプルアダプターをC1の位置に置き、アダプターのすべての角を押すようにします。次に、5ミリリットルのマスターミックスを渦巻きます。キャップを開けて、装置のマスターミックスおよび試薬ブロックのAの位置に置きます。PCRプレートを、ハーフスカートのPCRプレートを保持するための96ウェル装置のアダプターに置きます。次に、実行を開始し、新しいファイルとして保存します。実行が完了したら、エラーがなかったことを確認します。次に、12個または8個のストリップキャップを使用してプレートをシールします。激しくボルテックスし、96ウェルプレートスピナーを使用してプレートを1分間スピンダウンします。最後に、プレートを氷の上に置いて、プレートをポスト増幅室に移動し、サーマルサイクラーにロードします。PCR増幅後、テキストプロトコールに従って品質管理とライブラリ調製を行います。プロトコールの最初のQCステップは、16SV4領域のPCR増幅に続くものです。ここに示すように、各サンプルから1マイクロリットルのPCR産物を電気泳動により分析し、予想されるサイズ対である350〜450塩基対の範囲内にあることを確認しました。一部の母乳サンプルでは、特定の生成物の生成量が少なく、これらのサンプル中の抽出された微生物DNAのレベルが低いか、抽出中にPCR阻害剤がキャリーオーバーしたことが示唆されています。各サンプルの特定の製品の定量は、シーケンシングのためのサンプルの均等なモルプーリングに必要な容量を決定するために不可欠でした。ターゲットシーケンシング用のプール型ライブラリは、通常、特定のPCR産物によって支配されます。ライブラリーに大量の非特異的製品がある場合は、ゲル精製ステップをワークフローに追加する必要があります。シーケンシングの結果は、母乳マイクロバイオームに関連する分類群の多様性が高く、各サンプルのシーケンシングリードカウントの数にばらつきがあることを示しています。対照的に、バクテリアモックの分類群の組成とリード数は、以前のワークフロー実行でモックで得られた結果と同等であり、母乳サンプルで観察された変動性は本物の実験結果であり、固有のワークフロー変動性の関数ではないことが示唆されています。シーケンサーを一晩中稼働させておく場合、この手法は、すべてのサンプルが最初のPCRランに増幅されれば、12〜24サンプルに対して2日で実行できます。そうでない場合は、別のシェルの日が必要です。この手順を試みるときは、汚染を避けるために、PCR前の領域からPCR後の領域に移動するだけであることが重要です。また、クロスコンタミネーションを避けるために、手袋を頻繁に交換することも重要です。ヒトサンプルの取り扱いは危険であり、適切な保護具やバイオセーフティキャビネットなどの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

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細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル...

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

ハイスループット検出と細胞バイオ センサーを用いた次母乳オリゴ糖 (Hmo) の定量化ここで述べる。また示すここでは、このプラットフォーム HMO...

遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコード バイオ センサー

ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S...

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

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HIV標的の抗体依存性細胞性性性過小細胞症アッセイにおけるヒト母乳からの白球細胞の単離

この記事では、実験用マウスからミルクを収集するために使用できるデバイスを組み立てる方法について説明します。このデバイスは手頃な価格で持ち運び可能で、訓練を受けた1人で0.1〜0.5mLの牛乳を採取できます。詳細な搾乳プロトコルも含まれています。...

実験用マウスからの牛乳サンプリングのための効率的な一人用手法

この記事では、実際の実際の環境で、母親自身のミルク微生物叢を使用して低温殺菌されたドナーミルク微生物叢を再構成するためのプロトコルについて説明します。これは、効果的な細菌増殖とマイクロバイオームの調節を示し、産科病院とそれに関連する母乳バンクの日常的なケアにおけるこの手順の実現可能な適用をサポートします。...

母乳微生物叢の個別化再構成:実社会での実行可能なアプローチ

このプロトコルは、高純度のヒト母乳からの細胞外小胞の効果的な単離を促進し、可能にするように設計されています。...

ヒト母乳由来の細胞外小胞の迅速な単離

このプロトコルは、カルチュロミクスとMALDI-TOF MSを組み合わせることで、乳製品中の微生物組成を迅速かつ費用対効果の高い評価を可能にします。従来の培養法よりも短いターンアラウンドタイムで、16S rRNAシーケンシングに匹敵する分類結果を提供します。...

MALDIアプローチ による 細菌プロテオミクスプロファイリングを用いた酪農の微生物安全性の評価

学ぼう、16S rRNAターゲットシーケンス法を用いてヒトミルクなどの低バイオマス試料から細菌DNAを増幅する半自動化プロトコル。この手法はヒトマイクロバイオームの健康・疾病への関与を解明する研究に有用です。

人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

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