マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

この手順の全体的な目標は、マウスの眼から網膜色素上皮細胞を取得し、元の特性を保持したままin vitroで培養する実行可能な方法を実証することです。この方法は、RPE研究者がマウスRPE細胞培養の確立に必要な解剖スキルを習得し、その方法を簡単な方法で実証するのに役立ちます。この手順の主な利点は、シンプルで実現可能であることです。

必要なのは練習だけであり、RPE分離と顕微鏡法の視覚的なデモンストレーションは、文字通り必要なスキルを習得する方法を示しています。マウスの眼球を分離するには、まず承認された方法を使用して2匹のマウスを安楽死させ、手袋を着用して吸収パッドに置きます。親指と人差し指を目の周りに置き、皮膚をそっと押して眼球を膨らませます。

眼球が突き出たら、角度のついたハサミの先端を皮膚と眼球の間に挟み込み、目の周りの組織を離すまで丁寧に切ります。次に、分離した眼を70%エタノールに短時間浸し、ペトリ皿のPBSに浸します。各マウスから両眼を採取した後、解剖を進めます。

解剖顕微鏡の下で、眼の周りから結合組織の大部分を慎重に取り除きます。このステップでは、目を水に浸したままにする必要はありません。これを行うには、縫合鉗子を使用して眼球から結合組織を持ち上げ、バンナスのはさみを使用してそれらを切り取ります。

強膜が切断されると、無傷の後眼カップを取得することは事実上不可能であるため、強膜を切断しないでください。結合組織を洗浄した後、眼球をPBSに浸し、無菌条件下で層流キャビネットでの作業に切り替えます。次に、鉗子を使用して、高濃度のブドウ糖を含む温かいDMEMの皿に目を移します。

20〜30秒後、吸引を使用して洗浄液を交換し、2回目の洗浄を行います。眼球を15 mLチューブ内の温めた2%ディスパーゼII作業溶液に移し、眼を摂氏37度で45分間インキュベートして解離させます。インキュベーション後、眼球は柔らかくなるはずです。

次に、温めた成長培地で同じ容器で目を2回洗います。2回目の洗浄後、増殖培地を新しい培地と交換し、眼球と培地を新しい皿に移して解剖を続けます。解剖顕微鏡の助けを借りて、きれいなベンチで作業を続けます。

鉗子で目を固定することから解剖を開始し、バンナスのはさみを使用してオラセラータの周囲を切開します。眼球を溶液に入れたまま、オラセラータの周囲に切り込みを伸ばして角膜前部を慎重に取り除きます。カットが完了したら、角膜前部を引き抜きます。

次に、水晶体嚢と関連する虹彩色素上皮を、歯付き鉗子を使用してアイカップからそっと引き出して取り除きます。次に、残りの眼で解剖を繰り返し、後眼カップを成長培地で摂氏37度で20分間インキュベートして、RPEからの神経網膜の分離を促進します。20分後、後部のアイカップを4枚の花びらに切ります。

カットは、アイカップを平らにするのに十分な長さにしますが、花びらをつなぎ合わせるのに十分な長さにします。次に、アイカップを平らにして神経網膜を切除します。残りのRPE脈絡膜強膜複合体を利き手ではない手で固定し、網膜を端から非常に穏やかに引っ張ります。.

神経網膜が除去されたら、四分の一のRPE脈絡膜強膜複合体を、温かい成長培地で満たされた新しい無菌培養皿に移します。ペトリ皿で、四分の一のRPE脈絡膜強膜複合体の花びらを超微細鉗子で固定し、顕微手術用三日月ナイフを使用して、下にある基底膜から無傷のRPEシートをそっと剥がします。茶色がかったRPEは、暗く、粘着性があり、ふわふわした脈絡膜と明確に区別できるはずです。

次に、p200マイクロピペットチップを増殖培地で濡らし、そのチップを使用してRPEシートを温めた成長培地を含む新しいディッシュに移します。次に、温めた成長培地でRPEシートを3回洗います。各洗浄ステップの後、網膜や脈絡膜からの破片などの他の組織を避けながら、RPEシートを慎重に収集します。

最後の洗浄後、RPEシートを1.5mLチューブに移し、重力で沈殿させます。次に、層流キャビネットで余分な増殖培地を取り除き、新しく作った温かい増殖培地に細胞を再懸濁します。次に、p200マイクロピペットを使用して、泡を作らずに組織を優しく縮小します。

40〜50回、1細胞懸濁液を作るのに十分な量を漉動します。トリチュレーションが多すぎると致命的になる可能性があるため、注意してください。次に、両方のマウスから採取したRPE細胞を、12ウェル培養プレートのウェル内の1つの12 mLポリエステルメンブレンインサートにプレート

RPE細胞が六角形の形状と色素沈着を保持するために、高い細胞密度が望まれます。12 mmポリエステルメンブレンインサート中の2匹のマウスから確立したマウスの初代RPE培養は、培養で1週間後に90〜95%のコンフルエンシーに達しました。培養に2週間後、細胞は100%コンフルエントになり、六角形の色素細胞と二核細胞のモザイクを形成し始めました。

3週目までに、細胞の形と色素沈着は変化し続けました。しかし、4週間後には細胞の一部が色素沈着過剰になりました。初代RPE細胞培養の純度は、脊椎動物の視覚周期に重要な酵素であるレチノイドイソメロヒドロラーゼを標識するRPE65抗体を用いて評価しました。

細胞間結合および六角形の細胞形状の完全性は、ファロイジンによる染色によって実証されました。タイトジャンクションは、ZO-1タンパク質の発現の分析によって可視化され、アミノ染色を使用して可視化され、ウェスタンブロッティングによって検証されました。全体として、培養物は増殖し、色素沈着とその六角形を保持しながら、タイトジャンクションを形成し、RPE65などの機能マーカーを発現することができます。

このビデオを見れば、マウスの眼からRPE細胞を単離し、in vitroで適切に培養する方法を十分に理解できるはずです。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試みるときは、常に目を濡らしたままにし、できるだけ早く操作するように努めることを忘れないでください。