マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

この手順の全体的な目標は、特定のゲノム位置におけるヒストンマークの濃縮を特定することです。この方法は、ヒストン修飾を変化させるエピジェネティックな調節因子の突然変異が腫瘍細胞のトランスクリプトームにどのように影響するかなど、エピジェネティクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が架橋されていないため、より自然な状態にあり、抗体の特異性を高めることができることです。

まず、10cmのシャーレでマウスの脳から実験的に誘発された腫瘍を解剖します。腫瘍が蛍光タンパク質を発現している場合は、0.3倍の倍率で適切な蛍光チャネルに設定された蛍光解剖顕微鏡で腫瘍を視覚化します。メスと鉗子を使用して腫瘍組織を正常な脳から分離し、ペトリ皿で腫瘍を細かく刻みます。

解剖した腫瘍を300マイクロリットルのNSC培地を入れた1.5ミリリットルのチューブに移し、使い捨て注射器を使用して腫瘍を穏やかに均質化します。次に、1ミリリットルの細胞剥離培地を加え、サンプルを摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーに通し、50ミリリットルの遠心チューブに入れます。

次に、ストレーナーを25ミリリットルのNSC培地で洗浄し、懸濁液を300倍のGで室温で5分間遠心分離します。上清をデカントした後、ペレットを6ミリリットルのNSC培地に再懸濁し、腫瘍細胞懸濁液をT25培養フラスコに移します。ニューロスフェアが形成されるまで、95%の空気と5%の二酸化炭素の雰囲気の組織培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で培養します。

ニューロスフェアが回収されたら、アミノ沈殿ごとに6つのニューロスフェア細胞に1×10を300倍Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清をデカントし、ニューロスフィアペレットを1ミリリットルの平衡塩溶液に再懸濁します。.懸濁液を低タンパク質結合性1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、その後、以前と同様に遠心分離します。

次に、上清をデカントし、細胞ペレットを消化緩衝液95マイクロリットルに再懸濁し、1〜100個のプロテアーゼ阻害剤カクテルを1回10個補充した6個の細胞を添加する。凝集を防ぎ、気泡が発生しないように、すぐに細胞を上下にピペットで動かしてください。次に、5マイクロリットルの0.1Xマイクロコッカスヌクレアーゼを145マイクロリットルの消化緩衝液に混合し、1×10あたり5マイクロリットルの希釈したマイクロコッカスヌクレアーゼを6つの細胞に加えます。

チューブをフリックして混合し、チューブを摂氏37度のヒートブロックに正確に12分間置きます。クロマチンをフラグメント化するためのミクロコッカスヌクレアーゼ消化は、最も重要なステップです。適切なクロマチンフラグメンテーションは、ChIPの高分解能を達成するために重要です。

ステップを成功させるには、一度に複数のサンプルを1つずつインキュベートして、過剰消化が発生しないようにします。12分後、6つの細胞に10×10ごとに10マイクロリットルの10Xマイクロコッカスヌクレアーゼストップバッファーを加えます。この時点から、サンプルは氷上に保管する必要があります。

ミクロコッカスヌクレアーゼ消化サンプルのバイオアナライザー分析では、ほとんどのDNAがモノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、トリヌクレオソームに断片化されていることが示されています。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを1〜100に添加した2X ripa bufferを1〜100マイクロリットルを6つの細胞に1回加える。チューブをフリックして混合し、摂氏4度で1700倍Gで15分間遠心分離します。クロマチンを含む上清を通常の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。

プロテアーゼ阻害剤を1〜1000で添加したリパバッファーを使用してクロマチンを希釈し、各IPの容量が100〜200マイクロリットルになるようにします。次に、ChIPボリュームの10%に相当するアリコートをインプットサンプルとして除去します。プロテイナーゼKを添加したTEバッファー100μLを加えてインプットを調製し、摂氏55度で1時間インキュベートします。

PCR精製キットでインプットを精製した後、マイクロボリューム分光光度計を使用してインプットの濃度を測定します。結果をノートブックに記録します。各サンプルに対して実施するIPごとに10マイクロリットルの洗浄したプロテインAおよびG磁気ビーズを追加し、摂氏4度で1時間インキュベートし、20RPMで回転させます。

サンプルを磁気ホルダーに置き、ビーズを分離させてから、必要な量を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。各チューブに目的の抗体を添加し、蒸発を防ぐためにキャップをプラスチックパラフィンフィルムで包みます。前回と同様に回転させながら、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、チューブをGの2000倍で10秒間回転させた後、各IPに10マイクロリットルのビーズを加え、摂氏4度で3時間インキュベートし、20RPMで回転させます。次に、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含む150マイクロリットルのリパバッファーを各IPに加え、摂氏4度、20RPMで5分間インキュベートします。

インキュベーション期間後、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を除去し、次に低濃度のプロテアーゼ阻害剤を添加した150マイクロリットルの塩化リチウム緩衝液を各IPに加え、摂氏4度でインキュベートし、20RPMで5分間回転させます。インキュベーション期間後、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させてから、ピペットを使用して上清を取り除きます。

次に、プロテアーゼ阻害剤を含まない150マイクロリットルの冷たいTEをビーズに加え、摂氏4度で20RPMで回転させて5分間インキュベートします。最終洗浄ステップの後、最終濃度0.5ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKを添加した100マイクロリットルのTEバッファーにサンプルを再懸濁し、摂氏55度で1時間インキュベートします。最後に、PCR精製キットを使用してアミノ沈殿DNAを精製します。

次に、IPが成功したかどうかを確認するために、ポジティブおよびネガティブコントロール領域を標的としたプライマーを用いてqPCRを実施しました。iPCRは、グリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼのプライマーを使用して、IGG ChIP DNA、ヒストン-3-リセン-4-トリメチル化ChIP DNA、およびヒストン-3-リセン-27-スリメチル化ChIP DNAを用いて行いました。代表的な結果は、ハウスキーピング遺伝子であるGapdhは、活性転写に関連するH3K4me3修飾のみが濃縮され、抑制されたクロマチンに関連するH3K27me3修飾は濃縮されないことを示しています。

この手順に続いて、ChIP-Cのような他の方法を実行して、ゲノム全体のヒストンマークの変化を特定することができます。このビデオを見れば、特定の遺伝子部位のヒストンマークを同定するために、ニューロスフェアでネイティブChIPを行う方法について十分に理解できるはずです。