Name: 生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの単一セル光電変換法。UV照射でEos蛍光タンパク質を変換し、生きたまま細胞移動を可視化する最小侵襲的技術。発生生物学の細胞動態研究に有用です。

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ベルナール ・ Kulemaka とサム ・ コネルとブレント レッドフォード 3i ゼブラフィッシュ ケアのため画像の質問とデボラ ビッグバン カレン耳を傾ける、ケイ ・ スチュワートの守備のための有用なコメントと試薬指導、スミス研究室のメンバーに感謝しますこの作品は、ゼブラフィッシュ研究幹細胞のセンターとノートルダム大学とノートルダム大学で再生医療のノートルダム大学、エリザベスとマイケル ・ ギャラガー家族、アルフレッド ・ p. スローン財団、センターによって支えられました。大聖堂。すべての動物の研究は、博士コーディ スミスに IACUC ノートルダム大学に準拠して行われました。

すべての動物の研究は、ノートルダム大聖堂機関動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュ標本の作製
<ol><li>標準的な手順13あたり交尾商工会議所にオス一匹と 1 つアダルト女性 Tg (転換タンパク質) を配置します。本稿では、Tg(sox10:eos) 魚9アクセスが蛍光蛋白質と他の形質転換線を同様に使用することができますを使用します。魚では、配置を行う場合に 1 つ以上の区域を設定します。一晩部屋のままに魚を許可します。</li>
	<li>次の朝は、100 mm のペトリ皿に卵を収集します。上映前に卵を成熟させ 24 時間後受精 (hpf) を許可します。</li>
	<li>上記の動物の遺伝子のヘテロ接合体なら、Tg(sox10:eos) + 488 nm 光源と GFP と胚の画面 24 hpf 料理は解剖顕微鏡のセットをフィルターします。Tg(sox10:eos) + 胚を分離でき、48 に成熟する hpf。</li>
	<li>針やピンセットを使って手動で Dechorionate 胚。</li>
	<li>準備、0.8% 低溶解点アガロース溶液の 5 mL を電子レンジします。<ol>
<li>Agarose が touch にクール、場所 3-4 麻酔 Tg (sox10:eos) +48 10 mm のガラス基板の中央に hpf 魚底シャーレ。</li>
		<li>カバーガラス、約 1 mL の表面をカバーする十分な agarose を追加します。探針を使用すると、その両側に魚を配置できます。動物の取付を確実に固めるための agarose を許可します。寒天の凝固14まで、ゼブラフィッシュを継続的に再配置する必要があります。凝固は約 2 分です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 分の agarose が凝固した後、ゆっくりと胚培 0.02% アミノ安息香酸エステル (Tricaine) 寒天や皿の底面を水中まで皿を追加します。これは、約 3 mL をする必要があります。</li>
</ol>2. 顕微鏡取り付けと事前変換イメージング
<ol><li>共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定「魚イメージングします」と呼びます</li>
	<li>共焦点範囲に試験片を置き、コースと微調整ノブを使用してフォーカスに。</li>
	<li>フォーカス ウィンドウを開き、興味 (すなわち後根神経節) の目的の地域を探します。</li>
	<li>C488 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。300 ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。</li>
	<li>キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。範囲を増加またはイメージング領域の深さに対応して縮小することができます。脊髄の間 35-40 スタック範囲の値は通常、[図 5] は。</li>
	<li>[図 5] の現在の場所を選択します。</li>
	<li>画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。</li>
</ol>3. 単一セルの光電
<ol><li>共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定は「魚は全チップを切除」と呼ばれる</li>
	<li>C488 c541 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。同じ顕微鏡のソフトウェアを使用していない場合、は、別のレーザーと選択、488 nm と 541 nm のレーザーを選択するメニューを見つけます。300 ms への露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。これらのレーザーの設定は、退色または毒性を引き起こすことがなく十分な蛍光シグナルを生成に基づいて選択されます。毒性や退色が視覚化されるレーザー パワーや露出を減らします。</li>
	<li>フォーカス ウィンドウを開き、フォーカス ウィンドウの [photomanipulation] タブをクリックします。レーザーのパラメーターを調整します。2、スタックのレーザー出力を変更しをクリックしてGo。ラスター ブロック サイズを 1 に変更し、設定をクリックします。ダブルクリックしてサイズを 4 に変更します。レーザー ラインを v405 に変更 [図 3]。</li>
	<li>キャプチャ ウィンドウの高度なキャプチャ設定を開きます。[Photomanipulation] タブを選択し、ダブルクリックして繰り返しを 2 に変更します。[図 4] [ok] をクリックします。</li>
	<li>フォーカス ウィンドウで、[XY] タブを選択します。[図 3,図 4] の [photomanipulation] タブで手順 2 からレーザーのパラメーターを再確認してください。Photoconvert なく周囲のセルの光電細胞にレーザーの設定を設定します。<ol>
<li>隣接するセルの光電が存在する場合は、レーザー出力を下げます。セルの光電が発生しない場合は、レーザーを増やすことができます。最適な photoconvert 興味のない周辺地域のみにレーザーの出力を設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タイムラプスをオンにすると、下の種類をキャプチャします。[図 6A] を開始をクリックします。</li>
	<li>ライブ タイムラプス ウィンドウが開いたら、[図 7] の上部のツールバーで、[円] ツールを選択します。</li>
	<li>セルの中央地域で円を描きます。引かれた円を右クリックして、 FRAP 地域を選択し、3 秒間待ちます。選択した領域は暗くなるべき [図 8]。キャプチャを停止をクリックします。</li>
	<li>1 つ以上の動物をイメージングする場合フォーカス メニューと選択位置 2 [XY] タブに戻ります。手順 4.1 4.6 を繰り返します。</li>
	<li>セルの人口を変換するには、手順 4.1 4.4 FRAP 関心領域は、線ツールを使用して円を描くのではなくのプロトコルおよびレーザーのパラメーターします。関心領域に直線を描くし、上記の同じパラメーターを使用して、領域を FRAP します。</li>
</ol>4. ポスト光電イメージング
<ol><li>すべてのポイントが photoconverted です。Precoversion イメージング手順 3 に記載されている設定ラボ固有の標準画像のスタックを選択します。これは、キャプチャ キャプチャ ウィンドウ [図 5] タブのドロップダウンの設定下にあります。</li>
	<li>C488 レーザーを選択し ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。</li>
	<li>C488 レーザーと同じメニューの下にある c541 レーザーを選択します。500 ms に露出を設定、レーザーの電源を 10、および 75 [図 9] を強化します。</li>
	<li>キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。増加または [図 5] 希望のイメージング深さに合わせて減少する範囲数。</li>
	<li>XY フォーカス] タブで複数のポイントがある場合は、キャプチャ ウィンドウでマルチポイント リスト オプションを選択します。ない場合は、現在の場所を選択します。</li>
	<li>画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
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<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

複雑な組織の種類セルは特定のドメインに整理します。最近の技術はこれらの大規模な組織の構造の1,2,の3の内で個々 のセルをラベルに利用されています。単一細胞の相互作用および複雑な組織内で細胞人口の相互作用を視覚化する同様に利用できる 2 つの手法を示します。光電技術の利点は、科学者はセルをはっきりとラベル、空間コントロールです。小さいを公開する機能を持つ顕微鏡とイメージングの領域拡大画像ウィンドウ内で単一のセルまたは単一のセルの領域を他のセルとは異なる分類ことができるような小さな領域を実行します。複数の蛍光タンパク質より広範な技術7を作るこのコミュニティに導入されている今。Photoconvert タンパク質の細胞内に能力を持つ科学者はこの技術や細胞移動、細胞分化と神経回路解析を調べると同様のアプローチを活用しています。
ソフトウェアおよび特定のレー...

複数の異なる細胞が複雑な動物や植物の組織の維持・構築に対話します。これらの細胞は、インターカ レートとティッシュの固定を必要とする高分解能顕微鏡なしの単一セルのレベルで近所の人から区別することは困難。しかし、どのようにこれらの組織フォームを理解、維持、病気になるには、組織内の単一のセルを調べることが不可欠がされて時間をかけて相互作用しています。理想的には、これらの実験は、固定する必要がなく非侵襲的な方法で組織内の単一セルのラベルを必要とします。科学者は今この作業1,2,3、4を達成するために多数の技術を開発しました。
発見とクラ ゲの緑色蛍光タンパク質 (GFP) の実装は、組織環境1の異なるセルのラベルの 1 つの刺激的なアプローチだった。細胞特異的発現プロモーターを使用して、それは遺伝子1のラベルが付いているセルのサブセットを選択することが可能です。また、GFP3,4のユーザー選択式の GFP の発現するウイルスを利用できます。GFP 発現の遺伝的媒介が; 組織における細胞のサブセットの内でユーザーが選択した式を許可しませんが、非常に便利でき、GFP のウイルス発現が有利な侵襲的です。単一細胞および複雑な組織2,でそれらの間の相互作用を視覚化することが可能なっている GFP 誘導体および Brainbow 組織内よりまばら異なる蛍光蛋白質を表現するような巧妙な技術の出現で、5します。 ただし、これらのアプローチがランダムな方法で細胞をラベルします。目的の実験には、単一細胞の可視化や実験者によって定義されているセルの人口が必要とする場合そのため制限されます。そのような実験と区別する単一のセル方式で操作できる遺伝子発現蛍光タンパク質を持っているに有利であろう他の蛍光・非蛍光性の細胞から。
この目標を達成するため、複雑な生体組織内の単一セルの細胞生物学を視覚化は、科学的なコミュニティは、異なる蛍光タンパク質6,7,8の単一セルの光電を使用します。緑から赤の蛍光状態紫外線にさらされたときに移行蛍光蛋白質 (すなわち、eos、楓等) の表現を制御する遺伝子を使用して (488 nm) 光、我々 は蛍光に分類されたからの単一のセルを区別できます。隣人6,7,8。このアプローチは、回折限界領域にレーザー スタックからライトを指示することができます私たちの共焦点の顕微鏡に接続されている装置を利用しています。この手法により、我々 はどちらか単一セルまたはユーザー定義の方法9,10,11より大きい人口ラベルできます。手法は、ウイルス ・ GFP の単一細胞注射に比べて低侵襲です。Photoconvert 末梢神経系と脊髄9,10の腹側に位置する細胞のようなより大きい人口を photoconvert 神経節内の単一細胞ことを示して我々 の概念の証拠として 11,12。彼らの動きや開発中に分化に洞察力を得るためにこれら photoconverted のセル人口 24 h 後、視覚化できます。

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos)ゼブラフィッシュの動物</td><td></td><td></td><td>魚は、ノートルダム大学の魚の施設から入手し、交配しました</td></tr><tr><td>100 X 15 mm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>胚媒体</td><td></td><td></td><td>胚培地は毎週作られ、ノートルダム大学の魚の施設から提供され、5L RO水、30uLのメチレンブルー、200mLの塩ストックが含まれています。</td></tr><tr><td>0.8%低融点アガロース</td><td>ドットサイエンティフィックインク</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mmガラスカバースリップボトムペトリディッシュ</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>針解剖プローブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002%3-アミノ安息香酸エステル(トリカイン)</td><td>フルーカ分析</td><td>A5040-250GGFP</td><td></td></tr><tr><td>フィルター付き蛍光解剖顕微鏡</td><td>ZEISS Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザーGFPおよびRFPフィルターセット</td><td>3iスピニングディスク共焦点</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光変換用UV光源(レーザー)</td><td>405nmレーザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドブックソフト</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>コルドン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

動物や植物の組織細胞の異なる集団で構成されます。これらの細胞と組織を維持・構築に時間をかけて対話中断されるとき病気を引き起こすことができます。科学者は、細胞のサブセットに蛍光蛋白質を表現することによって特徴とそのまま組織内でこれらの細胞の自然動態を調査するためのテクニックを開発しました。しかし、時は、実験は時単一細胞または細胞の人口のように、組織内の細胞より選択した可視化する必要があります。科学者はこれを実現し、セルの人口内の単一のセルを可視化する蛍光タンパク質の単一セルの光電を活用しています。このテクニックを示すためには、方法を示しますここをそのまま、興味の Eos を表現する細胞に UV ライトを指示するゼブラフィッシュの生活します。私たちは、どのように彼らは組織の変更を確認するそれらの photoconverted Eos+セル 24 時間後をイメージします。二つの手法: 単一セルの光電とセルの人口の photoconversions。これらの技術は、細胞間相互作用、細胞運命と分化、細胞移動、作りそれ多数の生物的質問に適用する技術を視覚化する使用できます。

組織6内の個別のセルにラベルを付けるには、蛍光タンパク質の光変換を使用できます。これを示すには、 Tg(sox10:eos)魚9 sox10の規制のシーケンス下の蛍光蛋白質 Eos を表現する使用されました。48 Tg(sox10:eos)動物 hpf が最初にマウントされていると、可能性があります任意の非特異的光電検出イメージを作成します。未変換の蛍光信号と小さな Eos photoconverted 蛍光信号が当時 Eos 視覚化 (図 10)。動物は、非固有光電は最低限確保するため暗闇の中で保たれました。その後、関心領域は、共焦点顕微鏡のセットアップを使用して紫外線にさらされました。単一セルされた紫外線暴露の結果として photoconverted であることを確認するには、photoconverted 地域にまたがる領域の z スタックしました。成功した光電...

ここでは、蛍光蛋白質、Eos、生きている動物の表現する特定の領域に紫外線暴露により光電セルを達成する方法を表示するためのプロトコルを提案する.

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

この光変換技術の全体的な目標は、単一動物の単一細胞を他の蛍光細胞集団と区別することです。この方法は、この分野での主要な発生上の質問に答えるのに役立ち、時間の経過に伴う単一細胞の移動を視覚化することができます。この技術の主な利点は、侵襲性が最小限で、単一細胞またはより大きな集団の標識に使用できることです。さらに、ユーザーは特定の関心領域を選択し、目的のターゲットを写真に変換できます。光変換性タンパク質を発現するゼブラフィッシュの雄と雌のトランスジェニックゼブラフィッシュを交配させ、テキストプロトコルに従って卵を採取した後、488ナノメートルの光源とGFPフィルターセットを備えた解剖顕微鏡を使用して、24 hpfの胚をスクリーニングします。針またはピンセットを使用して、手動で胚をデコリオネーションします。マイクロ波で、0.8%低融点アガロース溶液の5ミリリットルを準備します。アガロースが触るまで冷めたら、麻酔をかけたトランスジェニック sox10 eos 陽性 48 hpf の魚を 3 〜 4 匹、10 mm ガラス カバー スリップ ボトム ペトリ皿の中央に置きます。カバースリップの表面を覆うのに十分なアガロースを約1ミリメートル追加します。次に、プローブ針を使用して魚を横向きに配置し、必要に応じて調整しますが、アガロースが固まる間、約2分かかります。アガロースが2分間固まった後、0.02%アミノ安息香酸エステルトリカインを含む胚培地をゆっくりと皿に加え、寒天と皿の底面が沈むまで注ぎます。共焦点顕微鏡検査を行うには、共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャウィンドウとフォーカスウィンドウを選択します。変換前のイメージングを実行するには、キャプチャウィンドウとキャプチャ設定のドロップダウンタブで、イメージングパラメータを選択します。ここでは、フィッシュイメージングと呼ばれるラボ固有のスタック設定を紹介します。標本を共焦点顕微鏡に置き、粗調整ノブと微調整ノブを使用して焦点を合わせます。次に、フォーカスウィンドウを開き、後根神経節などの目的の関心領域を見つけます。フィルターセットメニューでc488レーザーを選択し、露出を300ミリ秒に、レーザー出力を5に、インテンシファイを75に設定します。次に、キャプチャタイプセクションで、3Dチェックボックスをオンにします。[3D キャプチャ] セクションで、[現在の位置を使用] を選択し、[現在の位置の範囲] をオンにします。同じセクションで、範囲を 35 に、平面の数を 36 に、ステップ サイズを 1 に設定します。現在の場所を選択し、キャプチャ ウィンドウの下部にある [開始] をクリックして画像を取得します。光変換プロセスの前に、レーザーパラメータを二重、三重に確認してください。変換ウィンドウが開いているときに、変換設定を再調整する必要がある場合があります。キャプチャウィンドウの「キャプチャウィンドウ設定」ドロップダウンタブで、ラボ固有のコンバージョンイメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定は、フィッシュアブレートフルチップと呼ばれます。フィルターメニューセットの下で、c488およびc541レーザーを選択します。露光を300ミリ秒、レーザー出力を5、強度を75に設定すると、光退色や毒性を引き起こすことなく十分な蛍光信号が生成されます。フォーカスウィンドウで、「photomanipulation」タブをクリックし、laserstackのパワーを2に変更して、「Go」をクリックします。ラスター ブロック サイズを 1 に変更し、[設定] をクリックします。次に、ダブルクリックのサイズを4に変更し、レーザーラインをv405に変更します。次に、キャプチャウィンドウで、キャプチャの詳細設定を開きます。[写真操作]タブを選択し、ダブルクリックの繰り返しを2回に変更して、[OK]をクリックします。フォーカス ウィンドウで xy タブを選択します。[光操作]タブで、レーザーパラメータを再確認してください。次に、レーザー設定を設定して、周囲の細胞を光変換せずに、目的の細胞を光変換します。[キャプチャタイプ]で[タイムラプス]チェックボックスをオンにし、[開始]をクリックします。ライブタイムラプスウィンドウが開いたら、上部のツールバーで円ツールを選択します。セルの中央の領域に円を描き、描いた円を右クリックして [FRAP 領域] を選択し、3 秒待ちます。選択した領域は、キャプチャの停止をクリックすると暗くなります。複数の動物をイメージングする場合は、フォーカスメニューのxyタブに戻り、位置2を選択します。次に、写真変換を繰り返します。細胞集団を変換するには、タイムラプスウィンドウを開いてプロトコルとレーザーパラメータに従います。ここで、円を描画して関心領域をFRAPする代わりに、ラインツールを使用して関心領域に線を描画します。次に、先ほど示したのと同じパラメータを使用して領域をFRAPします。すべてのポイントがフォトコンバートされたら、キャプチャウィンドウのキャプチャ設定ドロップダウンタブで、このビデオで前述したラボ固有の標準スタック設定を選択します。c488 レーザーを選択し、露出を 300 ミリ秒、レーザー出力を 5 ミリ秒、強度を 75 に設定します。c541 レーザーを選択し、露出を 500 ミリ秒、レーザー出力を 10 ミリ秒、強度を 75 に設定します。キャプチャタイプセクションで、3Dチェックボックスをオンにします。[3D キャプチャ] セクションで、[現在の位置を使用] を選択し、[現在の位置の範囲] をオンにします。同じセクションで、範囲を 35 に、平面の数を 36 に、ステップ サイズを 1 に設定します。範囲番号は、所望のイメージング深度に対応するために、増減してもよい。xy フォーカス タブに乗算ポイントがある場合は、キャプチャ ウィンドウで、マルチポイント リスト オプションを選択します。そうでない場合は、現在の場所を選択します。最後に、キャプチャウィンドウの下部にある[開始]をクリックして画像を取得します。これらのパネルは、トランスジェニックゼブラフィッシュの神経節内にある単一のプレフォト変換細胞が、sox10制御配列の制御下で光変換可能なeosタンパク質を発現していることを示しています。光変換後、eosは関心領域内に明確に存在し、隣接する細胞は標識されませんでした。この光変換技術の有用性を実証するために、脊髄の腹側にある細胞集団を線を用いて紫外線に曝露した。その後、ラインの領域で光変換されたeosタンパク質を示す画像が撮影されました。光変換されていないeosタンパク質は、他のすべての領域で見られました。光変換の数時間後、光変換されたeos陽性細胞が脊髄領域全体に散らばっている背側と腹側の両方の位置に散らばっていることを示す同一の画像が撮影されました。この発見は、腹側脊髄細胞が背側の位置に移動したという仮説と一致しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、30〜45分で実行できます。この手順を試行する際は、関心領域で光変換が行われたことを確認するために、変換後の画像を撮影することを忘れないでください。この手順に続いて、タイムラプスイメージングなどの他の方法を実行して、細胞の移動とダイナミクスを経時的に観察することができます。このビデオを見れば、蛍光細胞集団内の単一細胞を区別する方法について十分に理解できるはずです。紫外線での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に必要な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。たとえば、光を直接見つめないでください。

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。...

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Ti:Sapphireフェムト秒レーザー発振器による2光子吸収を用い、ケージド蛍光タンパク質を含む単一細胞を光活性化させる方法について記述します。光活性化された細胞の運命地図（フェイトマッピング）を作成するために、免疫組織化学法を用います。この手法は、あらゆる細胞型に適用可能です。...

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ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

このビデオは、光変換可能な緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生を使用した白血球動員の追跡を示しています。赤色蛍光色素標識細菌を耳小胞に事前に注入し、光変換を誘導することで、白血球の遊走、食作用、全身への分散を観察することができ、免疫応答のダイナミクスに関する貴重な洞察を得ることができます。...

細菌感染トランスジェニックゼブラフィッシュにおける光変換に基づく白血球追跡

前新生物細胞進行及び先天性免疫細胞相互作用の最も初期の事象を研究することは理解して癌を治療するために極めて重要である。ここでは、条件付きで上皮細胞の変換とHRAS G12Vは 、ゼブラフィッシュの幼虫に皮膚細胞を発現する、自然免疫細胞の相互作用のその後のライブイメージングを誘導する方法を説明します。...

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

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Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

ゼブラフィッシュ網膜再生は、主に固定した網膜を用いて研究されています。しかしながら、このようなinterkinetic核移行などの動的プロセスは、再生反応時に発生し、根底にあるメカニズムを調べるために生細胞イメージングを必要とします。ここでは、多光子顕微鏡を用いてリアルタイムにInterkinetic原子力移行（INM）を監視するために文化や撮影条件を説明します。...

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

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トランスフェクション ライブセル...

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

学ぶゼブラフィッシュの単一セル光電変換法。UV照射でEos蛍光タンパク質を変換し、生きたまま細胞移動を可視化する最小侵襲的技術。発生生物学の細胞動態研究に有用です。

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

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