培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

この実験の全体的な目標は、流動条件下での白血球と接着性血管細胞または血小板との相互作用の背後にあるメカニズムを調査することです。この方法は、白血球が炎症部位にどのように動員されるかなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーで、さまざまな実験条件を調査できることです。

この方法により、白血球の接着に関する洞察を得ることができます。また、流動条件下での腫瘍細胞の固定化細胞または基質への接着など、他のシステムにも適用できます。その手順を実演するのは、私の研究室で働くエンジニアで博士課程の学生であるAnnemiek Dickhoutです。

血液サンプルを取得した後、血液に1/15容量の酸性クエン酸デキストロースを加えます。次に、ブレーキを350倍gで15分間停止して血液サンプルを遠心分離し、多血小板血漿を取得します。次に、得られた上清を15ミリリットルの円錐管に移し、それに1/10容量の酸性クエン酸デキストロースを加えます。

再度、ブレーキを1、120倍gで15分間停止して懸濁液を遠心分離し、血小板の少ない血漿を得る。次に、上澄みを捨てます。次に、pH 6.6に維持された血小板緩衝液に、幅の広いパスツールピペットを使用して、血小板ペレットを慎重に再懸濁します。

次に、1/10容量の酸性クエン酸デキストロースをそれに加え、穏やかに混合します。次に、血小板を1,120倍gで15分間遠心分離してペレットを形成します。遠心分離が終了したら、上清を捨て、pH 7.5に維持された1ミリリットルの血小板緩衝液に血小板を再懸濁します。

次に、自動血液分析装置を使用して、1/10希釈で血小板濃度を測定します。最後に、pH 7.5に維持された血小板緩衝液で細胞数を調整します。付着した血小板を固定するために、ガラスカバーガラスを塩酸エタノール混合物の体積50%体積のガラスカバーガラスに浸します。

浸漬後、カバーガラスを超純水で2回洗います。次に、窒素を使用してカバーガラスを乾燥させます。次に、ラットコラーゲンタイプ1の1ミリリットルあたり30マイクログラムの100マイクロリットルを使用して、ガラスカバースリップを事前にコーティングします。

ガラスカバーガラスをコーティングした後、カバーガラスを室温で30分間インキュベートします。次に、コラーゲン溶液を排出し、カバーガラスをリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。次に、HEPES緩衝液中の1%ウシ血清アルブミンを使用して、コラーゲン被覆カバースリップを室温で30分間ブロックします。

30分後、カバースリップを洗浄し、乾燥させて灌流チャンバーにマウントします。カバースリップを取り付けた後は、血小板を準備しておきます。血小板を固定化するには、70マイクロリットルの血小板懸濁液をチャネルに移し、摂氏37度と二酸化炭素5%で1〜1 / 2時間インキュベー

次に、非接着性血小板をブロッキングバッファーに室温で30分間交換します。細胞透過性の緑色蛍光核酸染色液を1マイクロモル使用して、白血球を蛍光標識します。標識後、白血球を摂氏37度で30分間インキュベートします。

次に、細胞を300倍gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁して細胞を洗浄します。次に、細胞を300倍gで5分間遠心分離します。

流量に基づいて、アッセイバッファーに5ミリリットルの細胞を懸濁します。次に、ウォーターバスを加熱して摂氏37度を維持します。次に、50ミリリットルの灌流シリンジを取っておき、シリンジホルダーに取り付けます。

次に、ポンプ容量を0ミリリットル、直径を26.70ミリメートルにして、ドローモードでポンプをオンにします。次に、シリンジにルアーロックカプラーを取り付け、エルボルアーコネクターのチューブをルアーロックカプラーに接続します。次に、チューブの自由端をフローチャンバーに取り付けます。

白血球を固定化された血小板に接着するには、マイクロスライドをシリンジに接続します。白血球を灌流し、血管単分子膜または血小板単分子膜のベッドに接着するには、アッセイバッファーを含む50ミリリットルのコニカルチューブに2本目のチューブを取り付け、1ミリリットルのピペットを使用してチューブを充填します。チューブが充填されたら、チューブを絞ってフローチャンバーに接続します。

白血球を灌流する前に、3ミリモルの塩化カルシウムと2ミリモルの塩化マグネシウムを細胞懸濁液に加えます。次に、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。チャンバー内およびチューブ内に詰まった可能性のある空気を除去するには、細胞を灌流する前にアッセイバッファーで灌流します。

次に、チューブを絞って端を閉じ、チューブをアッセイバッファーから細胞懸濁液に切り替えて、内部に気泡が閉じ込められるのを防ぎます。最初の細胞が到着するには、適切な流量とせん断応力で細胞を灌流します。細胞の灌流を続け、流量とせん断応力を2分間維持します。

次に、デジタルカメラに接続された10倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、2〜6分間でローリング細胞と付着細胞の6つの画像をキャプチャします。このアッセイでは、蛍光標識された緑色THP1細胞と内皮細胞との接着を、腫瘍壊死ベクターアルファ刺激の存在下または非存在下で分析しました。グラフと得られた蛍光画像は、対照と比較して、腫瘍壊死ベクトルαで内皮細胞を刺激すると、THP1細胞停止が有意に増加することを示しています。

タイムラプスで記録すると、初代単球の経内皮移動を経時的に監視できます。次に、蛍光標識された好中球とフローチャンバー内の固定化された血小板単分子膜との接着を、TRAP-6刺激の存在下または非存在下で分析しました。得られたプロットは、対照と比較して、TRAP-6刺激血小板への好中球の接着が急激に増加していることを示しています。

次に、JAM-A欠損マウスから血小板を採取し、表面受容体阻害剤の存在下での生の264.7マウス単球との接着を研究しました。グラフと得られた蛍光画像は、対照群と比較した場合、マウス単球と血小板との接着が有意に減少していることを示しています。さらに、生の264.7細胞と血小板との接着を研究するために、JAM-A陽性マウスと欠損マウスをせん断応力の漸進的な増加に曝露しました。

グラフから、生の264.7細胞とJAM-A欠損マウスから得られた血小板との接着は、JAM-A陽性血小板よりもせん断応力に対してより耐性があることが明らかです。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば1日で完了することができます。この手順を試みるときは、血小板が事前に活性化されたり凝集したりしないように、分離中に血小板を非常に優しく洗うことが重要です。

また、システムが混雑する可能性があるため、フローシステムに気泡がないことを確認し、安定したせん断応力を確保することも重要です。この手順に続いて、血管炎症中の白血球動員の根本的なメカニズムを調べることができます。