生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

この光変換技術の全体的な目標は、単一動物の単一細胞を他の蛍光細胞集団と区別することです。この方法は、この分野での主要な発生上の質問に答えるのに役立ち、時間の経過に伴う単一細胞の移動を視覚化することができます。この技術の主な利点は、侵襲性が最小限で、単一細胞またはより大きな集団の標識に使用できることです。

さらに、ユーザーは特定の関心領域を選択し、目的のターゲットを写真に変換できます。光変換性タンパク質を発現するゼブラフィッシュの雄と雌のトランスジェニックゼブラフィッシュを交配させ、テキストプロトコルに従って卵を採取した後、488ナノメートルの光源とGFPフィルターセットを備えた解剖顕微鏡を使用して、24 hpfの胚をスクリーニングします。針またはピンセットを使用して、手動で胚をデコリオネーションします。

マイクロ波で、0.8%低融点アガロース溶液の5ミリリットルを準備します。アガロースが触るまで冷めたら、麻酔をかけたトランスジェニック sox10 eos 陽性 48 hpf の魚を 3 〜 4 匹、10 mm ガラス カバー スリップ ボトム ペトリ皿の中央に置きます。カバースリップの表面を覆うのに十分なアガロースを約1ミリメートル追加します。

次に、プローブ針を使用して魚を横向きに配置し、必要に応じて調整しますが、アガロースが固まる間、約2分かかります。アガロースが2分間固まった後、0.02%アミノ安息香酸エステルトリカインを含む胚培地をゆっくりと皿に加え、寒天と皿の底面が沈むまで注ぎます。共焦点顕微鏡検査を行うには、共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャウィンドウとフォーカスウィンドウを選択します。

変換前のイメージングを実行するには、キャプチャウィンドウとキャプチャ設定のドロップダウンタブで、イメージングパラメータを選択します。ここでは、フィッシュイメージングと呼ばれるラボ固有のスタック設定を紹介します。標本を共焦点顕微鏡に置き、粗調整ノブと微調整ノブを使用して焦点を合わせます。

次に、フォーカスウィンドウを開き、後根神経節などの目的の関心領域を見つけます。フィルターセットメニューでc488レーザーを選択し、露出を300ミリ秒に、レーザー出力を5に、インテンシファイを75に設定します。次に、キャプチャタイプセクションで、3Dチェックボックスをオンにします。

[3D キャプチャ] セクションで、[現在の位置を使用] を選択し、[現在の位置の範囲] をオンにします。同じセクションで、範囲を 35 に、平面の数を 36 に、ステップ サイズを 1 に設定します。現在の場所を選択し、キャプチャ ウィンドウの下部にある [開始] をクリックして画像を取得します。

光変換プロセスの前に、レーザーパラメータを二重、三重に確認してください。変換ウィンドウが開いているときに、変換設定を再調整する必要がある場合があります。キャプチャウィンドウの「キャプチャウィンドウ設定」ドロップダウンタブで、ラボ固有のコンバージョンイメージング設定を選択します。

ここでは、ラボ固有の設定は、フィッシュアブレートフルチップと呼ばれます。フィルターメニューセットの下で、c488およびc541レーザーを選択します。露光を300ミリ秒、レーザー出力を5、強度を75に設定すると、光退色や毒性を引き起こすことなく十分な蛍光信号が生成されます。

フォーカスウィンドウで、「photomanipulation」タブをクリックし、laserstackのパワーを2に変更して、「Go」をクリックします。ラスター ブロック サイズを 1 に変更し、[設定] をクリックします。次に、ダブルクリックのサイズを4に変更し、レーザーラインをv405に変更します。

次に、キャプチャウィンドウで、キャプチャの詳細設定を開きます。[写真操作]タブを選択し、ダブルクリックの繰り返しを2回に変更して、[OK]をクリックします。フォーカス ウィンドウで xy タブを選択します。

[光操作]タブで、レーザーパラメータを再確認してください。次に、レーザー設定を設定して、周囲の細胞を光変換せずに、目的の細胞を光変換します。[キャプチャタイプ]で[タイムラプス]チェックボックスをオンにし、[開始]をクリックします。

ライブタイムラプスウィンドウが開いたら、上部のツールバーで円ツールを選択します。セルの中央の領域に円を描き、描いた円を右クリックして [FRAP 領域] を選択し、3 秒待ちます。選択した領域は、キャプチャの停止をクリックすると暗くなります。

複数の動物をイメージングする場合は、フォーカスメニューのxyタブに戻り、位置2を選択します。次に、写真変換を繰り返します。細胞集団を変換するには、タイムラプスウィンドウを開いてプロトコルとレーザーパラメータに従います。

ここで、円を描画して関心領域をFRAPする代わりに、ラインツールを使用して関心領域に線を描画します。次に、先ほど示したのと同じパラメータを使用して領域をFRAPします。すべてのポイントがフォトコンバートされたら、キャプチャウィンドウのキャプチャ設定ドロップダウンタブで、このビデオで前述したラボ固有の標準スタック設定を選択します。

c488 レーザーを選択し、露出を 300 ミリ秒、レーザー出力を 5 ミリ秒、強度を 75 に設定します。c541 レーザーを選択し、露出を 500 ミリ秒、レーザー出力を 10 ミリ秒、強度を 75 に設定します。キャプチャタイプセクションで、3Dチェックボックスをオンにします。

[3D キャプチャ] セクションで、[現在の位置を使用] を選択し、[現在の位置の範囲] をオンにします。同じセクションで、範囲を 35 に、平面の数を 36 に、ステップ サイズを 1 に設定します。範囲番号は、所望のイメージング深度に対応するために、増減してもよい。

xy フォーカス タブに乗算ポイントがある場合は、キャプチャ ウィンドウで、マルチポイント リスト オプションを選択します。そうでない場合は、現在の場所を選択します。最後に、キャプチャウィンドウの下部にある[開始]をクリックして画像を取得します。

これらのパネルは、トランスジェニックゼブラフィッシュの神経節内にある単一のプレフォト変換細胞が、sox10制御配列の制御下で光変換可能なeosタンパク質を発現していることを示しています。光変換後、eosは関心領域内に明確に存在し、隣接する細胞は標識されませんでした。この光変換技術の有用性を実証するために、脊髄の腹側にある細胞集団を線を用いて紫外線に曝露した。

その後、ラインの領域で光変換されたeosタンパク質を示す画像が撮影されました。光変換されていないeosタンパク質は、他のすべての領域で見られました。光変換の数時間後、光変換されたeos陽性細胞が脊髄領域全体に散らばっている背側と腹側の両方の位置に散らばっていることを示す同一の画像が撮影されました。

この発見は、腹側脊髄細胞が背側の位置に移動したという仮説と一致しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、30〜45分で実行できます。この手順を試行する際は、関心領域で光変換が行われたことを確認するために、変換後の画像を撮影することを忘れないでください。

この手順に続いて、タイムラプスイメージングなどの他の方法を実行して、細胞の移動とダイナミクスを経時的に観察することができます。このビデオを見れば、蛍光細胞集団内の単一細胞を区別する方法について十分に理解できるはずです。紫外線での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に必要な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

たとえば、光を直接見つめないでください。