活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定

この手順の全体的な目標は、マイクロプレート蛍光測定を使用して、精製されたフラビン含有ミトコンドリアデヒドロゲナーゼのスーパーオキシド/過酸化水素およびNADH産生速度を定量化することです。ミトコンドリアには、単離されたミトコンドリアとは異なる基質および阻害剤の組み合わせを使用して同定された最大12の異なるスーパーオキシド/過酸化水素形成部位を含めることができます。しかし、単離されたミトコンドリアにおける個々の生産部位の放出能力を正確に定量化することに関しては、まだいくつかの困難が残っています。

そして、これは、活性酸素種を生成する望ましくない副反応だけでなく、酸化防止剤の存在や特異性に欠ける阻害剤の使用、および測定を妨げる可能性のある添加剤の使用にも関連しています。ここでは、精製されたフラビン依存性ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるスーパーオキシド/過酸化水素とNADH産生の同時測定方法を示します。この方法は、望ましくない副反応や活性酸素種の消光システムを排除することにより、個々の生産部位のROS産生能を直接かつ正確に定量化できるため、有利です。

また、ROS産生とNADH産生の両方を同時に測定することで、個々の酵素のスーパーオキシド/過酸化水素形成電位と活性を直接比較することも可能になり、ミトコンドリアを用いたアッセイを行う前にROS産生の阻害剤をスクリーニングするのに役立ちます。ここでは、例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体とブタの心臓起源のα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用します。どちらもフラビン含有酵素であり、活性酸素種の既知の供給源です。

さらに、これら2つの酵素は簡単に精製できます。スーパーオキシド/過酸化水素とNADHの同時測定は、蛍光の変化を追跡することによって達成されます。NADHは、その生産を簡単に測定できる独自の固有の蛍光特性を持っています。

一方、スーパーオキシド/過酸化水素の変化には、スーパーオキシドジスムタターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアンプレックスウルトラレッド試薬が必要です。西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で、アンプレックスウルトラレッドは非蛍光分子から蛍光レゾルフィンに変換されます。スーパーオキシドジスムターゼは、研究対象のデヒドロゲナーゼによって形成されたスーパーオキシドが過酸化水素に変換されることを保証します。

アッセイを設定する前に、ワーキングソリューションを調製します。アッセイを効率化するために、すべての試薬を20マイクロリットルのアリコートで96ウェルのブラックプレートのウェルに添加します。ウェル内の各反応の容量は200マイクロリットルであるため、作動溶液は反応ウェルに含まれる濃度の10倍です。

次に、NADH自家蛍光とレゾルフィン蛍光の二重測定のためのキネティックアッセイを実行するようにマイクロプレートリーダーをプログラムします。これを行うには、最初に[手順]を選択し、摂氏25度に設定します。次に、[Start Kinetic]をクリックします。

実行時間を約 5 分に設定し、その後 30 秒の蛍光読み取り間隔を選択します。次に、[Read]をクリックして、アッセイの蛍光測定パラメーターを設定します。ここでは、プローブの位置、蛍光の変化を追跡するために使用される波長、および読み取られるウェルがソフトウェアに入力されます。

蛍光リード用の異なるチャネルも選択され、1つはNADHの自家蛍光専用で、376ナノメートルの励起波長と450ナノメートルの発光波長に設定されています。レゾルフィン蛍光の変化は、565ナノメートルと600ナノメートルで追跡されます。アッセイ条件を設定したら、個々のウェルにバッファーと、NADHとスーパーオキシド/過酸化水素の両方の産生を同時に測定するために必要なさまざまな試薬をロードします。

ウェルに異なる試薬をロードする順序は、以下の通りです。まず、必要な量のバッファーをウェルに添加し、続いて20マイクロリットルの精製酵素溶液を添加します。酵素は、装置内でバッファー内で数分間平衡化されます。

そして、残りの試薬を次の順序で追加します。基板を追加したら、Startを押します。プレートキャリアがリーダーに入り、プロトコルが開始されます。

アッセイ中、生の相対蛍光ユニット(RFU)のリアルタイム出力をソフトウェアを使用して追跡できます。ユーザーは、ウェルレイアウトの上にある[データ]タブを使用して、異なる蛍光読み取りを切り替えることができます。異なる蛍光リードの曲線を選択できることに注意してください。

さらに、キーボードのControlを押しながらウェルを左クリックすると、さまざまな反応をリアルタイムで比較できる複合グラフを生成できます。実験が完了すると、マイクロプレートキャリアは装置から出ます。この時点で、RFU の変更の代表的なグラフの結果が Excel にエクスポートされます。

生のRFU値は、最初に代表的なRFUグラフの[データ]をクリックしてエクスポートされます。これにより、NADHおよびレゾルフィン蛍光の生のRFU値の表が得られます。NADHまたはレゾルフィン蛍光の変化に対応する生のRFU番号を同時にエクスポートできないわけではありません。

エクスポートすると、結果は分析用に整理されます。アッセイを実施する前に生成されたNADHおよびレゾルフィン蛍光の標準曲線を使用して、マイクロモル内のNADH量と時間の経過とともに形成されるピコモル中のスーパーオキシド/過酸化水素の量を計算できます。これに続いて、NADHとスーパーオキシド/過酸化水素の生成速度を計算することができます。

この手順では、アッセイを実施する前に、単離されたフラビン含有デヒドロゲナーゼの純度を確認することが重要です。これは、タンパク質の単純なクーマシー染色を行うか、または異なる基質の存在下で酵素の活性をアッセイすることによって達成できます。DTTのような還元剤は、フラビン結合デヒドロゲナーゼによるスーパーオキシド/過酸化水素産生の基質として機能する可能性があるため、アッセイから除外することをお勧めします。

全体として、この方法は、スーパーオキシド/過酸化水素産生の阻害剤のスクリーニングに使用でき、さまざまなフラビン結合ミトコンドリアデヒドロゲナーゼのROS形成能力を直接比較できるという点で非常に柔軟性があります。このビデオをご覧いただければ、精製されたデヒドロゲナーゼによるROSおよびNADH産生の測定方法について深く理解できるはずです。このアッセイは、単離されたミトコンドリアを用いたより洗練された実験の足がかりとなる可能性があります。