Name: しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ 高解像度in situ Hi-Cライブラリ生成法をDrosophila melanogasterの原腸形成前胚で。染色質構造と遺伝子発現の3D的関連を発生段階で解明する技術です。

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この研究は、マックス ・ プランク協会によって賄われていた。C.B.H. は分子生物医学国際マックス プランク研究学校-奨学金によって支えられました。EGFP PCNAショウジョウバエキイロショウジョウバエ ラインを提供する親切、シェルビー ブライスとエリック Wieschaus に感謝します。

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ここで提示されたプロトコルはショウジョウバエの初期胚クロマチンのアーキテクチャの高品質なマップを生成するに非常に効果的です。以前のプロトコル34に比べると、説明している方法はここで、最新はその場でやあ-C の手順5、迅速処理、高解像度で、試薬の使用量が減少、その結果を使用します。その場でやあ-C のプロトコルを含む全体の手順は、ステージとショウジョウバエ以外の実験システムの広い範囲で動作する予定です。プロトコルは低入力要件があるので、隔離された細胞集団にも使用できます。ショウジョウバエ範囲外胚のプロトコルを使用していくつかのパラメーターで説明ここでは、特に材料の固定必要があります調整します。以来、古い胚は、遮水性の高いキューティクルを開発し、ホルムアルデヒドの濃度を上げると固定の延長は適切かもしれません。次のように調整する必要があります核燃料サイクル 14 以外の段階で胚のコレクション、1.4 の手順で 25 の ° c の胚のインキュベーション時間: 核燃料サイクル 12、70 分;核燃料サイクル 13、90 分。3-4 hpf、3:30 h。
13 の分裂 (ステージ 1-4) 中、核密度約各部門に倍になります。核は、その明るい GFP 蛍光で簡単に識別できます。有糸分裂の間、eGFP PCNA 核であるし、その信号が胚に分散しています。この機能は、可能な同期切断部門を受けている特定胚をなります。クロマチン構造を勉強するためこれらの分裂の胚は通常望ましくない、クロマチンの分裂組織がき相組織35よりも大幅に異なっているので。具体的には同期の分裂を受けている胚を選択するプロトコルに適応することが可能です。この場合、eGFP PCNA の分散、非原子力分布を持つ唯一の胚を保持する必要がありますと他のすべての胚は破棄しなければなりません。核の密度が決定できないので透過光顕微鏡で見るその形態によって段階の胚の代替手段を用いなければなりません。極細胞と胚周囲核の存在は、周縁部に表示されている cellularization を示す核燃料サイクル 1412に対し胚が少なくとも核燃料サイクル、9 を完了したことを示します。
ハイ-C の実験は、様々 な制限酵素5を使用して正常に実行できます。現在のアプローチは、通常 mboi を検索、HindIII などの 6 塩基認識サイトなどいずれかの 4 塩基配列を認識する酵素を使用します。6 ベース カッター 4 ベース カッターの優位は、遺伝子配列に十分な深さ、および制限のサイトのよりもカバレッジを与え高の潜在的な解像度を提供することです。別の5,23,36,37上の 1 つの 4 ベース カッターの選択の明確な利点はありません。Mboi を検索し、DpnII の 2 つの最も一般的に使用される酵素、両方は同じ GATC 認識サイトを認識します。DpnII はショウジョウバエの心配のである CpG のメチル化に敏感であります。ここで提示されたプロトコルことができますも正常に完了する制限酵素として DpnII を使用しています。セクション 4.2。制限の酵素とバッファーは、メーカーの推奨事項に従って DpnII 互換性のため調整が必要。
配列ライブラリのフラグメントのサイズは、図 2に示した範囲から大きく外れている、シーケンス処理中にクラスター形成が効率や完全に失敗します。この場合、毛刈り後のサイズ分布をチェックする必要があります、せん断パラメーター調整。非常に小さい DNA のフラグメントの分布のピーク (< 100 bp) または非常に大規模な (> 1,000 bp) サイズ ビーズまたは破棄することになっている清の上サイズ選択、キャリーなどの問題を示します。多くの場合 1 つの図のようにはまだなど、これらの望ましくないサイズで小さなピークを持つこれらのライブラリは効率をクラスタ リングのマイナーな減少だけで正常にシーケンスです。
PCR の重複率が高い利用可能なシーケンスの読み込み回数を大幅に短縮するため避けるべきであります。PCR の重複率は入力材料の量に直結します。多くの入力を使用してしたがって通常軽減 PCR 重複の問題。
読み取り読み取り方向(図 2 b)ため、フィルターの高い数値は、不十分な消化、酵素、あまり入力材料または胚の不完全な均質化が小さすぎるを使用しての結果をすることができますを示します。

クロマチン構造キャプチャ (3 C) は1核クロマチンのトポロジーを研究に非常に有用な方法として浮上しています。3 C 型やあ-C は、単一の実験2では核で発生するすべてのクロマチン相互作用の接触の周波数を測定できます。やあ-C のアプリケーション検出および TADs、コンパートメント、ループ3,4,5などのクロマチン組織の多くの基本的な原則の評価で重要な役割を果たしました。
発達的変化と細胞分化のコンテキストでクロマチン アーキテクチャの研究がますますこれらプロセス6,7,8、遺伝子発現制御のメカニズムを解明するため使用 9。大きな関心のモデル有機体の 1 つは、キイロショウジョウバエ、その開発とゲノムがよく特徴付けられるです。ただし、設定されている組織培養体外外ショウジョウバエのクロマチン アーキテクチャを調査するほとんどの研究は、10、11を しました。胚の 16-18 h ポスト受精、TADs とコンパートメントの哺乳類で類似した構造を彷彿された識別された10、ショウジョウバエ胚の間に遺伝子発現制御で遊んでいる役割の質問を発生させます開発。特に、原腸陥入前に、開発の初期段階にこのような研究は技術的に挑戦的です。、原腸陥入前に、ショウジョウバエの胚は 8-60 分サイクル12,13あたりの非常に急速なペースで進む 13 同期の原子力部門を受けます。これに加えて、さまざまな段階を区別するために視覚機能の欠如は、十分な量でしっかりと段階的な胚の材料を得ることが困難。
核燃料サイクルの解像度で初期のショウジョウバエ開発におけるクロマチン アーキテクチャを勉強できるようにするプロトコルを開発するために、我々 は 2 つの既存技術を組み合わせた:その場でやあ-C、高解像度の世代全体を可能にします。ゲノム コンタクト マップ5、および胚ステージング eGFP PCNA transgene13,14を表現する遺伝子組換えショウジョウバエラインを使用します。この遺伝子は、間期核に局在して有糸分裂の胞胚全体への分散します。このプロパティを使用すると、簡単にその核密度によってさまざまな段階と GFP 信号の分散による分裂の胚を区別することが可能です。
一緒に、これらの技術は、20 のショウジョウバエの胚から高解像度でのクロマチンの三次元構造を研究するを有効にします。このプロトコルは、単一原子力部門サイクルから胚の個体数を取得する収穫・選別のショウジョウバエの胚の説明をされています。それはさらに得られた胚を使用してその場でやあ-C を実行する方法について説明します最終的な結果は、シーケンスの次世代機の配列に適した塩基配列ライブラリです。結果として得られる配列の読み取りは、詳細なクロマチン間相互作用マップ全体のショウジョウバエゲノムをカバーに処理できます。

<table><tbody><tr><td>ビオチン-14-dATP</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼ I クレノウフラグメント</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーEL0012</td><td>T4 DNAリガーゼバッファー付属</td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&nbsp;(インデックスプライマーセット 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335</td><td>シーケンシングアダプター、フォワード(インデックスなし)PCRプライマー、リバース(インデックス付き)PCRプライマー、およびライブラリ調製セクションで使用したUSER酵素は、このキットのコンポーネントです</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNAライブラリ調製キット</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645</td><td>End Prep Enzyme Mix、End Prep Reaction Buffer、Ligation Enhancer、Ligation Master Mix、およびPolymerase Master Mixは、ライブラリ調製セクションで使用されました。このキットのコンポーネント</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA System</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell strainer 100 & micro;m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>胚収集バスケット</td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC 蛍光性実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC DFC カメラ</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタル マイクロ 乳棒</td><td>カール ロス</td><td>P985.1</td><td>で胚を溶解するために使用されますステップ 4.1.4</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ</td></tr><tr><td>Ampure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 蛍光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>キュービットアッセイチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA フライ</td><td>S. Blythe と E. Wieschaus</td><td></td><td></td>からの贈り物</tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム 13%</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファー pH 8.0 (1 M) 分子生物学用</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS 分子生物学用</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart バッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B7204S</td><td>制限酵素緩衝液</td></tr><tr><td>PCRヌクレオチドミックス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>11814362001</td><td>未修飾dCTP、dGTP、dTTP</td></tr><tr><td>BSA、分子生物学グレードニュー</td><td>イングランドバイオラボ</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 分子生物学用0.5M溶液</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸ナトリウム3 M pH 5.2</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>磁気スタンド</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>Mixer</td></tr><tr><td>Small Embryo Collection Cages</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>Egg Collection Cage</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブストリップ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA ポリメラーゼバッファー</td></tr></tbody></table>

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

クロマチンの三次元のアーキテクチャを調べて遺伝子制御のメカニズムに非常に貴重な洞察力を提供しています。ここ実行するため、クロマチン構造キャプチャ テクニックその場でやあ-C のプロトコルについて述べるショウジョウバエ胚集団を上演します。結果は、単一の実験核で発生するすべてのクロマチン相互作用のマッピングを可能にするシーケンス ライブラリです。胚の選別は、蛍光実体顕微鏡と核マーカーを含むトランスジェニック フライ ラインを使用して手動で行われます。この手法により、胚集団各核分裂サイクルと定義された細胞周期の状態を使用しては非常に高純度で得られます。プロトコルは、古い胚原腸陥入を超えてを並べ替えるに適応もあります。並べ替えられた胚はその場でやあ-C の入力として使用されます。ライブラリの準備のシーケンスを含むすべての実験は、5 日間で完了できます。プロトコル低入力要件があり入力材料として 20 胚期の胚を使用して確実に動作します。最終的な結果は、次世代シーケンシングのシーケンシング ライブラリです。シーケンス処理の後データを位相ドメイン (TAD) 構造、クロマチンのループ、およびクロマチンの関連付けについての情報を得るために使用可能なツールの広い範囲を使用して分析することができるゲノム広いクロマチン間相互作用マップに処理できます。ショウジョウバエ開発中のコンパートメント。

12、13、および 14 の核燃料サイクルで胚の人口を並べ替え (1:30 に対応する 1:45、および 2:10 時間受精、それぞれ12の記事) とプロトコルで説明されている手順に従って 3-4 h ポスト受精 (hpf) が得られました。並べ替えられた胚の各バッチの eGFP PCNA 信号の写真を撮り、下流の実験で使用されているすべての 1 つの胚の正確なステージと細胞周期の状態を文書化することが可能です。図 1B-Eは、並べ替えられた集団から胚の例の写真を示しています。その場でやあ-C のプロトコルの出力は、次世代シーケンス コンピューターでシーケンス処理する準備ができてのヌクレオチド ライブラリです。この目的のため、少なくとも 2-4 nM の最終的なライブラリ濃度が通常必要です。入力素材の推奨量を使用して、この濃度は確実に(表 1)を達成。
DNA のフラグメント サイズの選択は約 500 bp (2 a を図)によって正確な剪断とサイズ選択パラメーターで最大の 300-600 bp の間後の予想サイズ分布。配列、ゲノムにマップできない制限のフラグメントの数を最小限に抑えるため、少なくとも 75 bp の長さのペアエンド リードをお勧めします。1-2 kb 箱のサイズと高解像度のマップは 4 億読み取りから入手できます。非常に高い深さで単一の複製シーケンスではなく、それぞれを読み取り 1 億 5000 万のより低い深さで複数の生物学的複製をシーケンス処理をお勧めします。これは生物学的変動の評価をできるように、PCR の重複により破棄された読み取りの数を減らすにつながります。視覚的に表現、複製を結合できます。高深度でのサンプルのシーケンスにコミットする前に、図 2 bのように品質パラメーターの基本的なライブラリ確認して浅い配列 (サンプルあたり数百万ヒット) を使用してサンプルを実行するをお勧めします。
やあ-C データの分析には、重要な計算資源と生物情報学の専門知識が必要です。大まかな概要として参照ゲノムにペアの読み取りが個別にマップされます、結果の線形が画質や方向、フィルター処理し、指定された区間の解像度またはフラグメント レベルでの連絡先の行列を生成できます、フィルターから線形。コンタクト マトリックス TADs、ループ、およびコンパートメントを探索すべてさらに下流の分析のための基礎であります。配列読み取りの初期解析、バイオインフォマティクスに複数のパイプラインがあります多くバイオインフォマティクス専門知識18,19,なし連絡先行列に raw 読み取りの処理を使用することにより20,21,22,23。さらに解析を行ってどのように調査の下で正確な生物学的問題に大きく依存し、プログラミングと R または Python スクリプティングにおいて豊富な経験を必要とする可能性があります。ただし、いくつかのツールと TADs を呼び出すアルゴリズムが分析するソフトウェアと同様に、利用可能な5,24,25,26,27,28, とweb ブラウザーで、スタンドアロンのデスクトップ アプリケーション29,30,31,32やあ-C のデータを探索します。
処理ライブラリの品質は、別のメトリック (図 2 b) を使用して決定できます。まず、PCR 重複率同じ元の分子に起因読み取りのシーケンスのペアの数でありは無駄なシーケンス リードの量を制限を可能な限り低くする必要があります。ただし、さらにライブラリ &gt; 重複するファイルをフィルター処理すると、高品質コンタクト マップに 40 %pcr 重複を処理ことができます。第二の向きによるフィルター処理された読み取り率4で説明したようする必要があります一貫して一直線に並べられた読み取りペアの 10% よりも低かった。
核燃料サイクル 12 と 14 の間ショウジョウバエの事前 gastrular 開発時に核のアーキテクチャは大幅に改造された33 (図 3) です。核燃料サイクル 12、いくつか TADs が検出されたと連絡先の全体的な配分は多くの認識機能せず非常に滑らか。これは劇的に変更核燃料サイクルで 13、14、TADs はますます顕著と不特定の長距離接触が枯渇しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> 図 1: 並べ替え中に eGFP PCNA 胚の代表的な写真です。(A) eGFP PCNA 信号サイクル 13 (C) 核燃料サイクル 14 (60 分コレクションと核燃料サイクル 12 (B)、核で並べ替えられた集団から胚の 25 ° C (B E) 例を 2 時間培養後胚の並べ替えられていない人口からD) と (E) 同期有糸分裂を経る胚から。スケール バー = 200 μ m.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> 図 2:その場でハイ C ライブラリの品質の指標の例です。(A) バイオアナライザー トレース DNA フラグメント サイズが大きすぎて (ライブラリ 2、下) の配列のためのフラグメントのピークを表示するライブラリから成功したやあ-C ライブラリ (ライブラリ 1、トップ) の分布を示します。ライブラリ 2 は正常に配列されたが、望ましくない DNA のフラグメントのさらに大きな金額が減少シーケンス収率につながる可能性があります。(B) 2 つのやあ-C ライブラリの統計情報をフィルタ リング: 読み取り方向と距離 (内側・外側)4または PCR 重複 (重複) による詳細な分析から除外される一直線に並べられた読み取りペアの数が表示されます。各バー (残りの) フィルターを渡す読み取りと失敗 (フィルタ リング) の番号がプロットされています。フィルターを渡す読み取りの比率がさらにテキストとして表示されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> 図 3: 段階の胚からハイ-C の相互作用マップします。ハイ-C の相互作用マップは 10 kb の解像度でのビニング、33の前に、の前述のバランスします。2 番染色体上の領域は、示されている l.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ライブラリ</td>
			<td>ステージ</td>
			<td>胚の数</td>
			<td>(Ng) を刈り前に、DNA 量</td>
			<td>PCR のサイクル</td>
			<td>最後のライブラリ濃度 (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>核燃料サイクル 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>核燃料サイクル 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>核燃料サイクル 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>核燃料サイクル 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>核燃料サイクル 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>核燃料サイクル 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>核燃料サイクル 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>核燃料サイクル 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>核燃料サイクル 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 代表的なシーケンス図書館統計の一覧。ビオチン プルダウンと量子ビットを用いてせん断前に総 DNA の量は、その生成のために使用された胚の数の一覧で各ライブラリの PCR の数サイクルの増幅、およびシーケンシング ライブラリの最終的な集中に使用浄化とサイズを選択した後表示されます。

この作品は、高解像度その場でハイ C ライブラリからの世代しっかり上演前原腸陥入ショウジョウバエのプロトコルをについて説明します胚。

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

この方法は、クロマチンの3D構造が遺伝子発現や開発にどのような影響を与えるかなど、クロマチンアーキテクチャ分野の重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、クロマチンアーキテクチャと正確にステージされたフライ胚の高解像度ビューを提供することです。この方法はクロマチンの組織と開発に関する洞察を提供することができますが、トランスジェニックフライライブラリの既存のラインを使用してクロマチン組織での効果をテストすることもできます。プロトコルを開始するには、PBSTで以前に収集した胚の総体積を2ミリリットルに調整します。6ミリリットルのヘプタンと37%ホルムアルデヒドの100マイクロリットルを水中に加えます。ホルムアルデヒドを加えた後、チューブを1分間激しく上下に振ります。水相と有機相は、組み合わせてシャンプーのような一貫性を形成します。ロータリーミキサーで10分間攪拌します。チューブの底部に胚を集めるために、チューブを室温で1分間500回gで遠心分離する。シャンプー状の液体全体を吸引し、それを捨てて、胚を吸引しないように注意してください。ホルムアルデヒドを添加してから15分後、125ミリモルグリシンを用いて5ミリリットルのPBSTで胚を再懸濁する。胚を1分間激しく振り下ろします。遠心後、上清を吸引する。1,000マイクロリットルピペットを使用して、100個の胚のバッチを選別に適した小さなガラス容器に移し、好ましくは暗い背景に置き、氷の上に置きます。針または注射器先端を使用して、核密度と細胞周期状態で胚を並べ替えます。EGFP PCNAの分散した非核分布と、部分的に非核GFP信号を示す胚によって認識可能なすべての有糸分裂性胚を除去する。分類を支援するために、各バッチの核周期12、13、および14で参照胚を並べて、胚を参照胚の1つと一致させる。1,000マイクロリットルピペットを使用して所望の胚をピペットアップする。新鮮なチューブにそれらを転送し、氷の上に置きます。計画された実験のために十分な胚がソートされるまで続けます。スピンチューブは室温で100倍gで短時間回転します。上清を取り除き、胚が凍結のために可能な限り乾燥していることを確認します。フラッシュは、液体窒素にチューブを水没させることによって胚を凍結し、マイナス80°Cで保存します。氷の上に凍結胚とチューブを置きます。500マイクロリットルの氷冷ライシスバッファーで胚を再懸濁します。胚がチューブの底に落ち着くように1分待ちます。次に、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにしっかりとフィットするように設計された氷の上で予冷した金属マイクロ害虫で胚を粉砕します。胚を攪拌しないように、チューブの底に触れるまでゆっくりと害虫を挿入します。下に押し下げてから、両方向に2回害虫を回転させます。害虫を少し持ち上げます。チューブの底にもう一度押し込み、粉砕手順を10回、または胚が完全にlysedされるまで繰り返します。溶液は均質であるべきであり、残存する大きな胚片は残らないべきである。均質化懸濁液を氷上で15分間インキュベートする。1,000倍g 4°Cで5分間スピンします。上清を捨て、500マイクロリットル氷冷ライシスバッファーで再懸濁し、上下にピペット処理してペレットを洗浄します。別のスピンの後、上清を捨てます。洗浄したペレットを0.5%のナトリウムドデシル硫酸またはSDSの100マイクロリットルで再懸濁する。その後、加熱ブロックで摂氏65度で10分間サンプルをインキュベートすることによって核を透過させます。10%トリトンX100と120マイクロリットルの水の50マイクロリットルを追加します。チューブをフリックして内容物を混ぜ、ヒートブロックで15分間摂氏37度でチューブをインキュベートします。10X制限酵素バッファー25マイクロリットル、マイクロリットルMBO1あたり5単位20個を加えます。チューブをフリックして内容物を混ぜ、チューブを熱ブロックにインキュベートしてDNAを消化します。MBO1 のさらに 20 単位を追加します。インキュベーションを90分間続けます。2回目の90分間のインキュベーションの後、サンプルを摂氏62度で20分間インキュベートし、MBO1を非アクティブにします。次に、0.4ミリモルビオチン14-dATPの18マイクロリットル、2.25マイクロリットルの未改変3.3ミリモルdCTP-dGTP-dTTPミックス、およびマイクロリットルDNAポリメラーゼIクレノウ断片あたり5単位の8マイクロリットルを加える。チューブをフリックして内容物を混ぜ、サンプルを摂氏37度で90分間インキュベートします。次に、657マイクロリットルの水、10X T4 DNAリガーゼバッファーの120マイクロリットル、10%トリトンX100の100マイクロリットル、1ミリリットルウシ血清アルブミンあたり20ミリグラムの6マイクロリットル、そして最後にマイクロリットルT4 DNAリガーゼあたり5リットルの5マイクロリットルを加える。次に、室温で20RPMで2時間静かにチューブを回転させます。マイクロリットルT4 DNAリガーゼあたり5単位のさらに5マイクロリットルを追加します。さらに2時間回転し続け、2,500倍gで核を5分間回転させます。遠心後、上清を捨てる。ペレットを抽出バッファーの 500 マイクロリットルに再懸濁し、1 ミリリットルプロテイナーゼ 1 ミリグラム 20 ミリリットルの 20 マイクロリットルを加え、チューブをフリックし、チューブをインキュベートしてタンパク質を消化します。5モル塩化ナトリウムの130マイクロリットルを追加し、非架橋に一晩インキュベート。翌日、サンプルを低DNA結合特性を持つ新しい2ミリリットルチューブにピペットします。酢酸ナトリウム3モルの0.1倍の体積と1ミリリットルの2マイクロリットルを1ミリリットルグリコブルーを加えます。1.6量の純粋な絶対エタノールを加え、内容物を反転させ、15分間マイナス80度でサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、内容物を遠心分離する。グリコブルーでしか見つめることができないDNAペレットを見つけます。上清を慎重に取り出し、ピペットチップをDNAペレットから反対側の壁に沿ってチューブに移動します。ペレットを70%エタノールの800マイクロリットルで洗浄します。サンプルを反転して遠心分離し、室温で20,000倍のgで5分間混ぜます。このステップ中に残りの液滴を取り除き、P10チップでチューブから押し出して次の液滴を開け、蓋を開けて最大5分間空気乾燥させます。液体が残らない場合は、50マイクロリットルの10ミリモルトリスクロリドを加えます。DNAを可溶化するためにペレットが配置された領域に溶液を繰り返しピペットします。チューブをフリックして、1ミリリットルRNase A.Mixあたり20ミリグラムの1マイクロリットルを追加します。サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、RNAを消化します。最後に、ライブラリの準備ができるまで、冷凍庫または冷蔵庫にサンプルを保管します。各ソートされた胚バッチのEGFP PCNAシグナルの画像は、下流実験のためのすべての単一の胚の正確な段階および細胞周期状態を明らかにする。バイオアナライザーのトレースは、サイズ選択後のDNA断片のサイズ分布が300~700塩基対の間にあり、最大約450塩基対であることを示している。Hi-C相互作用マップは、核周期12では、TADがますます顕著になり、非特異的な長距離接触が枯渇する核サイクル13と14で劇的に変化するトポロジカル関連ドメインまたはTADが検出される少数であることを示している。この手順を試みる間、ビーズを徹底的に洗い、特に高温時に不必要にインキュベーション時間を延長しないように注意することが重要です。この技術は、正確なステージングと高解像度クロマチン確認マッピングを組み合わせることで、エピジェネティクス分野の研究者が生体内発達環境における3次元クロマチン組織の役割を探求する道を開きました。

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

最近のハイスループットシーケンシング技術が大幅にクロマチン免疫沈降（ChIP）実験の感度を増加させ、精製した細胞や組織解剖を使用して、そのアプリケーションを求めている。ここでは、チップ技術を使用する方法を描く...

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA...

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。...

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。...

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

学ぶ 高解像度in situ Hi-Cライブラリ生成法をDrosophila melanogasterの原腸形成前胚で。染色質構造と遺伝子発現の3D的関連を発生段階で解明する技術です。

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャライブラリの生成

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