Name: フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる急性骨髄性白血病の白血病幹細胞定量法。患者由来異種移植モデルで前駆細胞集団とLSCを検出し、診断時と治療フォローアップで適用可能な臨床的有用性を示す。

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この作品の一部、フランス語協会ローレット Fugain、LigueContre ルがん (北センター)、財団・ ド ・ フランス (白血病委員会)、SIRIC Oncolille、フランス国立がん研究所によって支えられました。

我々 は科学的な目的のための動物の使用のためのヨーロッパ規格に従ってください。本研究は、ローカル倫理委員会 (#3097-2015120414583482v3) によって承認されました。
1. サンプル準備
<ol><li>De novo AML 抗凝固エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む管内から骨髄の mL あたり 1.8 mg の濃度で骨髄 (2 mL) を収集します。</li>
	<li>続いて、赤血球および顆粒球、単核球を分離する密度勾配分離 Ficoll 分離を実行します。生理食塩水リン酸バッファーの 3 つの容積の骨髄を希釈 (PBS: KH2PO4 Na2HPO4 10 mM, KCl 2.7 mM NaCl 137 mM 1.8 mM)。慎重に希釈した骨髄の 1 ボリュームと Ficoll の 1 ボリュームをオーバーレイします。ブレーキなし 300 x g で 30 分間をスピンします。新しい生殖不能の管に mononucleated 細胞の白いバフィー コート層を転送します。</li>
	<li>10 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄)、汚染の血清成分を除去するために、5 分間 300 × g で遠心力場します。</li>
</ol>2. 赤い血球 (RBC) の換散
<ol><li>セル換散バッファー (塩化アンモニウム 0.8%) 2 mL を追加ペレット、渦ゆっくりと 5 分間 300 x g で 5 分遠心室温で孵化させなさい。 注: 必要に応じて、この手順を繰り返します。</li>
	<li>洗浄のセル PBS で前述 (1.3)。</li>
</ol>3. 患者は、異種移植片を派生しました。
<ol><li>Ficoll 分離後骨髄から細胞を入手し、負の選択を使用して免疫リンパ球枯渇後 (T および B リンパ球の CD20 用 CD3)。製造元の指示に従ってください。</li>
	<li>5 x 106急性骨髄性白血病細胞を無条件の NSG マウスの尾静脈に注入します。拘束デバイスを使用して、容易に尾静脈注射。回、個別換気ケージを使用して、層流フードの下で操作まったく従来条件の下で、特に特定病原体フリーの条件の下でマウスを維持します。2 週間ごとに、キャピラリー ヘマトクリット値を用いた顎下コレクションによる血液の 60 μ L を取る。5 mL にキャピラリー丸い底部チューブ。小さな滅菌ガーゼのパッドを使用して穏やかな圧力を適用することで、出血を停止します。きれいな注射器で血を Expulse。</li>
	<li>1 ml の溶解バッファーを追加し、5 分間インキュベートします。300 x g で 5 分間 PBS と 300 x g で centrifugre で洗うで 5 分間遠心します。上清、3 μ L 抗ひと CD45 FITC と 1 μ L 抗マウス 10% ウシ血清アルブミン (BSA) 染色で追加 100 μ L の PBS を除去 CD45 APC と 4 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) の 2 回細胞ペレットを洗ってください。</li>
	<li>流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の6セルの分注までは。</li>
	<li>調査生着させるキメリズム解析による 2 週間ごと (人間対マウス) CD45 表現は、フローサイトメトリー (図 2 a および B) を使用しています。</li>
	<li>犠牲 (周辺爆発数 70% または病気の重篤な臨床症状を超える) で収集単核細胞砕いた脾臓や骨髄から脛骨をフラッシュすることによってし、PBS で大腿骨前述した13。国際ガイドラインに従う頚部転位によってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>細胞ペレットには、赤血球が含まれている場合、は、換散バッファー (ステップ 2.1) と赤の血液細胞の換散を実行します。</li>
	<li>2 回 10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) で洗浄細胞ペレット。</li>
	<li>流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の6セルにセルと分注までを収集します。</li>
</ol>4. 染色
<ol><li>(ステップ 4.2 を参照) に活用された抗体と渦を追加します。室温で暗闇の中で 15 分間インキュベート細胞。</li>
	<li>人間プライマリまたは PDX サンプルから成る抗 CD36 FITC の 10 μ L, 抗 CD19 ECD の 5 μ L、5 μ L 抗 CD33 PC5.5 のアンチ CD90 APC の 5 μ L、5 μ L 抗 CD34 AA700、アンチ CD45RA-APC h7 5 μ L、5 μ L 抗 CD38 パシフィック ブルー、5 μ L の次のパネルを使用します。アンチ CD123 PC7 と 2.5 μ L 抗 CD45 KO の。</li>
	<li>5 分間 300 × g で遠心分離で 2 mL の PBS のセルを洗浄することにより非連結抗体を削除します。</li>
	<li>再最終フローサイトメトリーによる解析の 450 μ L の PBS のセルを中断します。</li>
</ol>5. ゲート フローサイトメトリー解析のための戦略
<ol><li>赤、青、バイオレット レーザーを搭載したフローサイトでデータ集録 (少なくとも 500,000 細胞) を実行します。1) 光学アライメント、2) 流体システム、3) 光感度で、4) fluorospheres を使用して標準化に毎日の cytometer 設定を確認します。</li>
	<li>CD38 式 (図 1) を定義するシーケンシャル ゲート戦略に従います。<ol>
<li>通常骨髄由来細胞を使用して、hematogones または CD38 表現のための肯定的な制御となるプラズマ細胞を定義します。 注: この門は、その定義に依存する後続の推定 LSC 集団として評価するために特に重要です。</li>
		<li>CD45dim/SSC (側方散乱) 低人口基準 (図 1 a) 生理学的前駆体細胞 (通常ブラスト細胞) を定義します。このブラスト集団内で、CD38 を表示する hematogones を定義 + + cd19 表現型 (図 1 b) CD36 および CD33 の式を使用して最後に、生し、monoblasts、および赤芽球 (図 1) を定義します。(図 1E) に示すように、hematogones の CD34 式を決定します。P6 P10 (図 1) として定義されているブラスト細胞内で前駆体のいくつかの集団を評価します。P6、P7, P8 前駆細胞集団に基づいてプリセット CD38 ゲートにブラスト細胞 CD34 コンパートメントを分けます。P8 のコンパートメントに P6 が 1 つ (FMO) コントロール マイナス CD38 蛍光に基づいて CD38 細胞には含まれている、hematogones として同じ CD38 強さを持って爆発が含まれていること、および P7 細胞 CD38 に関して 2 つの両極端の間を保証します。式 (図 1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD34 + 38 - (P6) からゲートの細胞は CD90 と CD45RA 式 (図 1 f) を使用して推定 LSC から HSC を区切ります。 注: HSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90 CD45RA +- と多能性前駆細胞 (MPP)、cd 34 + CD38-CD90 - CD45RA-。推定 LSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA + と未熟なダウン ストリーム人口が cd 34 + CD38 として定義されているプライミング リンパ前駆 (LMPP)-CD90-CD45RA +。</li>
</ol>6. MRD RT-PCR による監視
<ol><li>RT-PCR14を前述のように MRD レベルを監視します。</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

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膜やフローサイトメトリーによる細胞質マーカーの正確かつ再現性のある評価は、機器の設定、毎日光配向、流体システム、光感度、標準化の適切な機能を確認が必要です。キャリブレーション ビーズを使用しています。
パラメトリック最適化を用いたフローサイトメトリー法による CD90 と CD45RA を使用して急性骨髄性白血病でブラスト セル人口の検出は、比較的単純で信頼性の高い方法です。この分析の重要なステップは、cd 34 + CD38-人口の正しいゲートを実行するためにブラスト細胞 CD38 表現の正確な評価です。CD38 強度は、具体的には、hematogones および/またはプラズマ細胞 (CD38 +) 正常骨髄細胞を使用して定義されます。他のマーカーの強度は、アイソタイプ コントロールを使用して定められます。
CD45RA と CD90 の追加は、推定 LSC から HSC を区別するために使用されます。後者とない HSC 多分病気再発の原因、従ってこのプロトコルは流れ cytometry パネルを用いた微小残存病変のための...

急性骨髄性白血病 (AML) は、白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) のクローン病分化、ブラスト細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血機能の要素の生産量が減少します。最近では、ブラスト セル人口のクローンの不均一性の設置する本質的にシーケンス (NGS) の次世代戦略を使用して、腫瘍細胞1のクローン内の進化の存在を示します。
白血病幹細胞 (LSC) の存在する不均一性を拡張します。それは、この動的なセル区画は、白血病の進行と治療中に課せられた様々 な選択圧力を克服するために進化する仮定されます。したがって LSC は現在の化学療法レジメンに耐性があるし、深い臨床的意義2病気の再発を仲介になっています。様々 なマーカーは、ティム 36CD975や CLL 14CD1233LSC の特徴に記載されています。ブラスト細胞の cd 34 + CD38-コンパートメント LSC7豊かに言えますが、また通常 HSC が含まれています。Cd 34 + CD38 に適用される CD90 と CD45RA 式-(P6) コンパートメント (図 1) 正常および悪性造血前駆細胞8のいくつかの段階を分離することができます。具体的には、通常 cd 34 + CD38 CD90 + CD45RA HSCs、多能性前駆細胞 (MPP) cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA-細胞など cd 34 + CD38-CD90-CD45RA + リンパ プライミング多能性前駆細胞 (LMPP) 細胞を急性骨髄性白血病の大半として定めることができる場合8 ,9。CD38 の平均蛍光強度 (MFI) は、CD34 陽性細胞コンパートメントの内で考慮することが大切です。CD38 強度その 3 つの新しい細胞のコンパートメントを定義するため: CD38 負 (P6)、CD38 dim (P7) と CD38 明るい (P8) (図 1)。CD38 の MFI は、これらの細胞は強く CD38 を特急として内部の肯定的な制御として hematogones およびプラズマ細胞のいずれかを使用して決定されるかもしれない。
免疫不全の合図/SCID/IL2Rγcnull (NSG) マウス モデルは通常の生着のため広く使用され悪性ひと造血細胞10,11。シリアル異種アッセイは、LSC または HSC 関数の実験的検証に使用されます。これらの研究は、大規模なシーケンスのアプローチによって広範囲に分析されています。それにもかかわらず、以下はその主な急性骨髄性白血病 (図 2) と比較して NSG マウスにしみ込んで AML ブラスト人口の LSC と HSC イムノフェノ タイプについて知られています。
LSC の番号を本質的に低、LSC の同定及び定量化が困難なここで説明する方法は、(残留 LSC として化学療法応答を評価するフローサイトメトリーアッセイ診断、臨床フォローとして使用する場合があります。急性骨髄性白血病再発を引き起こす)。LSC の存在は肯定的な微小残存病変 (MRD) 可能性があります。までに、MRD 分子法 (すなわちRT-PCR、NGS) に依存して急性骨髄性白血病で大抵監視10,12。しかし、このプロトコルでは我々 検出いくつかの HSC/LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現ヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞に多重流れ cytometry2,8,9。この抗体の組み合わせ可能性があります任意の標準的な流れ cytometry 研究室で適用してこの流れ MRD の試金は、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) による MRD は不可能、特に興味深いすなわち場合、白血病特有の分子マーカーは、診断のアジア ・ マイル リミテッド サンプルで検出されません。さらに、このプロトコルはより敏感な分子 MRD 技術を補完するものそれは検出し、異常な造血前駆細胞を定量化することを目的として表します機能細胞特性 (図 3)。
臨床検査の大半で使用可能な抗体とフローサイトメトリーによる造血前駆細胞の 3 つの集団と成熟度が異なると推定される LSC コンパートメントを定量化する方法を示します。さらに、対応する患者-派生-異種移植片 (PDX) でこれらの細胞コンパートメントの存在を確認し、治療のフォロー アップ。

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>RBC Lysis solution A : 8.29 g の NH4Cl + 0.037 g の Na2EDTA を 100 mL の滅菌 H2O および RBC Lysis solution B に溶かします。 1 g の KHCO3 100 mL の滅菌 H2</td></tr><tr><td>O NOD/SCID/IL2R&γ;cnull&nbsp;(NSG)&nbsp;マウス</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>在庫番号:005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash;MACS分離バッファー</td><td>MACSバッファー Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)&nbsp;</td><td>ベックトン・ディッキンソン</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>アンチCD38-パシフィックブルー (クローンLSI98-4-3, Iotest)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckmanコールター</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>フローセット</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>フローチェック</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>ナビオス・</td><td>ベックマン・コールター</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR フォルテッサ X20</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト PE 選択キット</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; 磁石&nbsp;</td><td>幹細胞技術</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

急性骨髄性白血病 (AML) は異質と致命的な病気を治療されていない場合。成人の白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) の病気差別化、爆発性白血病細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血の機能要素の生産量が減少します。不均一性白血病幹細胞 (LSC) の存在まで、この動的セル白血病の進行と治療中に課せコンパートメントは様々 な選択圧力を克服するために進化しています。LSC 人口をさらに定義するには、CD90 と CD45RA は cd 34 + CD38-細胞コンパートメント内正常造血多能性前駆細胞の差別をことができます。ここでは、多重フローサイトメトリーを用いたヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞にいくつかの推定 LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現を検出するためのプロトコルをまとめました。さらに、3 つの前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。検出のこのメソッドおよび推定 LSC の定量化が化学療法応答の臨床フォロー アップに使用する (すなわち。、微少残存病変)、残留 LSC は急性骨髄性白血病再発を引き起こす可能性があります。

正常および悪性ひと骨髄サンプルで前駆細胞集団を決定する方法をご紹介します。成功 PDX から骨髄および脾臓を収集し、上記のように多重フローサイトメトリーを実行.ブラスト細胞診断患者検体と対応する PDX cd 34 + CD38-前駆コンパートメントでは特に、特に推定 LSC の濃縮のいくつかの集団を比較しました。PDX 診断患者サンプル (0.53%、図 2、 D対 3.48%) と比較しての cd 34 + CD38-ブラストの割合が高かったことがわかりました。興味深いことに、我々 は推定 LSC の割合が高いを発見した (表示 cd 34 + CD38-CD90-CD45RA + 表現型) PDX (0.48%、図 2 e、 F対 2.76%)、プライマリ患者例と比べると、悪性の可能な濃縮を示唆しています。このマウス モデルにおける血液組織の前駆細胞。通常前駆細胞画分の周波数は、PDX と患者のサンプルとの間に差はなかった。 さらに、診断、...

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

この手順の全体的な目標は、診断時および治療フォローアップ時にフローサイトメトリーにより、急性骨髄性白血病および患者由来異種移植片の白血病幹細胞を推定することです。この方法は、急性骨髄性白血病におけるフローサイトメトリーによる白血病幹細胞の定量的評価の臨床的関連性など、血液学/腫瘍学分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、一般的に使用される抗体を持つほとんどの血液学/腫瘍学研究室に適用できることです。この手順は、ポスドクのThomas、大学院生のFanny、および私の研究室のエンジニアであるAdelineによってデモンストレーションされます。まず、de novo AMLから2ミリリットルの骨髄を、抗凝固剤EDTA1ミリリットルあたり1.8ミリグラムを含むチューブに収集します。赤血球および顆粒球から単核細胞を単離するには、まず骨髄を3容量のPBSで希釈します。次に、1容量のフィコールを1容量の希釈した骨髄と慎重に重ね合わせます。密度勾配を300gで30分間休憩せずに回転させます。次に、単核細胞の白いバフィーコート層を新しい滅菌チューブに移します。血清成分を汚染している上清を除去するには、10ミリリットルのPBSを追加し、細胞を300gで5分間遠心分離してから、洗浄を繰り返します。2ミリリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、赤血球を溶解し、穏やかにボルテックスします。その後、細胞を室温で5分間インキュベートします。細胞を300gで5分間遠心分離し、上清を除去します。次に、PBSを使用して細胞を洗浄します。テキストプロトコルに従って骨髄から芽球細胞を単離した後、層流フードの下で、無条件のNSGマウスを拘束装置に挿入し、6番目のAML芽球細胞を尾静脈に10倍5回注入します。マウスを、従来の特定の病原体を含まない条件下で、個別の換気ケージに戻します。2週間ごとに、ヘマトクリット毛細血管を使用した顎下採取法を使用して、60マイクロリットルの血液を採取します。キャピラリーを5ミリリットルのチューブに移し、滅菌ガーゼパッドで穏やかな圧力を加えて出血を止めます。1ミリリットルの溶解バッファーをチューブに加え、穏やかにボルテックスします。その後、細胞を室温で5分間インキュベートします。細胞を300gで5分間遠心分離します。次に、上清を除去した後、100マイクロリットルのPBSと10%BSA、3マイクロリットルの抗ヒトCD45 FITCを加え、30分間インキュベートします。その後、細胞ペレットをPBSで2mL、10%BSAで2回洗浄し、300gで5分間遠心分離します。2週間ごとに、フローサイトメトリーを使用して、ヒトとマウスのCD45発現のキメラ解析による生着を分析します。芽球数が70%を超える場合、または病気の重篤な臨床徴候が観察された場合は、動物を犠牲にし、前述のようにPBSを使用して脛骨と大腿骨を洗い流すことにより、粉砕した脾臓と骨髄から単核芽球細胞を採取します。パネル染色を行うには、標識抗体をヒトの一次サンプルまたは患者由来の異種移植片サンプル、またはPDXサンプルと組み合わせ、チューブをボルテックスします。その後、細胞を暗所で室温で15〜30分間インキュベートします。2ミリリットルのPBSを使用して細胞を洗浄することにより、結合していない抗体を除去します。細胞を450マイクロリットルのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリー分析とMRDモニタリングに進みます。フローサイトメトリーにより細胞質マーカーの膜を正確かつ再現性よく評価するには、光学的アライメントを確認します。3Dシステムと光感度の適切な調整、およびストマジンキャリブレーションを使用した気孔形成は毎日ビートします。正常な骨髄を使用して、CD38のゲートを設定します。最低 500, 000 のイベントが必要であり、各フロー実行が規則的で均質であることが確認されます。さらに、ダブレット、死細胞、細胞破片が除去されます。未熟な造血細胞は、CD45中間体、SSCが低いことによって定義されます。そして、CD38陽性コントロールまたはヘマトゴンは、CD19 / CD38ダブルポジティブです。次に、P8またはCD38陽性、P7またはCD38中間、およびP6またはCD38陰性が定義されます。P6細胞は、さらにHSC、MPP、LSCに細分化できます。正常な骨髄であるため、LSC陰性です。マルチパラメトリックフローサイトメトリーを使用すると、CD34陽性、CD38陰性の芽球分画は、診断患者サンプルと比較してPDXで高いことがわかりました。興味深いことに、PDXでは、主要な患者サンプルと比較して推定LSCの割合が高いことが見つかり、このマウスモデルの血液組織に悪性前駆細胞が濃縮されている可能性が示唆されています。2つの異なる患者サンプルにおける芽球前駆細胞集団を比較すると、CD34陽性、CD38陰性の割合は、診断時の0.06%から最初の患者の最初の治療フォローアップで3.33%に増加しました。対照的に、CD34陽性、CD38陰性の割合は、2人目の患者では診断時の7.8%から最初の治療フォローアップ時の2.27%に減少しました。したがって、推定LSC画分は、最初の患者で診断時の0%から0.65%に増加し、2番目の患者では診断時の6.57%から治療フォローアップ時の1.44%に減少しました。.分子マーカーとして、患者 1 の NPM1 変異と患者 2 の CBF-β MYH11 遺伝子融合を使用した微小残存病変または MRD モニタリングでは、最初の治療フォローアップ ポイントで、最初の患者では 2 番目の患者と比較して分子 MRD の減少が少なかったことが示されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を試行している間は、フローサイトメトリー設定とCD38測定を確認することが重要です。この手順に続いて、機能性白血病幹細胞評価などの追加の質問に答えるために、フローサイトメトリー細胞ソーティングなどの追加の方法を実行できます。このビデオを見れば、患者由来異種移植片の患者サンプル中の白血病幹細胞を検出し、定量する方法を十分に理解できるはずです。患者のサンプルを扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、GOPガイドラインや施設の安全手順などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。...

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ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

ここでは、マウスに異種移植され、骨髄穿刺から得られた急性ヒト骨髄性白血病細胞におけるmTORC1、JAK/STAT5、およびMAPK経路の下流のシグナル伝達を分析するためのリン酸化流サイトメトリーベースの方法について説明します。p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6、p-ERK1/2の各レベルを、高感度の次世代スペクトルフローサイトメーターを用いて同時に測定します。...

急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

このプロトコルは、注射の 4 日後に行われる患者由来の B および T 急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の卵子異種移植...

Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

このプロトコルは、導入化学療法に対する反応のダイナミクスに基づいて、急性リンパ芽球性白血病の再発を生成するためのマウスモデルを説明することを目的としています。...

急性リンパ芽球性白血病に対する導入化学療法への白血病再発のマウスモデル

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。...

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

学ぶフローサイトメトリーによる急性骨髄性白血病の白血病幹細胞定量法。患者由来異種移植モデルで前駆細胞集団とLSCを検出し、診断時と治療フォローアップで適用可能な臨床的有用性を示す。

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

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