Name: マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ マウス脳腫瘍細胞を用いたネイティブクロマチン免疫沈降法で、ヒストン修飾によるエピジェネティック変化を解析します。この手法は抗体特異性を高め、腫瘍細胞の転写調節メカニズムを解明するのに有用です。

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この作品は、M.G.C.; に R21 NS091555 R01 NS074387 ・ ストローク (NIH/NINDS) 助成金 R37-NS094804 国立健康/国立研究所の神経疾患に支えられNIH/NINDS 付与 R01 NS076991、R01-NS082311、および R01 NS096756 P.R.L.;NIH/NINDS R01-EB022563;脳神経科リアの幸せな心と M.G.C. にチャドが財団と P.R.L. RNA バイオ グラント F046166 M.G.C. F.M.M. にはサポートによって、F31 NIH/NINDS-F31NS103500 です。R.I.Z. V。NIH でサポートされて/助成金 5T34GM007821 37 の日の出。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。
1. 脳腫瘍 NS と培養条件の世代。
<ol><li>ダルベッコ変更イーグル培地/F12B27 サプリメント (1 x)、N2 サプリメント (1 x)、および抗菌剤で神経幹細胞培地 (NSC) を準備します。ひと遺伝子組換え血管内皮成長因子 (EGF) と基本的な線維芽細胞成長因子 (FGF) 20 ng/mL の各最終濃度使用日 NSC 媒体を補完します。</li>
	<li>特発性脳腫瘍9を生成する新生児の側脳室に癌遺伝子や腫瘍のサプレッサーをターゲット shRNA プラスミドは注入された眠れる森の美女トランスポゾン システムを使用してマウスの脳腫瘍を誘発します。生物発光イメージング ヒンシツ大型の腫瘍を持つマウスを選択します。 注: Calinescuらで使用される睡眠美容トランスポゾン システムおよびプラスミドの構造に関する詳細な情報を見つけることができます。9。<ol>
<li>マウスを画像の腹腔内 26 ゲージの針を使用して 30 mg/mL ルシフェリン溶液 100 μ L を注入します。</li>
		<li>ルシフェリンの注射後 5 分 2% イソフルランに設定酸素/イソフルラン フローと麻酔室を用いた動物を麻酔します。</li>
		<li>動物を麻酔するとき (通常 2-3 分) 2% イソフルランに設定酸素イソフルランと発光室に動物を配置。動物が 5 分以上麻酔の場合、麻酔中の乾燥を防ぐために眼軟膏を使用します。</li>
		<li>体内光イメージング システム、次のパラメーターを使用してマウスを画像: 自動露出、大きなビニング、絞り f = 1。それに大きな腫瘍を考慮すべきパラメーターは発光 > 106光子/s/cm2/sr。</li>
	</ol>
</li>
	<li>安楽死させる密閉室内イソフルレン吸入麻酔薬の過剰摂取でマウス、動物は麻酔、つま先ピンチによるチェックとマウスの首をはねます。</li>
	<li>脳を抽出し、Calinescuらで前述のようにそれを解剖9。</li>
	<li>10 cm シャーレに脳を配置します。誘導される腫瘍は、蛍光蛋白質を表現、解剖顕微鏡蛍光蛍光に適切なチャネルと 0.3 倍にセットを使用はそれ以外の場合組織の色と質感の違いによって腫瘍を識別します。メスや鉗子を使用して通常の脳から腫瘍を区切ります。</li>
	<li>ペトリ皿の中の小さな断片に腫瘍をミンチします。NSC の中の 300 μ L で 1.5 mL チューブに切り裂かれた腫瘍を配置します。</li>
	<li>円錐形遠心チューブの壁に腫瘍を優しく均一にフィットする使い捨てプラスチック ペレット杵を使用します。細胞分離用培地 1 mL を追加し、37 ° C で 5 分間サンプルをインキュベート 注: 杵の使用は、いくつかの細胞を殺すかもしれない。リーダーがセル実行可能性を最大化する場合、杵の使用は省略できます。</li>
	<li>70 μ m 携帯こし器を通ってステップ 1.7 から細胞懸濁液を渡すし、25 ml の NSC の中のストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>室温で 5 分間 300 x グラムの懸濁液を遠心、上清をデカント、NSC 媒体の 6 mL にペレットを再中断します。</li>
	<li>T-25 培養用フラスコ ステップイン 1.9 から腫瘍細胞懸濁液をプレートし、95% 空気と 5% CO2の大気と組織文化のインキュベーターで 37 ° C で培養します。通常 3 日後、いくつかの死んだ細胞、付着細胞と培地でフロート NS を形成細胞の混合物があります。</li>
	<li>15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送マイクロ ピペットを使用して底に沈む細胞のみを収集し、再 T-75 培養フラスコにそれらをプレートします。</li>
	<li>比較的高密度 (1-3、T-25 の 10 の6セル X) のセルを維持します。合流しているとき、セルを通過します。 注: 密度球のサイズによって決定されます。ブラック センター大球平均の中心で死んでいるセルは、セルがすぐに継代することを示すこと。</li>
	<li>成長因子を追加 (EGF および basic FGF; 20 ng/mL) 3 日おき。セルが合流し中ターン ライト オレンジではない場合は、媒体を変更します。</li>
	<li>媒体を変更するには、古い媒体を収集し 5 分間室温で 300 × g で遠心分離し、再手順 1.1 で指定した濃度で EGF と FGF NSC 培の細胞ペレットを中断します。 注: 場合、球は、半ば-高密度が、継代する準備ができていません (球サイズが小さい直径 < 100 μ m) ペレットは 2 つのフラスコに分割できますし。</li>
	<li>セルを通過するには、部屋の温度で 5 分間 300 x g で細胞を遠心、上清をデカント、37 ° C で 5 分間細胞剥離培地で細胞をインキュベート<ol>
<li>希薄剥離中にバランスの取れた塩溶液の 5 mL を追加し、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>上清をデカント、NSC 媒体の 18 mL で細胞ペレットを再懸濁します 3 T-25 フラスコに懸濁液を均等に分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルの因数を凍結するには、ステップ、1.15 のように細胞を切り離して、10% ジメチルスルホキシドと 90% 牛胎児血清 1 mL 因数のセルをフリーズします。ゆっくりと、10 分間氷の上のセルを配置するし、-20 ° C、30 分で細胞を保つことによって冷却セルと 1 日-80 ° C。次の日は、液体窒素貯蔵容器にセルを転送します。</li>
</ol>2. ネイティブ チップ
<ol><li>クロマチンの準備<ol>
<li>NS になる合流まで派生 NS の在庫が完了したら、95% の空気と 5% CO2の大気と NSC 培地で培養のインキュベーターで 37 ° C の 15 mL の T-75 で NS の文化.1 つ合流 T-75 プレート 3-5 X 10 の6セルが得られます。</li>
		<li>細胞がコンフルエントになると、NS を 5 分間 300 × g で遠心、上清をデカントし、細胞解離液の 1 mL を追加します。5 分追加 5 ml 中の 37 ° C で細胞をインキュベートし、検定10を使用してセルをカウントします。 注: 免疫沈降法 (IP) 反応あたり 1 x 10 の6セルが必要です。あらかじめ免疫血清または IgG コントロールには含まれている11もある必要があります注意してください。</li>
		<li>300 × g で 5 分で 1 つ 1.5 mL 遠心チューブに NS を遠心、上清をデカントし再平衡塩溶液の 1 ml NS ペレットを中断し、懸濁液を低蛋白結合 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
		<li>300 x g で 5 分間遠心分離機 NS、上清をデカントし、再プロテアーゼを添加した 1 x 10 の6セルごと消化バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM CaCl20.2% ポリエチレング リコール オクチルフェニル エーテル) の 95 μ L で細胞ペレットを中断抑制剤の高濃度 (1: 100) カクテル。すぐにピペットのセルを上下に凝集を防ぐため、任意の気泡を作成しないようにします。</li>
		<li>50% のグリセロール ストック"1 x"と呼ばれる、1 mg/mL ソリューション (1.15 ユニット/μ L、-20 ° C で保存) を作成するには、MNase を再懸濁します。作る、"0.1 x」株式 50% のグリセロールの 2 番目の 1:9 希釈により (例えば、900 μ l"1 x"の MNase と 50% のグリセロールの 100 μ l) し、-20 ° c で保存。</li>
		<li>ミックス 5 μ L の「0.1 x"MNase、145 μ l 消化バッファーの。氷の上の酵素のすべての時間をしてください。1 x 10 の6セルあたり消化バッファーで希釈した MNase の 5 μ L を追加します。12 分の正確なインキュベーション時間を確保する時に混ぜるし、丁度 12 分プロセスの 37 ° C ブロックにチューブを配置するチューブ サンプルの 1 つにフリックします。</li>
		<li>10 の 10 μ L を追加 x 1 x 10 の6セルごと停止バッファー MNase (110 mM トリス-HCl、pH 8.0、55 ミリメートルの EDTA)。サンプルは、この時点から氷で保たれなければなりません。</li>
		<li>110 μ L「2 x RIPA バッファー」を追加 (280 mM の NaCl、1.8% ポリエチレング リコール ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル、0.2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、0.2 %na デオキシ コール酸、5 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸); 4 ° C で保存) を添加しました。プロテアーゼ抑制剤の高濃度 (1: 100) 1 x 10 の6セルごとのカクテル。ミックス チューブをフリックします。</li>
		<li>15 分で 4 ° C および microfuge の管を遠心し、1700 x g. (低蛋白結合マイクロ遠心チューブ用が不要になる) 新しい正規 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送し、氷の上保存します。ペレットを破棄します。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫沈降法 (IP)<ol>
<li>ミックス蛋白質 A、蛋白質 G 磁気ビーズ 1:1 の比率で。すべての ip のビーズの 25 μ L を準備します。</li>
		<li>RIPA バッファーの 1 つの mL を追加することで、ビーズを洗浄 (10 mM トリス pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、140 mM 1% ポリエチレング リコール ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル、塩化ナトリウム 0.1% SDS 0.1 %na-デオキシ コール酸; 4 ° C で保存) 低濃度 (1: 1000) プロテアーゼ阻害剤を添加しました。</li>
		<li>磁石を使用すると、洗浄液から分離し洗浄液 (約 1 分) をデカント ビーズを許可できます。洗浄ステップを 2 回実行します。</li>
		<li>プロテアーゼ阻害剤 (1: 1000) を添加した RIPA バッファーを使用して元の体積にビーズを再停止します。</li>
		<li>必要に応じて、希釈各 IP がある 100 から 200 までのボリュームは、プロテアーゼ阻害剤 (1: 1000) を添加した RIPA バッファーを用いたクロマチン μ。 予約クロマチン IP ごとの入力に使用されるボリュームの 10% です。 注: たとえば、IP あたり 200 μ L を使用している場合 20 μ L 希釈クロマチンの引当する入力。4 つの ip アドレスの合計は、合計クロマチン量は 820 μ L に希釈してください。</li>
		<li>入力を準備します。入力にプロティナーゼ K (0.5 mg/mL) を添加した TE バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 mM EDTA) の 100 μ L を追加し、55 ° C 1 時間の入力を孵化させなさい。 注: 手順 2.3.4 と 2.4.1 と一緒に手順 2.2.6-2.2.7 を実行できます。</li>
		<li>製造元の指示に従って PCR 精製キットを使用して入力を浄化し、50 μ L のキットで提供される溶出バッファーで溶出します。</li>
		<li>微量分光光度計を使用して入力の濃度を測定し、結果をノートに記録。キットから溶出バッファーでは空白です。 注意: マウス神経幹細胞で各 IP の DNA の約 6 μ g を使用しました。</li>
		<li>1% ゲル上で入力を実行または標準設定を使用して DNA バイオアナライザーに 1 μ L をロードします。下流のアプリケーションで入力として使用する残りの部分を格納します。</li>
		<li>すべての ip 10 洗浄蛋白 A μ L & G 磁気ビーズを追加し、IP の 4 ° C で 1 時間インキュベート 注: たとえば、3 つの IPs の 30 のタンパク質 A の μ L & G 磁気ビーズを追加します。</li>
		<li>磁石にサンプルを置き、ビーズを分離するを許可します。クロマチンを新しい 1.5 mL チューブに以前に決定された量を転送することによって分割します。</li>
		<li>抗体を追加し、蒸発を避けるためにプラスチック パラフィン フィルムとキャップをラップします。20 rpm で回転と一晩で 4 ° C のサンプルをインキュベートします。 注: 濃度は経験的の製造元の推奨事項に従う決定する必要があります。</li>
		<li>次の日、スピン 10 の室温、2000 x g で小型遠心分離機を使用してチューブ s。各 IP にビーズの 10 μ L を追加し、IP を 20 rpm で回転で 4 ° C で 3 時間孵化させなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>IP の洗浄およびタンパク質の消化<ol>
<li>各 ip アドレスに低濃度 (1: 1000) プロテアーゼ阻害剤を添加した RIPA バッファーの 150 μ L を追加し、マグネット スタンドのサンプル 5 分場所 20 rpm で回転と 4 ° C で IP をインキュベートを分離する磁気ビーズを許可します。上澄みを除去するのに、ピペットを使用します。この tep 5 洗浄を繰り返します。</li>
		<li>LiCl バッファーの 150 μ L を追加 (250 mM LiCl、10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、0.5% 0.5%、NP 40 Na デオキシ コール酸; 4 ° C でストア) 低濃度 (1: 1000) 各 IP にプロテアーゼ阻害剤を添加した、IP を, 5 分位サンプル 20 rpm で回転の 4 ° C で磁気スタンドし、分離する磁気ビーズを許可します。上清を除去するのに、ピペットを使用します。</li>
		<li>冷たいテ (ないのプロテアーゼ阻害剤) の 150 μ L を追加し、マグネット スタンドのサンプル 5 分場所 20 rpm で回転と 4 ° C でサンプルをインキュベートを分離する磁気ビーズを許可します。上澄みを除去するのに、ピペットを使用します。</li>
		<li>最終的な洗浄ステップの後再プロティナーゼ K (0.5 mg/mL) を添加した TE バッファーの 100 μ L のサンプルを中断し、55 ° C 1 時間でサンプルをインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>DNA の精製とチップの量的なリアルタイム PCR (qPCR)<ol>
<li>PCR 精製キットを使用して沈澱 DNA を浄化します。後に各サンプル キットから DNA 結合バッファーの追加により、磁石にチューブを配置、磁気ビーズ集約、クリーンアップ列に上清を転送まで待ちます。製造元の指示に従って、50 μ L のキットで提供される溶出バッファーで溶出します。</li>
		<li>IP が成功したかどうか、チェックするには、qPCR を実行します。理想的には、正と負のコントロール領域のプライマーを設計する必要があります。 注: たとえば、IP は H3K4me3 と H3K27me3 を実行、次のサンプル実行してください qPCR: H3K4me3、H3K27me3、IgG チップの DNA、DNA、および、テンプレートなしのコントロール (NTC) H3K4me3 を豊かにする地域のためのプライマーを使用しての入力 (肯定的な制御) とH3K4me3 を豊かにする地域 (マイナス コントロール);同様の H3K27me3。</li>
		<li>QPCR12を実行する標準的なプロトコルに従います。簡単に言えば、SYBR グリーン マスター ミックス、作業各前方および逆プライマー濃度 10 μ M の 0.5 μ L および 2 μ L チップまたは入力の DNA の使用して qPCR を実行します。リアルタイム PCR システムを使用して板をお読みください。表 2は、プライマー シーケンスを提供しています。ファンらから Gapdh のプライマー シーケンス。使用される13であった。</li>
		<li>チップのデータを分析、入力基準 %すなわち、入力メソッド (%ip)14。次の数式を使用した入力のパーセントを計算します。 入力を調整 = 平均 ct (入力)-2(DF) をログに記録 DF が開始入力の希釈係数と DF = IP 量/入力のボリューム %Ip = 100 × 2 ^ (入力 - Ct (IP) を調整) ここ Ct はしきい値の係数です。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
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<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
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<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
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</ol>

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ここで提示されたプロトコルが遺伝子組み換え脳腫瘍由来 NS でネイティブ チップを実行するユーザーを有効にします。チップを架橋と対照をなしてこのプロトコルは DNA6密接に関連付ける蛋白質の研究のために限られました。使用されているセルの数は、必要に応じて変更することができます、プロトコルをスケール アップすることができます。IP あたり 1 X 10 の6セルを使いました、しかし、ネイティブ チップ、またとしてはほとんど 4 × 104セル5で実行できます。このプロトコルでは qPCR; を介して DNA チップを分析しかし、このプロトコルは、ゲノム全体のレベルで蛋白質 DNA の相互作用を研究する次世代シーケンシングとも組み合わせることが。我々 は、腫瘍細胞のゲノムの特定の領域内でのヒストンの修正の沈着に神経膠腫の遺伝子の効果を分析するのに正常にこのチップ プロトコルを使用しています。
ネイティブ チップを実行するときにいくつかの重要なステッ...

エピジェネティックなイベントは頻繁に神経膠腫、腫瘍発症の重要な役割を果たす可能性が高い。確かに、小児の悪性グリオーマの変異遺伝子ヒストン H3.3 と H3.1 頻繁に発生する1。突然変異のヒストンの修正に影響を与える主要なエピジェネティックな影響2,の3を持っている.大人のスペクトルに思春期、イソクエン酸脱水素酵素遺伝子 1/2 (IDH1/2)、α KG 依存ヒストンと DNA ・ デ ・ methylasaes、阻害する突然変異の再発突然変異と ATRX DAXX など他のクロマチンの規制当局における遺伝的変化発生する4. したがって、クロマチン構造と規制ヒストン修飾、ターンでは、腫瘍細胞のトランスクリプトームの劇的な影響を与えるのエピジェネティックな調節物質に影響を与える突然変異の変更の研究に非常に重要です。
クロマチン免疫沈降 (チップ) はゲノム5,6、7のエピジェネティックな修飾の影響を評価するために使用する強力なツールです。ネイティブ ・ チップ、クロマチンはミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase)、興味の蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降したと消化され、沈澱クロマチン複合6からの DNA の精製し。細胞は、この手法はしっかりと DNA6と相互作用するタンパク質の研究に適用プロシージャの間に固定されていません。架橋の不在エイズ抗体の特定性の抗体が固定されていないペプチッドまたは蛋白質の7に対して通常発生しますので。さらに、架橋ステップがないのでこれは非固有およびない規制7、8にある一時的な蛋白質 DNA の相互作用の修正の可能性を低減します。チップは、特定のゲノム領域でのヒストンの修正の濃縮を識別するために使用できます。ここで、神経膠腫のマウス ・ モデルを設計から遺伝的生成細胞 (NS) でネイティブ チップを実行するためのプロトコルは詳細します。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td>バイオアナライザー</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R、冷蔵</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>タコニック</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 マウス</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>アルドリッチ</td><td>22350-6</td><td>バッファー試薬</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>ゴールドバイオ</td><td>ラックK-1g</td><td></td></tr><tr><td>DiaMag1.5 磁気ラック</td><td>磁気ビーズ洗浄用</td><td>ダイアゲノード</td><td>B04000003</td></tr><tr><td>DiaMag ローテーター EU</td><td>ダイアゲノード</td><td>B05000001</td><td>ローテーター</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC 成分</td></tr><tr><td>ダイナビーズ プロテイン A</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック プロテイン A サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10001D</td><td>プロテイン A マグネ</td></tr>ティックビーズ <tr><td>ダイナビーズ プロテイン G</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10003D</td><td>タンパク質G磁気ビーズ</td></tr><tr><td>EGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-15</td><td>準備20 &mu;0.1% BSAおよび分注中のg / mLストック。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>シグマ</td><td>E-4884</td><td>緩衝液試薬</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(&β;-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸) (EGTA)</td><td>シグマ</td><td>E-4378</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>Fast SYBR グリーンマスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>qPCR 試薬</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>細胞</td><td>凍結用</td>10437028</tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>20 &mu;0.1% BSAおよび分注中のg / mLストック。</td></tr>腫瘍の解<tr><td>剖のための</td><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11008-13</td></tr>グリ<tr><td>セロール、MBグレード</td><td>EMD-ミリポア</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td>ミリ<td>ポア</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>バランスの取れた塩溶液</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>吸入麻酔薬</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>in vivo光学イメージングシステム</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>細胞剥離培地</td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>Sigma</td><td>L8895</td><td>緩衝試薬</td></tr><tr><td>低結合性マイクロチューブ</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>低タンパク質結合性マイクロ遠心チューブ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>21-402-903</td><td>レギュラー マイクロ遠心チューブ</td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>各バッチは異なる場合があります。実験と分注に十分な量を購入してください。</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>NSC 成分</td></tr><tr><td>正常ウサギ IgG</td><td>ミリポア</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>ノルモシン</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>抗菌剤、0.1 mg/mL で使用。</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td><td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>緩衝試薬</td></tr><tr><td>Kimble Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>aliquot and store at -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>プロチナーゼK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td>は<td>、10 mg/mLの水溶液を調製し、-20°Cで分注して保存します。</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA精製キット</td></tr><tr><td>腫瘍の解剖用</td><td>メス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10007-16</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>緩衝試薬</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>緩衝剤</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Bp152-1</td><td>緩衝剤</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP 151-500</td><td>ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル</td></tr><tr><td>スタンダードミニ遠心分離</td>機 <td>フィッシャーブランド</td><td>12-006-901</td><td>スタンダードミニ遠心分離機</td></tr><tr><td>SZX16顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td>蛍光解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>ViiA 7 リアルタイム PCR システム、高速 96 ウェルブロック</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

エピジェネティック修飾は、開発と神経膠腫の進行に関与する可能性があります。メチル化とプロモーターのアセチル化の腫瘍のサプレッサー遺伝子の規定する領域で変更できる遺伝子発現の変化につながるし、脳腫瘍の病因に重要な役割を果たします。ネイティブのクロマチン免疫沈降 (チップ) は、変更または DNA と密接に他の蛋白質の検出を可能にする一般的な手法です。ネイティブのチップで、架橋のチップとは対照的細胞は DNA にタンパク質を共有リンクするホルムアルデヒドと扱われない。これは、時々 架橋のみ一過性 DNA と対話し、遺伝子調節の機能的意義を持っていないタンパク質を定めることができるので有利です。さらに、抗体は固定されていないペプチドに対する一般に します。したがって、抗体の特異性はネイティブのチップに増加します。ただし、ネイティブ チップのみ適用されるヒストンや DNA にしっかりと結合する他の蛋白質を研究する心に留めて重要です。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。

腫瘍脳腫瘍脳腫瘍細胞が肯定的な Katushka から生成された NS の概略は、図 1で示されます。図 2は、全体のチップ技術の概略図です。図 3番組脳腫瘍 NS からクロマチンの代表の結果は、12 分、モノ、ジ及びトリ ヌクレオソームの大半を降伏の MNase と消化されます。チップ、qPCR チップで実行することがあります、DNA を入力サンプル。図 4は、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (Gapdh) の qPCR から代表的なチップ qPCR データを示しています。Gapdh は H3K4me3、アクティブな転写に関連付けられている変更と濃縮されてハウスキーピング遺伝子です。Gapdh H3k4me3 と濃縮されてない抑圧されたクロマチン領域に関連付けられている変更である H3K27me3 がつきを示した。
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エピジェネティックなメカニズムは、神経膠腫で頻繁に変更されます。クロマチン免疫沈降は、クロマチン構造と遺伝子の転写を調節するヒストンの修正の変更から発生する神経膠腫の遺伝子変異の結果を研究に使用できます。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

この手順の全体的な目標は、特定のゲノム位置におけるヒストンマークの濃縮を特定することです。この方法は、ヒストン修飾を変化させるエピジェネティックな調節因子の突然変異が腫瘍細胞のトランスクリプトームにどのように影響するかなど、エピジェネティクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が架橋されていないため、より自然な状態にあり、抗体の特異性を高めることができることです。まず、10cmのシャーレでマウスの脳から実験的に誘発された腫瘍を解剖します。腫瘍が蛍光タンパク質を発現している場合は、0.3倍の倍率で適切な蛍光チャネルに設定された蛍光解剖顕微鏡で腫瘍を視覚化します。メスと鉗子を使用して腫瘍組織を正常な脳から分離し、ペトリ皿で腫瘍を細かく刻みます。解剖した腫瘍を300マイクロリットルのNSC培地を入れた1.5ミリリットルのチューブに移し、使い捨て注射器を使用して腫瘍を穏やかに均質化します。次に、1ミリリットルの細胞剥離培地を加え、サンプルを摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーに通し、50ミリリットルの遠心チューブに入れます。次に、ストレーナーを25ミリリットルのNSC培地で洗浄し、懸濁液を300倍のGで室温で5分間遠心分離します。上清をデカントした後、ペレットを6ミリリットルのNSC培地に再懸濁し、腫瘍細胞懸濁液をT25培養フラスコに移します。ニューロスフェアが形成されるまで、95%の空気と5%の二酸化炭素の雰囲気の組織培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で培養します。ニューロスフェアが回収されたら、アミノ沈殿ごとに6つのニューロスフェア細胞に1×10を300倍Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清をデカントし、ニューロスフィアペレットを1ミリリットルの平衡塩溶液に再懸濁します。.懸濁液を低タンパク質結合性1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、その後、以前と同様に遠心分離します。次に、上清をデカントし、細胞ペレットを消化緩衝液95マイクロリットルに再懸濁し、1〜100個のプロテアーゼ阻害剤カクテルを1回10個補充した6個の細胞を添加する。凝集を防ぎ、気泡が発生しないように、すぐに細胞を上下にピペットで動かしてください。次に、5マイクロリットルの0.1Xマイクロコッカスヌクレアーゼを145マイクロリットルの消化緩衝液に混合し、1×10あたり5マイクロリットルの希釈したマイクロコッカスヌクレアーゼを6つの細胞に加えます。チューブをフリックして混合し、チューブを摂氏37度のヒートブロックに正確に12分間置きます。クロマチンをフラグメント化するためのミクロコッカスヌクレアーゼ消化は、最も重要なステップです。適切なクロマチンフラグメンテーションは、ChIPの高分解

native-chromatin-immunoprecipitation-using-murine-brain-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。...

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

このビデオプロトコルは、ニューロスフェアアッセイ培養法を用いて外科的に切除したヒト神経膠芽腫mutliforme（GBM）の腫瘍組織からの細胞のような分離と茎の拡大を示しています。...

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。...

マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

出典:Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Gliomas by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp.

脳腫瘍ニューロスフェア切片におけるバイオマーカーの免疫組織化学的染色

無血清神経球培地における解離された高等度神経膠腫外科標本の伝播のためのプロトコルは、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して選択する。神経球として成長できない標本については、代替プロトコルが提案される。免疫細胞化学のための3D神経球アーキテクチャを維持するためのパラフィン埋め込み技術について説明する。...

臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

ここでは、新生児マウスの心室に注入されたトランスポゾンDNAを使用して、新規神経膠芽腫(GBM)を誘導、監視、分析するための効率的で汎用性の高いプロトコルについて説明します。プラスミドを取り込む脳室内領域の細胞は、ヒトGBMの組織病理学的特性を有する腫瘍を形質転換、増殖および生成する。...

新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere...

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

同所性小児脳腫瘍モデルの開発には、がん細胞を正確に移植するための定位固定装置を使用するという、細心の注意を払った精度が必要です。ここで紹介する方法論は、脳腫瘍細胞の調製、頭蓋内注射の実施、および脳腫瘍の生着を評価するための術後モニタリングシステムの実装に関連するステップを概説しています。...

脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立

学ぶ マウス脳腫瘍細胞を用いたネイティブクロマチン免疫沈降法で、ヒストン修飾によるエピジェネティック変化を解析します。この手法は抗体特異性を高め、腫瘍細胞の転写調節メカニズムを解明するのに有用です。

マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

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