Name: 活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶマイクロプレート蛍光測定法によるフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素からの活性酸素種とNADH産生の同時定量法。個々の産生部位のROS産生能を正確に評価し、酸化ストレス研究に有用な手法です。

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この作品は、自然な科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) によって賄われていた。ビデオ制作は、教育と学習 (CITL) ニューファウンドランドの記念大学のイノベーション センターと共同で実施されました。

1. 化学薬品および精製された酵素
<ol><li>下記材料を調達: PDHC とブタ心臓起源 (または別の精製されたミトコンドリア フラビン); KGDHCH2O2 (30% 溶液)、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸は、+NAD、NADH、CoASH、チアミンピロリン酸 (TPP)、マンニトール、HEPES、ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、3-メチル-2-オキソ吉草酸 (KMV)、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine 試薬 (AUR) と消費者物価指数-613。</li>
</ol>2. アッセイ試薬等の計画
<ol><li>96 ウェル プレートに表 1に従って分析を設定します。 注: 各反応の総体積は 200 μ L ストック濃度が調整試薬の 20 μ L を追加できるような各ウェルに。これにより、補因子と基板も分析を開始する前にそれぞれの反応を迅速に追加。</li>
	<li>220 mM マンニトール、70 mM ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM と 20 mM HEPES (塩酸で pH 7.4) を含む反応バッファーを準備します。 注: これは異なる精製酵素の物性に応じて変更できます。</li>
	<li>Coomassie 染色5または酵素活性アッセイ14,16,17に用いた汚染またはイムノブロットによって浄化された KGDHC または PDHC を確認します。</li>
	<li>すべて試薬作業液濃度が表1 に従って反応バッファーを準備します。</li>
	<li>-20 ° C で 1 mL 因数としてすべての試薬を格納します。ストア ピルビン酸、α-ケトグルタル酸自動酸化と繰り返し凍結融解による自然劣化を防ぐために 100 μ L の因数で-80 ° c。</li>
	<li>AUR 試薬 1 ml の DMSO のマスターの在庫を準備し、反応バッファー 100 μ M に希釈しています。光から保護されたストア。 注: ここでは、100 μ M の作業ソリューションは、すべて 2 〜 3 週間で作った新鮮な光から保護します。</li>
</ol>3. 分析テンプレートを設定します。
<ol><li>デュアル測定機能単色マイクロ プレート リーダーの試金プロシージャを設定します。</li>
	<li>読み取り手順を定義するには、「プロトコル」を選択します。「プロシージャ」をクリックします。</li>
	<li>25 の ° C (図 1 a) に「温度」を設定。</li>
	<li>(図 1 a) 読み取り条件を設定する「運動を開始」をクリックします。時間と読み取り間隔/実験の数を設定します。</li>
	<li>クリックして「読み取り」(図 1 b)。 注: サンプルは、トップの位置からリード 50 のゲインを持つ。時間: 5 分 30 の間隔で読みます。チャネル 1: ら蛍光の励起/蛍光 = 565 nm:600 nm、波長幅 13.5 nm。チャネル 2: NADH 蛍光の励起/蛍光 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。</li>
	<li>「読み取り」、[モニター (例えば、A1 A4、B1 B4) に井戸を選択します。</li>
	<li>「キネティック ・ エンド」を選択します。</li>
</ol>4. 標準曲線
<ol><li>試薬を解凍し、必要になるまで氷の上を格納します。</li>
	<li>
NADH 標準曲線 (図 2 a)
	<ol>
<li>NADH の反応バッファーに 0.5 ~ 10 mM の濃度範囲で作業ソリューションを準備します。</li>
		<li>井戸 180 μ L 反応バッファーを含む溶液濃度を作業ごとの NADH から 20 μ 因数を追加します。それぞれ NADH の最終濃度じゃ 0.05 1 mM。</li>
		<li>「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。 注: これは読み取り専用エンドポイント - 速度論的パラメーターは必要ではありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AUR 標準曲線 (図 2 b)
	<ol>
<li>反応バッファーにおける過酸化水素の株式を働いているを準備します。ストック濃度 200 4,000 nM の範囲です。</li>
		<li>120 μ L の反応液を各ウェルに追加します。</li>
		<li>HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 U/mL、井戸に最終濃度 = 3 U/mL) 20、SOD の μ L (ストック濃度を作業 = 250 U/mL、井戸に最終濃度 = 25 U/mL) と AUR の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 100 μ M、井戸に最終濃度 = 10 μ M) も含む各反応バッファーにします。</li>
		<li>作業もバッファーとアッセイ試薬を含む各在庫ソリューション各 H2O2の 20 μ L を追加します。最終反応量が 200 μ L と H2O2各ウェル内の最終濃度は 20-400 nM。</li>
		<li>25 ° C でプレート リーダーで 1 分版を孵化させなさい</li>
		<li>「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 565 nm/600 nm、波長幅 13.5 nm。これはエンドポイントは読み取り専用であることに注意してください - 速度論的パラメーターは必要ではありません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. O2● - /H2 O2リリースと KGDHC と PDHC NADH 生産の測定
<ol><li>それぞれに追加して各作業ソリューションとボリュームの濃度別の試薬の付加の順序表 1を参照してくださいも。</li>
	<li>各ウェルに 40 μ L の反応バッファーを追加します。KMV または CPI 613 を使用して試金、各ウェルにバッファーの 20 μ L を追加します。</li>
	<li>PDHC または KGDHC の 20 μ L を追加 (1 U/mL、ウェルあたり最終濃度の在庫 = 0.1 U/mL) 各ウェルに。</li>
	<li>2 分の 25 ° C で PDHC と KGDHC を孵化させなさい。</li>
	<li>KMV の 20 μ L を追加 (在庫 = 100 mM、最終濃度 = 10 mM) または 20 μ L の消費者物価指数-613 (ストック濃度を作業 = 1.5 mM、最終濃度 150 μ M を =) (表 2)。 注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。</li>
	<li>25 ° C で 1 分間インキュベートします。 注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。</li>
	<li>HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 台/mL、井戸に最終濃度 = 3 ユニット/mL) と SOD の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 250 単位/mL、井戸に最終濃度 = 25 単位/mL) 各ウェルに。</li>
	<li>コエンザイム A の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 最終濃度 1 mM = 0.1 mM)、20 TPP の μ L (ストック濃度を作業 = 3 mM、最終濃度 = 0.3 mM)、および NAD+の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 10 mM、最終濃度 = 1 mM) 各 wエル。</li>
	<li>AUR 試薬を保護のアルミ箔カバーから外し、各ウェルに 20 μ L を追加します。</li>
	<li>ピルビン酸の 20 μ L を追加 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) PDHC と α-ケトグルタル酸を含む井戸 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) に井戸は、KGDHC を含みます。</li>
	<li>「読む」運動の測定を開始するをクリックします。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>キーボードの「CTRL」ボタンを押し、チャンネル 1 (図 3 a) に対応するすべての速度論的測定値を含む 1 つグラフを生成する井戸をクリックします。</li>
	<li>(図 3 b) 異なる時点で測定される相対的な蛍光ユニット (RFU) の生の値の右上隅で表示アイコンに「データ」をクリックします。</li>
	<li>分析 (表 3) の値をエクスポートします。</li>
	<li>2 蛍光チャネルに関連付けられた RFU の値にアクセスする「グラフ」ドロップ ダウン メニューの右上 (図 3 b) をクリックします。</li>
	<li>チャネル 2 の 6.1 に 6.3 の手順を繰り返します。</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
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<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
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<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

開示するものがあります。

このプロトコルは有利なので、1) 2 H2O2検出など、抗酸化システム (ROS の他の情報源)、妨げる可能性がありますそうでなければ任意の競合反応を排除) のネイティブ速度の直接評価ROS をフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素、3 によって解放) ネイティブを比較できます ROS リリース 2 つの率またはより精製脱フラビン ベース、4) ROS のリリースと酵素の活性や 5 の率の直接比較が可能)ROS リリースの競争阻害薬のスクリーニングができます。当社グループは、他のユーザーは、以前の出版物で、アロステリックによって ROS の規制を検討する、このメソッドを使用しているし、酸化還元を実施する前にシグナルがミトコンドリアやグリセリン筋14,16、実験 17,19,<sup class="xre...

栄養代謝の究極の目標は、アデノシン三リン酸 (ATP) をすることです。哺乳類セルのこれはカーボンで ATP に蓄えられたエネルギーを変換する二重の機能を担った細胞小器官ミトコンドリアで発生します。ATP の生産が始まる炭素がミトコンドリア NADH およびフラビンアデニンジヌクレオチド (FADH2)1の 2 つの電子キャリアを形成によって燃焼させる。NADH および FADH2によって酸化されて複数のサブユニット呼吸鎖複合体 I および II、それぞれ、および解放された電子が複雑な IV1ターミナル電子アクセプター分子酸素 (O2) へフェリーで行きます。熱力学的に有利な「下り坂」電子の移動 O2チェーンの終わりには、intermembrane に陽子の輸出に結合複合体 I、III、および IV スペースします。これは、陽子 (プロトン動機力)、2ATP を作る複雑な V によってタップされてギブス自由エネルギーの一時的な形式の貫通型電気化学的勾配を作成します。ミトコンドリアの電子伝達反応は、ATP の生産に完全には結合されていません。クレブスと呼吸鎖の様々 なポイント、電子途中で O2 ROS3形態にやり取りできます。ミトコンドリアによって生成される最も生物学的に関連する活性酸素は O2● -と H2O2。O2● -ミトコンドリアによって形成された近位の ROS と考えは多くの場合、生産のサイトに対して、自由に関連付けられている O2● -と H2O2の混合物を形成することは明白であります。人工フラビンの根本的な化学グループ4,5です。高いレベルで ROS、危険、酸化遭難6細胞機能に必要な生体成分の損傷です。ただし、低額でミトコンドリア ROS は重要なシグナリングの機能を果たします。例えば、ミトコンドリアから放出される H2O2を制御する T 細胞の活性化、ストレス シグナル (例えば、Nrf2 シグナル伝達経路の誘導)、細胞増殖や分化の誘導に関与しています。インスリン シグナルしリリース、および動作7を供給します。活性酸素のシグナル伝達機能を理解する上でかなりの進歩をしました。ただし、重要な質問はまだ残っているに関してミトコンドリアの酵素として最も重要な源および生産を制御する方法。
いくつかの要因に依存する生産のサイトによって ROS リリース: 1) 濃度の電子の寄付サイト、2) 3) 酸素、および 4) 濃度へのアクセス、電子寄付サイトの酸化還元状態と酸化基板3,の種類8,9. NADH および膜の潜在的な強度の濃度も ROS 生産8,10に影響を与えるようなミトコンドリアの他の要因。たとえば、O2● -/H2O2生産精製 PDHC または KGDHC の率は増加 NADH 可用性5,11に増加します。このシナリオでは、PDHC または KGDHC、O2● -/H2O2生産12サイトの E3サブユニットの流行中心に NADH から電子が逆流です。同様に、NAD+の規定は KGDHC12から ROS リリースを減少、反対の効果を持ちます。したがって、活性酸素産生のサイトからの電子制御の出入りを変更できますどのくらい O2● -/H2O2が形成されます。例えば、PDHC の消費者物価指数-613、アナログ、ほぼ 90% 減少 O2● -/H2O2生産13リポ酸と KGDHC E2サブユニットをブロックします。化学 S glutathionylation 触媒、著者、ジスルフィラム、O2● -/H2O2 PDHC または KGDHC を介して生産の E にグルタチオン抱合をほぼ廃止で同様の結果が得られます2サブユニット14。PDHC の KGDHC E2サブユニットを介して電子の流れをブロックするためのトレードオフ (例えば、複合体 III) の電子輸送鎖によって ROS の生成を減少する NADH の生産の減少であります。これはまた電子輸送鎖によって ATP の出力を減らすことができます。全体的に、活性酸素産生のサイトに電子エントリをブロック O2● -/H2O2生産を制御する非常に効果的な手段をすることができます。
ミトコンドリアは、最大 12 潜在的な O2● -/H2O2ソース6を含めることができます。これらのサイトのほとんどは、フラビン含有 O2● -と H2O2の混合物を生成する酵素。呼吸鎖複合体とミトコンドリアの脱水素酵素機能大容量 O2● -/H2O2のサイトを形成する識別に対して異なる基質と阻害剤の組み合わせの使用を許可しました。異なったティッシュ3。PDHC と KGDHC は、筋肉と肝臓のミトコンドリア13,15発光サイト大容量O2● -/H2O2として示されています。ただし、いくつかの困難のまま O2● -/H2O2異なる基質と阻害剤の組み合わせは、ミトコンドリアと影響の個々 のサイトの潜在的な形成の検討に関して酵素の活動。これは、望ましくない副反応 (例えばO2● -/H2O2興味の酵素以外のサイトでの形成) の存在のために汚染内因性栄養素 (例えば、脂肪酸酸) または細胞内小器官 (例えば、ペルオキシソームO2● -/H2O2を形作る)、選択性を欠いている阻害剤の使用や活性酸素産生を完全に抑制しない化合物の使用。特定の阻害剤ミトコンドリアバイオエナジェティックスと電子流れの方向を変更することも、これは生産の他のサイトから ROS リリースを変更し、結果を混同します。O2●/H2O2リリース ミトコンドリアの個々 のサイトからのための絶対速度 O2● -と H2O2の高濃度のため定量化することは困難です。行列と intermembrane スペースで酵素を除去します。したがって、O2● -/H2O2リリース測定を妨害することができます任意の競合反応の除去することができます大容量 O2● -/H2O2 を識別します。サイトを形成します。
脱水素酵素フラビン依存型精製によって O2● -/H2O2生産と NADH 形成の同時受験可能にする簡単な方法を紹介します。精製された酵素を使用してに、原産 O2● -/H2O2生産率である個々 のフラビン酵素のためのより正確な測定を可能にすると、不要な ROS 形成側の反応と活性酸素分解酵素を除去ことができます。このメソッドを使用して直接比較、O2● -/H2O2 O2● -/H2O の異なる精製脱水素酵素または画面潜在的な部位特異的阻害剤の容量を形成できます。2リリース。最後に、O2● -/H2O2と NADH 生産を同時に測定、酵素と活性酸素放出能の関係のリアルタイム評価できます。

<table><tbody><tr><td>ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>精製フラビン酵素</td></tr><tr><td>α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>精製フラビン酵素</td></tr><tr><td>30% 過酸化水素溶液</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>試薬、標準曲線</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>試薬、活性/ROS 放出アッセイ</td></tr><tr><td>NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>試薬、標準曲線ピル</td></tr><tr><td>ビン酸</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>試薬、活性/ROS放出アッセイ</td></tr><tr><td>α-ケトグルタル酸</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>試薬、活性/ROS放出アッセイ</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>試薬、活性/ROS放出アッセイ</td></tr>チ<tr><td>アミンピロリン酸</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>試薬、活性/ROS放出アッセイ</td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>緩衝成分</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>試薬、ROS 放出阻害剤</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td>試薬<td>、ROS放出阻害剤</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>試薬、ROS放出検出</td></tr><tr><td>、西洋ワサビペルオキシダーゼ</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>試薬、ROS放出検出</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>試薬、ROS放出検出</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2マイクロプレートリーダーBioTek</td><td>Instruments</td><td></td><td>アッセイ用マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Gen5ソフトウェア</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>ソフトウェア、生のRFUの収集に使用</td></tr><tr><td>Graphpad プリズム</td><td>グラフパッドソフトウェア</td><td></td><td>ソフトウェア、データ分析</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td><td>Microsoft</td><td></td><td>ソフトウェア、データ解析</td></tr></tbody></table>

活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による nadh 生産の同時測定

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

それは、ミトコンドリアが活性酸素種 (ROS) の最大 12 酵素源を含めることができます報告されています。これらのサイトの大半には、フラビン依存型呼吸鎖複合体と脱水素酵素活性酸素 (O2● -) と過酸化水素 (H2O2) の混合物を生成するがあります。ミトコンの個々 のサイトの ROS 産生能の定量の正確さは抗酸化防衛システムとO2● -/H2O2を形成するも副反応の存在のために困難なことができます。ミトコンドリアの生体エネルギーを乱すことができる非特異的阻害剤の使用は、生産の他のサイトから ROS のリリースを変更することにより測定を脅かされる可能性も。精製フラビン結合脱水素酵素によって H2O2リリースとニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) 生産の同時測定のための簡単な方法を紹介します。我々 の目的はここで、例として精製されたピルビン酸脱水素酵素複合体 (PDHC) と α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (KGDHC) のブタ心臓起源を使いました。このメソッドはネイティブによって生産の個々 のサイトの H2O2解放率の正確な測定のため活性酸素と抗酸化システムの他の潜在的な原因を排除することによってできます。さらに、このメソッドは、H2O2リリースと酵素活性と有効性のスクリーニングと活性酸素産生の阻害の選択性の関係の直接比較のためことができます。全体的に、このアプローチを分離ミトコンドリアやグリセリン筋線維でのより高度な実験を行う前に個々 の酵素の ROS リリースのネイティブ速度の詳細な評価を許可できます。

図 3 aは、H2O2と NADH 生産の同時測定の間に精製された KGDHC によって収集された RFU の代表的なトレースを提供します。RFU のデータ各時間間隔は、図 3Bで描かれています。RFU の生データは、分析のため、エクスポートされます。図 2に示した標準曲線から外挿により 5 分間測定間隔ごとに形成された NADH と H の2O2の絶対量を決定できます。この計算の例は、表 3に提供されます。NADH と H2O2の量によって形成される KGDHC または異なる間隔で PDHC が決定されている、値をコピーし、さらに分析のグラフ ・統計ソフトウェアに入力します。XY グラフ ・ タイプの解析を使用して、NADH (µ...

ミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) を生成することができますいくつかのフラビン依存型酵素を含まれています。ROS を監視ミトコンドリアの個々 のサイトからのリリースは不要な副反応のために挑戦です。簡単、安価な精製フラビン酵素とマイクロ プレート蛍光分析を使用して、ROS リリース ネイティブ料金を直接評価法を提案します。

活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

この手順の全体的な目標は、マイクロプレート蛍光測定を使用して、精製されたフラビン含有ミトコンドリアデヒドロゲナーゼのスーパーオキシド/過酸化水素およびNADH産生速度を定量化することです。ミトコンドリアには、単離されたミトコンドリアとは異なる基質および阻害剤の組み合わせを使用して同定された最大12の異なるスーパーオキシド/過酸化水素形成部位を含めることができます。しかし、単離されたミトコンドリアにおける個々の生産部位の放出能力を正確に定量化することに関しては、まだいくつかの困難が残っています。そして、これは、活性酸素種を生成する望ましくない副反応だけでなく、酸化防止剤の存在や特異性に欠ける阻害剤の使用、および測定を妨げる可能性のある添加剤の使用にも関連しています。ここでは、精製されたフラビン依存性ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるスーパーオキシド/過酸化水素とNADH産生の同時測定方法を示します。この方法は、望ましくない副反応や活性酸素種の消光システムを排除することにより、個々の生産部位のROS産生能を直接かつ正確に定量化できるため、有利です。また、ROS産生とNADH産生の両方を同時に測定することで、個々の酵素のスーパーオキシド/過酸化水素形成電位と活性を直接比較することも可能になり、ミトコンドリアを用いたアッセイを行う前にROS産生の阻害剤をスクリーニングするのに役立ちます。ここでは、例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体とブタの心臓起源のα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用します。どちらもフラビン含有酵素であり、活性酸素種の既知の供給源です。さらに、これら2つの酵素は簡単に精製できます。スーパーオキシド/過酸化水素とNADHの同時測定は、蛍光の変化を追跡することによって達成されます。NADHは、その生産を簡単に測定できる独自の固有の蛍光特性を持っています。一方、スーパーオキシド/過酸化水素の変化には、スーパーオキシドジスムタターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアンプレックスウルトラレッド試薬が必要です。西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で、アンプレックスウルトラレッドは非蛍光分子から蛍光レゾルフィンに変換されます。スーパーオキシドジスムターゼは、研究対象のデヒドロゲナーゼによって形成されたスーパーオキシドが過酸化水素に変換されることを保証します。アッセイを設定する前に、ワーキングソリューションを調製します。アッセイを効率化するために、すべての試薬を20マイクロリットルのアリコートで96ウェルのブラックプレートのウェルに添加します。ウェル内の各反応の容量は200マイクロリットルであるため、作動溶液は反応ウェルに含まれる濃度の10倍です。次に、NADH自家蛍光とレゾルフィン蛍光の二重測定のためのキネティックアッセイを実行するようにマイクロプレートリーダーをプログラムします。これを行うには、最初に[手順]を選択し、摂氏25度に設定します。次に、[Start Kinetic]をクリックします。実行時間を約 5 分に設定し、その後 30 秒の蛍光読み取り間隔を選択します。次に、[Read]をクリックして、アッセイの蛍光測定パラメーターを設定します。ここでは、プローブの位置、蛍光の変化を追跡するために使用される波長、および読み取られるウェルがソフトウェアに入力されます。蛍光リード用の異なるチャネルも選択され、1つはNADHの自家蛍光専用で、376ナノメートルの励起波長と450ナノメートルの発光波長に設定されています。レゾルフィン蛍光の変化は、565ナノメートルと600ナノメートルで追跡されます。アッセイ条件を設定したら、個々のウェルにバッファーと、NADHとスーパーオキシド/過酸化水素の両方の産生を同時に測定するために必要なさまざまな試薬をロードします。ウェルに異なる試薬をロードする順序は、以下の通りです。まず、必要な量のバッファーをウェルに添加し、続いて20マイクロリットルの精製酵素溶液を添加します。酵素は、装置内でバッファー内で数分間平衡化されます。そして、残りの試薬を次の順序で追加します。基板を追加したら、Startを押します。プレートキャリアがリーダーに入り、プロトコルが開始されます。アッセイ中、生の相対蛍光ユニット(RFU)のリアルタイム出力をソフトウェアを使用して追跡できます。ユーザーは、ウェルレイアウトの上にある[データ]タブを使用して、異なる蛍光読み取りを切り替えることができます。異なる蛍光リードの曲線を選択できることに注意してください。さらに、キーボードのControlを押しながらウェルを左クリックすると、さまざまな反応をリアルタイムで比較できる複合グラフを生成できます。実験が完了すると、マイクロプレートキャリアは装置から出ます。この時点で、RFU の変更の代表的なグラフの結果が Excel にエクスポートされます。生のRFU値は、最初に代表的なRFUグラフの[データ]をクリックしてエクスポートされます。これにより、NADHおよびレゾルフィン蛍光の生のRFU値の表が得られます。NADHまたはレゾルフィン蛍光の変化に対応する生のRFU番号を同時にエクスポートできないわけではありません。エクスポートすると、結果は分析用に整理されます。アッセイを実施する前に生成されたNADHおよびレゾルフィン蛍光の標準曲線を使用して、マイクロモル内のNADH量と時間の経過とともに形成されるピコモル中のスーパーオキシド/過酸化水素の量を計算できます。これに続いて、NADHとスーパーオキシド/過酸化水素の生成速度を計算することができます。この手順では、アッセイを実施する前に、単離されたフラビン含有デヒドロゲナーゼの純度を確認することが重要です。これは、タンパク質の単純なクーマシー染色を行うか、または異なる基質の存在下で酵素の活性をアッセイすることによって達成できます。DTTのような還元剤は、フラビン結合デヒドロゲナーゼによるスーパーオキシド/過酸化水素産生の基質として機能する可能性があるため、アッセイから除外することをお勧めします。全体として、この方法は、スーパーオキシド/過酸化水素産生の阻害剤のスクリーニングに使用でき、さまざまなフラビン結合ミトコンドリアデヒドロゲナーゼのROS形成能力を直接比較できるという点で非常に柔軟性があります。このビデオをご覧いただければ、精製されたデヒドロゲナーゼによるROSおよびNADH産生の測定方法について深く理解できるはずです。このアッセイは、単離されたミトコンドリアを用いたより洗練された実験の足がかりとなる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述...

ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

源：エレトラ・レオ1、ルイザ・H.D.カルドーゾ1、サビーヌ・シュミット1、エーリッヒ・グナイガー11オロボロス機器このビデオでは、酸素フラックスを使用して、生きているおよび透過処理された哺乳類細胞のミトコンドリア呼吸を評価する方法について説明します。これは、さまざまな呼吸状態を特徴付けるために、ジギトニン、代謝基質、ADP、アンカプラー、および阻害剤を順次使用することを実証しています。得られた酸素フラックスプロファイルは、定義された条件下でのミトコンドリア機能とエネルギー結合効率を明らかにします。...

生細胞および透過処理細胞におけるミトコンドリア呼吸を評価するための酸素フラックス測定

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。...

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

ここでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。...

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。...

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

この研究では、呼吸測定および酵素アッセイを介してミトコンドリア機能に対する生体異物の影響を研究するための方法論を紹介します。さまざまな種における電子伝達鎖の調節を調べ、昆虫ベクター媒介性疾患に対する標的生物農薬開発に関する洞察を提供します。...

単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

学ぶマイクロプレート蛍光測定法によるフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素からの活性酸素種とNADH産生の同時定量法。個々の産生部位のROS産生能を正確に評価し、酸化ストレス研究に有用な手法です。

活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定

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