Name: マウス網膜色素上皮からの一次電池文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶマウス網膜色素上皮細胞の一次培養法。眼球摘出、RPEシート剥離、単離培養の手技を習得し、細胞の特性を維持した培養系を確立できます。網膜生物学研究に活用可能です。

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本研究は、部分的 (DS) に BrightFocus 財団によって賄われていた。

動物を対象とする手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学によって承認されています。
1. ソリューションを準備します。
<ol><li>成長媒体によって補間ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM), 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 mM L-グルタミン 1 x メモリ必須でないアミノ酸と高グルコースを準備します。あらかじめ使用前に 37 ° C の定温器でメディアを温めます。</li>
	<li>2% (重量/巻) 当期 II 作業ソリューションを準備します。<ol>
<li>当期 II 300 μ L HEPES 緩衝生理食塩水 (50 mM HEPES/島 pH 7.4 では、150 mM の NaCl) での 30 mg を溶解して 100 mg/mL dispase II の原液を準備します。このボリュームは、3-4 マウス、スケール アップまたはダウン、実験用マウスの数に基づいてできる)。この株式は、4 ° C で少なくとも 1 週間に保存できます。</li>
		<li>1.2 mL 滅菌 DMEM、高グルコース、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルタ リングに当期 II 在庫 100 mg/mL の 300 μ L を追加することによって 2% 当期の作業ソリューションを準備します。層流無菌条件の下でキャビネットでこの手順を実行する必要があります。事前準備当期 II で使用する前に 37 ° C の定温器を温めます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウスの目の取得についてください。
<ol><li>すべての承認されたメソッドを使用してマウスを安楽死させるし、吸収パッドの上に置きます。</li>
	<li>手袋、親指と人差し指、目の周りを入れて、proptose 眼球に皮膚を優しくプッシュします。</li>
	<li>皮膚と眼球の間の角度のはさみの先端を挿入し、目を慎重にカットします。汚染を避けるためには、70% エタノールで目を簡単にディップします。</li>
	<li>すぐに目のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ペトリ皿でを配置します。</li>
	<li>2.2 2.4 2 番目の目を削除する手順を繰り返します。</li>
</ol>3. 目の解剖
<ol><li>結合組織を解剖顕微鏡の下で目から慎重に取り外します。これは、PBS または乾いたシャーレのいずれか行うことができます。<ol>
<li>縫合鉗子を使用して、眼球から結合組織を持ち上げて Vannas はさみを使用してそれらをカットします。強膜を切る場合にそのまま後方のアイカップを得ることは事実上不可能だから強膜をカットしないでください。</li>
		<li>結合組織を洗浄した後で、次の PBS で生じる眼球がステップに洗い続けます。 注: すべての次の手順は、層流無菌条件の下でキャビネットに行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>予め温めておいた 37 ° C DMEM (高血糖) で 2 回目を洗浄します。慎重に鉗子を使用して予め温めておいた 37 ° C (高血糖) DMEM に眼球を転送します。新しい料理で新鮮な媒体に媒体と転送の眼球を吸引します。</li>
	<li>DMEM (高血糖) 培地を吸引し、37 ° C の定温器で 45 分間に予め温めておいた 2% (重量/巻) 当期 II 使用液で目を孵化させなさい。 注: すべての次の手順で配置、目や成長中の組織を保護し、解剖の良い媒体を提供するアイカップを操作します。</li>
	<li>当期 II ソリューションを削除し、古い培地を吸引し、新しい 37 ° C に予め温めておいた成長培地 (図 1 a) を追加して培地に 2 回目を洗ってください。 注: dispase II による解離後、眼球にソフト。</li>
	<li>鉗子で目を押し又はコナラの周り層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で Vannas はさみを使用してそれぞれの目の切開を行います。<ol>
<li>慎重にソリューションに眼球を維持、拡張又はコナラのまわりをカットとカットが完了したら、前方の角膜を引き離し前方の角膜を取り外します。</li>
		<li>優しく teethed 鉗子 (図 1 b、 1 c)、アイカップからそれらを引き出して、水晶体カプセルと関連付けられた虹彩色素上皮を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE から神経網膜の分離を容易にする 37 ° C で 20 分間培地に結果として得られる後部アイカップを孵化させなさい。</li>
	<li>層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で 4 花びらに後部のアイカップをカットします。カットは花びらの接続 (図 1 d) を保つために十分に短いが、アイカップを平らにするのに十分な長さであるべきです。<ol>
<li>アイカップを平らにし、残りを保持しながら鉗子で引いて非常に穏やか、神経網膜を削除 (図 1e) 別の鉗子で強膜網膜色素上皮-脈絡膜複合体。引き中心ではなくエッジから開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての四つの組織を 37 ° C に予め温めておいた培地でいっぱい新しい培養皿に転送します。</li>
</ol>4 主な網膜色素上皮細胞の分離
<ol><li>四つの強膜網膜色素上皮-脈絡膜の複合体の 1 つの花びらを保持鉗子を超微粉、解剖顕微鏡顕微鏡クレッセント ナイフを使用して、基になる基底膜 (脈絡膜) からそのまま網膜色素上皮シートをそっとはがします(図 1 階)、層流をキャビネットに配置されます。<ol>
<li>P200 ピペットを使用して、成長培地を含む新しい培養皿に網膜色素上皮シートを転送します。RPE シートを転送する際は、数回ピペッティングによる培地でピペット チップを濡れている組織が先端部に付着するを防ぐために。RPE は脈絡膜から明確に区別される: RPE 見えるより茶色、脈絡膜が暗いと付箋とフワフワになります。</li>
		<li>また、14脈絡膜から網膜色素上皮をデタッチするのに酵素消化と鉗子のない穏やかな解離を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 回使用して 37 ° C に予め温めておいた RPE シートを洗って滅菌培養皿の成長培地。各洗浄工程後注意深く破片網膜や脈絡膜などの他の組織を避けながら RPE シートを収集します。最後の洗浄の最後に P200 ピペットと RPE シートを収集し、新しい 1.5 mL 遠心チューブにそれらを置きます。 注: RPE シートを遠心分離する必要はありません: 1 min 以内で重力によって堆積してしまいます。</li>
	<li>P200 ピペットを使用して余分な成長媒体を削除します。予め温めておいた新鮮な培地に細胞を再懸濁し、軽く P200 ピペットを使用してそれらのカップを刻んだ。気泡の形成を避けるため。単一細胞懸濁液が最適です、また、あまりにも多くの製粉を避ける、それ以外の場合網膜色素上皮細胞が生き残ることができません。非常に優しく製粉 40 - 50 回をお勧めします。</li>
</ol>5. 網膜色素上皮細胞の培養
<ol><li>細胞培養プレート上にプレートします。<ol>
<li>網膜色素上皮細胞のダウン ストリーム アプリケーションでは、極性の保持を必要とする場合 12 ウェル培養皿にあらかじめ読み込まれている 1 つの 12 mm ポリエステル膜挿入 2 マウスからプレート、RPE の細胞します。その場合に網膜色素上皮細胞は六角形や色素沈着など、元のプロパティを維持することができるため、高密度に細胞をめっきが望まれます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートを移動しない、または最初の 72 時間培養の成長媒体を変更します。3 日後、古い媒体を予め温めておいた、新鮮な成長媒体に置き換えます。その後一日おきに培養培地を変更します。網膜色素上皮細胞が合流に得れば、培地に FBS を 2% に削減します。 注: セルは、0.25% トリプシンを使用して分割することができます。ただし、分割後は、セルは、六角形の形状とその後通路で色素沈着に失う可能性があります。我々 は、セルの分割はお勧めしませんが、文化の下流のアプリケーションで必要とされる場合一次電池できません無期限に継代すること注意してください: 5-7 通路後解除区別するために知られています。</li>
</ol>

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</ol>

DS は、バイエル ヘルスケア社、ドイツ、f ・ ホフマン ・ ラ ・ ロシュ、スイス連邦共和国からの資金の研究を受けています。残りの著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。この作品は、失明の防止 (ピッツバーグ大学ウィルマー眼研究所に制限されていない補助金) に研究によってサポートされます。 この仕事は、眼科、ピッツバーグ大学から DS にスタートアップ資金に支えられています。

提示された詳細なプロトコルは、マウス初代 RPE 培養 1 週間後の confluency に到達、六角形、2 週間後に色素沈着など主な RPE 特性の信頼性確立をできます。得られた網膜色素上皮細胞は、ビタミン A 代謝9、視細胞外側セグメント10の貪食能およびイオン輸送11、上皮細胞極性2、ライソゾームなどの下流のアプリケーションの数の使用ことができます。恒常性とオートファジー12,13。下流のアプリケーションに応じて伝送による派生文化の形態を検証できる、走査電子顕微鏡観察に従って細部他14。文化の成熟上皮電気抵抗 (TEER) を含める可能性がありますを示すため追加のアッセイ法を網膜色素上皮細胞の極性を示す、4,...

網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある偏光上皮細胞の単一の層です。網膜色素上皮細胞の機能と網膜色素上皮の膜の整合性、ビジョンの重要な RPE 外側血液網膜関門、水と網膜の間のイオンの輸送の管理などの複数のプロセスで主要な役割を果たしているので、脈絡膜、光吸収、酸化ストレス、レチノイド代謝の制御と光受容体1,2の外側のセグメントの貪食作用から保護します。硝子体液を血液から渡すから全身投与薬を防ぐバリアー機能と同様に、目の後ろに RPE の場所で、RPE 関数は、生体内の複雑性を研究することが難しくなっています。したがって、柔軟な制御環境3,4の網膜色素上皮細胞を研究する RPE 細胞培養の確立のための大きい必要があります。
取得し、セルを格納する簡単で便利な方法を提供する確立された RPE 細胞の数が存在します。しかし、継代細胞初代培養細胞2,3,4と比較していくつかの欠点があります。まず、彼らはしばしば、細胞形態の変化によって特徴付けられます。たとえば、既存の細胞のどれも細胞極性表現型の損失とタイトな接合4の部分的な消失により網膜色素上皮のバリア性の信頼性の高い研究に適していること発見されました。極性と適切な細胞間の接続の損失に加えて網膜色素上皮細胞はすぐにアダルト RPE5キー メラニン合成酵素の不在のために色素沈着を失います。色素沈着を復元することができます、しかし、透過型電子顕微鏡の組み合わせを含んでいる再色素沈着のメカニズムの包括的な分析、メラニンの存在を確認する遺伝子表現の分析と化学試金は決して実行される6をされて。1 つ以上の制限は RPE 細胞拡張セル寿命 (時に - 不滅)、特定の条件下で基板と植民地7,をフローティング フォームからデタッチ自己更新の多能性幹細胞に変形できます。8します。 この制限は移植実験3のセルの行を使用することは不可能になります。
確立された RPE 細胞の短所を考慮して新鮮な組織から得られる主な RPE 細胞培養は RPE を勉強するより生物学的に関連するモデルとして役立つかもしれない。など基本の細胞生物学の研究にもビタミン A 代謝9、貪食受容外側セグメント10とイオンの輸送11の RPE に固有の機能を学習するだけでなく、プライマリの網膜色素上皮細胞が使用されている上皮細胞極性2 、ライソゾームの恒常性とオートファジー12,13。
RPE の初代培養の確立に関する出版物の数がずっとある年の最後のカップルで研究3,14,15のこの分野での関心の高まりを示します。人間の網膜色素上皮細胞、ウシおよびブタの網膜色素上皮細胞などの非人間の網膜色素上皮細胞の多数のプロトコルが公開された16,17,18,19。しかし、はるかに小さいサイズのためマウス網膜色素上皮細胞を処理するより困難です。なしの網膜色素上皮細胞を分離するために苦労している多くの研究者はまだにもかかわらず、出版物のかなりの数は、マウス14,20,21から網膜色素上皮細胞を分離するためのプロトコルを記述して、脈絡膜細胞または神経網膜の残骸からのセルの汚染。ここでプライマリ マウス網膜色素上皮細胞培養、マウス、目の解剖および培養細胞を生成する RPE シートの分離から目の取得などを確立するためのプロトコルを提案する.このビデオ プロトコル マウス初代 RPE 培養し解離手法に関するガイダンスを必要とし始めている者に特に有用であります。

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3週齢の野生型マウス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地 (DMEM)、高グルコース</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>シグマ</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>シグマ</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1X、pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Ambion AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック 111000200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPE65抗体</td><td>マイケル・レドモンド</td><td></td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>フルオレセイン・ファロイジン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)、Alexa Flour 568&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>インビトジェン</td><td>A11011&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 ポリクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</強い><</td><td>強い>コメント</強い></td></tr><tr><td><強い>器具および機器</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流キャビネット</td><td>ベイカー</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡(ズーム実体顕微鏡)</td><td>ニコン</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター 熱風除菌</td><td>バインダー</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm ポリエステル メンブレン インサート 12 ウェル培養プレートにプリロード、細孔サイズ: 0.4 & マイクロ;m、滅菌</td><td>コーニング社</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>ウェストコット腱切開はさみ、stdブレード、シャープ</td><td>なスティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>カストロビエホ縫合鉗子 0.12mm</td><td>ストロズ眼科インスツルメンツ</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>三日月形ストレートナイフ</td><td>ビーバービテックインターナショナル</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>デュモンピンセット #5、11 cm、ストレート、0.1x0.06 mm チップ、Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&deg;アングル、スタンダード</td><td>ワールド精密機器</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS シリンジ フィルター ユニット、0.22 & マイクロ;m</td><td>ミリポア</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>倒立実験顕微鏡&nbsp;ライカ DM IL LED</td><td>&nbsp;ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バリアおよびノンフィルターピペットチップ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある高い偏光多機能上皮です。六角にパックされ、タイトな接合で接続されている色素細胞の単一のシートです。RPE の主な機能には、視覚サイクル ライト、小屋視細胞外側セグメントの貪食能、イオンの空間バッファリング、栄養素、イオン水と積極的な関与の輸送の吸収があります。このような重要かつ多様な機能を持つ網膜色素上皮細胞の生物学を研究する重要です。RPE 細胞の数が確立しています。しかし、すぐに自然の網膜色素上皮細胞の形態学的および生理学的な特性のいくつかを失う継代と不死化細胞が知られています。したがって、一次電池は RPE 細胞生物学と機能のさまざまな側面を勉強に適しています。マウス培養網膜色素上皮細胞は研究者に非常に有用なのでマウス モデルは、生物学研究で広く使用されて、しかしマウスから細胞の RPE の収集もその小さなサイズのために非常に挑戦です。ここでは、眼球摘出と目の郭清と培養細胞を生成する RPE シートの分離を含むプライマリ マウス網膜色素上皮細胞の培養を確立するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、効率的な細胞回復をできます。2 つのマウスから得られた網膜色素上皮細胞は文化の真正な RPE の元のプロパティのいくつかは六角形と 2 つの後の色素沈着など細胞の表示 1 週間後培養プレートにあらかじめロード 1 つ 12 mm ポリエステル膜挿入時の密度に達することができます。文化週間。

マウス プライマリ RPE 文化文化で 1 週間後 12 mm ポリエステル膜挿入に達する 90-95% の confluency に 2 マウスから設立されました。文化の 2 週間後のセルは 100% の confluency に達して、六角形、色素、および bi 核細胞のモザイクを形成し始めた。培養、細胞形状と色素沈着、形成を続けて 3 週間でしかし、4 週間後に細胞の部分得た沈着 (図 2)。
主な網膜色素上皮細胞培養の純度 (レチノイド isomerohydrolase、すべてトランス レチノール エステルの中に 11-シス-レチノールへの変換を可能にする脊椎動物の視覚サイクルで重要な酵素の RPE65 抗体を用いた免疫染色によって評価されます。光伝導) (図 3赤)。細胞間結合の整合性と六角形の存在は、phalloinin ...

網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

この手順の全体的な目標は、マウスの眼から網膜色素上皮細胞を取得し、元の特性を保持したままin vitroで培養する実行可能な方法を実証することです。この方法は、RPE研究者がマウスRPE細胞培養の確立に必要な解剖スキルを習得し、その方法を簡単な方法で実証するのに役立ちます。この手順の主な利点は、シンプルで実現可能であることです。必要なのは練習だけであり、RPE分離と顕微鏡法の視覚的なデモンストレーションは、文字通り必要なスキルを習得する方法を示しています。マウスの眼球を分離するには、まず承認された方法を使用して2匹のマウスを安楽死させ、手袋を着用して吸収パッドに置きます。親指と人差し指を目の周りに置き、皮膚をそっと押して眼球を膨らませます。眼球が突き出たら、角度のついたハサミの先端を皮膚と眼球の間に挟み込み、目の周りの組織を離すまで丁寧に切ります。次に、分離した眼を70%エタノールに短時間浸し、ペトリ皿のPBSに浸します。各マウスから両眼を採取した後、解剖を進めます。解剖顕微鏡の下で、眼の周りから結合組織の大部分を慎重に取り除きます。このステップでは、目を水に浸したままにする必要はありません。これを行うには、縫合鉗子を使用して眼球から結合組織を持ち上げ、バンナスのはさみを使用してそれらを切り取ります。強膜が切断されると、無傷の後眼カップを取得することは事実上不可能であるため、強膜を切断しないでください。結合組織を洗浄した後、眼球をPBSに浸し、無菌条件下で層流キャビネットでの作業に切り替えます。次に、鉗子を使用して、高濃度のブドウ糖を含む温かいDMEMの皿に目を移します。20〜30秒後、吸引を使用して洗浄液を交換し、2回目の洗浄を行います。眼球を15 mLチューブ内の温めた2%ディスパーゼII作業溶液に移し、眼を摂氏37度で45分間インキュベートして解離させます。インキュベーション後、眼球は柔らかくなるはずです。次に、温めた成長培地で同じ容器で目を2回洗います。2回目の洗浄後、増殖培地を新しい培地と交換し、眼球と培地を新しい皿に移して解剖を続けます。解剖顕微鏡の助けを借りて、きれいなベンチで作業を続けます。鉗子で目を固定することから解剖を開始し、バンナスのはさみを使用してオラセラータの周囲を切開します。眼球を溶液に入れたまま、オラセラータの周囲に切り込みを伸ばして角膜前部を慎重に取り除きます。カットが完了したら、角膜前部を引き抜きます。次に、水晶体嚢と関連する虹彩色素上皮を、歯付き鉗子を使用してアイカップからそっと引き出して取り除きます。次に、残りの眼で解剖を繰り返し、後眼カップを成長培地で摂氏37度で20分間インキュベートして、RPEからの神経網膜の分離を促進します。20分後、後部のアイカップを4枚の花びらに切ります。カットは、アイカップを平らにするのに十分な長さにしますが、花びらをつなぎ合わせるのに十分な長さにします。次に、アイカップを平らにして神経網膜を切除します。残りのRPE脈絡膜強膜複合体を利き手ではない手で固定し、網膜を端から非常に穏やかに引っ張ります。.神経網膜が除去されたら、四分の一のRPE脈絡膜強膜複合体を、温かい成長培地で満たされた新しい無菌培養皿に移します。ペトリ皿で、四分の一のRPE脈絡膜強膜複合体の花びらを超微細鉗子で固定し、顕微手術用三日月ナイフを使用して、下にある基底膜から無傷のRPEシートをそっと剥がします。茶色がかったRPEは、暗く、粘着性があり、ふわふわした脈絡膜と明確に区別できるはずです。次に、p200マイクロピペットチップを増殖培地で濡らし、そのチップを使用してRPEシートを温めた成長培地を含む新しいディッシュに移します。次に、温めた成長培地でRPEシートを3回洗います。各洗浄ステップの後、網膜や脈絡膜からの破片などの他の組織を避けながら、RPEシートを慎重に収集します。最後の洗浄後、RPEシートを1.5mLチューブに移し、重力で沈殿させます。次に、層流キャビネットで余分な増殖培地を取り除き、新しく作った温かい増殖培地に細胞を再懸濁します。次に、p200マイクロピペットを使用して、泡を作らずに組織を優しく縮小します。40〜50回、1細胞懸濁液を作るのに十分な量を漉動します。トリチュレーションが多すぎると致命的になる可能性があるため、注意してください。次に、両方のマウスから採取したRPE細胞を、12ウェル培養プレートのウェル内の1つの12 mLポリエステルメンブレンインサートにプレート化します。RPE細胞が六角形の形状と色素沈着を保持するために、高い細胞密度が望まれます。12 mmポリエステルメンブレンインサート中の2匹のマウスから確立したマウスの初代RPE培養は、培養で1週間後に90〜95%のコンフルエンシーに達しました。培養に2週間後、細胞は100%コンフルエントになり、六角形の色素細胞と二核細胞のモザイクを形成し始めました。3週目までに、細胞の形と色素沈着は変化し続けました。しかし、4週間後には細胞の一部が色素沈着過剰になりました。初代RPE細胞培養の純度は、脊椎動物の視覚周期に重要な酵素であるレチノイドイソメロヒドロラーゼを標識するRPE65抗体を用いて評価しました。細胞間結合および六角形の細胞形状の完全性は、ファロイジンによる染色によって実証されました。タイトジャンクションは、ZO-1タンパク質の発現の分析によって可視化され、アミノ染色を使用して可視化され、ウェスタンブロッティングによって検証されました。全体として、培養物は増殖し、色素沈着とその六角形を保持しながら、タイトジャンクションを形成し、RPE65などの機能マーカーを発現することができます。このビデオを見れば、マウスの眼からRPE細胞を単離し、in vitroで適切に培養する方法を十分に理解できるはずです。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試みるときは、常に目を濡らしたままにし、できるだけ早く操作するように努めることを忘れないでください。

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

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このビデオでは、我々はマウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離し、クローン網膜球体を形成する文化の中で、それらを成長させる方法を紹介します。分離されている球は、幹細胞の枢機卿性質を有している：自己再生および多能。...

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8日齢マウスの神経網膜を4％ゼラチンブロックの上にある。ビブラトームによる光受容体層（200ミクロン）の単離後、感光体は文化のための機械的および酵素的解離後に播種する。感光層は、分子、生化学的分析または移植のために使用することができる。...

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プロトコルは、マウス 神経網膜のorganotypic型外植体を記述し、その網膜色素上皮(RPE)と共に栽培され、R16で、血清および抗生物質を含まない。この方法は、 インビボ...

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。...

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。...

モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離

このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro...

In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。...

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

学ぶマウス網膜色素上皮細胞の一次培養法。眼球摘出、RPEシート剥離、単離培養の手技を習得し、細胞の特性を維持した培養系を確立できます。網膜生物学研究に活用可能です。

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

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