胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

この手順の全体的な目標は、ゲノム操作を容易にするために、nasonia vitripennis胚へのマイクロインジェクションを成功裏に行うことです。この方法は、毒の生成や性決定など、nasonia vitripennisの生物学に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術を使用する主な利点は、スズメバチのゲノムを直接操作でき、さまざまな高度なゲノム修飾を提供できることです。

その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるMing Liです。まず、200〜500匹の成虫を虫寮のケージに雌と雄の比率が3対1で配置することにより、いくつかのN.vitripennisコロニーを設定します。スズメバチを摂氏25度プラスマイナス1度に維持し、相対湿度30%、明暗サイクル12〜12

2日間、交配した雌が新鮮なS.bullataの蛹と、1〜10容量の小さな液滴のショ糖水溶液を食べられるようにします。次の2日間、クロバチの蛹を取り除き、メスのハチから産卵部位を奪い、非常に妊娠させます。S.bullotaの蛹の宿主を新鮮に保つために、入手後すぐに摂氏4度で保管し、必要な場合にのみ取り外してください。

赤い色の蛹を持つ若い宿主と、暗い色の蛹を持つ古い宿主を区別します。雌のスズメバチが若い宿主に寄生するのを許すために、個々の新鮮なS.bullataの蛹を中央に開けたフォームストッパーに入れます。寄生の濃度を最大化し、胚の収集を容易にするために、丸みを帯びた宿主の前端の約0.2センチメートルのみを露出させます。これは、より厚く、クレーターのような開口部を含む後端と比較してです。

この配置で宿主の蛹をケージに入れ、ハチが寄生するまで約45分待ちます。寄生した宿主を手で回収し、残っているハチを軽くたたいたり吹き飛ばしたりして、寄生した宿主を取り除きます。それらを約15分ごとに新鮮な宿主と交換して、注射中に初期段階の卵を収集し続けます。

解剖顕微鏡下で、鉗子を使用して、寄生したばかりの宿主の外側の蛹の後端を慎重に剥がし、N.vitripennisの卵を露出させます。次に、液体接着剤を使用して、きれいなスライドガラスにカバースリップを接着することにより、胚アライメントスライドを準備します。濡れた先端の細い絵筆で、宿主の柔らかい蛹の皮膚を傷つけないように、宿主の胚を慎重に払い落とします。

次に、濡れた絵筆で、約20個の胚を1つずつ、カバースリップの側面のすぐ隣にあるスライドに移します。胚の前端をカバースライドの端に向け、胚の後端が同じ方向を向くようにします。これにより、すべての胚間で同じ位置に注入する精度が向上します。

テキストプロトコルに従って注射針を引っ張った後、針先を摂氏25度のダイヤモンド研磨プレートに約10秒間わずかに触れて、針先を面取りします。ゲノム改変試薬からなる注入混合物を調製し、氷上に置いておきます。マイクロローダーチップを使用して、注射針に2マイクロリットルの注射混合物を装填します。

次に、胚が裏打ちされたスライドガラスを複合顕微鏡のステージに置きます。針を胚の後端に垂直に25〜35度慎重に挿入します。次に、1〜5ピコリットルの注射混合物を注入し、注入で胚がわずかに膨らむことを確認します。

目詰まりが発生した場合は、針の面取りをし直してみてください。N.vitripennis胚の細胞質は異常に粘性があり粘着性があり、これが頻繁な針詰まりにつながります。一度に約20〜40個の卵を注入し、その後停止します。

注入した卵を濡れた絵筆で注入した卵に軽く触れて移し、ホストに入れます。次に、新しく産まれた新鮮な卵のバッチを使用して、注入を続けます。理想的には、このステップは、1人が卵子を集めて並べている間に、別の人がゲノム修飾成分を注入し、注入した胚を宿主の蛹に移植しているときに最も効果的です。

マイクロインジェクション後、濡れた絵筆を使用して、以前に刺されたS.bullataの蛹に一度に最大40個のGゼロ胚を1つずつ慎重に配置します。宿主の蛹を湿らせた濾紙と綿球のあるシャーレに入れ、注入された胚が約1〜2日で孵化するまで、摂氏25度、湿度約70%でインキュベートします。重要なことは、宿主は剥がれた蛹のまま残すことができ、N.vitripennisの卵は、乾燥を防ぐために加湿されたチャンバーでインキュベートされている限り、正常に成長します。

Gゼロ胚が孵化した後、宿主の蛹を新しいシャーレに移し、摂氏25度、湿度70%で孵化させます。宿主の蛹と注射されたGゼロ幼虫を毎日監視します。宿主の蛹に悪臭がある場合は、注入した幼虫を新しい健康な宿主の蛹に移します。

N.vitripennis胚への効果的な針の挿入とマイクロインジェクションのために、石英、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸などのフィラメントを備えたいくつかのタイプのキャピラリーガラス針を使用して、さまざまなマイクロピペットプーラーを試験し、N.vitripennis胚のマイクロインジェクションに効果的な皮下組織のような長い先端を確保しました。ここで使用したゲノム改変成分は、より鮮明なゲノム編集のための混合ガイドRNAとcas9タンパク質でした。この実験では、辰砂遺伝子を標的とするsgRNAをcas9タンパク質とともにさまざまな量でN.vitripennisに注入しました。

この表は、sgRNAとcas9タンパク質の濃度が増加すると生存率が低下するため、生存率が用量依存的であったことを示しています。この手順を試みるときは、湿らせた細い先端の絵筆または胚ピックを慎重に使用して、操作または移植中にスズメバチの胚に穴を開けたり乾燥させたりしないように注意することが重要です。このビデオを見た後、高度なゲノム改変を成功させるために、スズメバチの胚を効率的に回収、マイクロインジェクション、移植する方法を十分に理解しているはずです。