Name: 腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学ぶ腸管上皮細胞の透磁率測定法。上皮電気抵抗測定とFITC-デキストラン経口投与法を用いて、炎症性腸疾患などの消化管疾患における上皮バリア機能障害を評価する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ジェロルド ・ r ・ ターナーの博士、Brigham および女性の病院、ハーバード大学医学部からは、本研究を完了するために彼の寛大な助けを感謝いたします。この作品に支えられて (許可番号 81470804、31401229、および 81200620) 中国の国家自然科学基金、自然科学財団の江蘇省 (許可番号 BK20180838、および BK20140319)、研究開発、イノベーション プログラム江蘇省の大学の卒業生 (許可番号 KYLX16-0116)、東呉大学の研究プロジェクトの高度な (許可番号 SDY2015_06)、クローン ・大腸炎財団研究奨励賞 (許可番号 310801)。

本研究は、動物のケアし使用プロトコルのケンブリッジ須田ゲノム リソース センター (カム SU)、東呉大学によって承認されました。
1. めっきと多孔性ポリカーボネート膜カコ 2bbe のメンテナンス
<ol><li>メディアと T75 フラスコ内のセルの成長 (10% を含む DMEM FBS)。フラスコは、細胞密度によって定期的に供給する必要があります。 注: 最適なめっき細胞が急速に分割し、セルが成長段階にあることを示すフラット「目玉」の形をしています。</li>
	<li>一度細胞が 80% 合流、インキュベーター外フラスコを取る、メディアを取り出します。1-2 ml の滅菌 PBS (せずに Ca2 +) の任意の残留メディアをすすいでください。ピペット 1.5 mL のトリプシン-EDTA フラスコに、優しくロック フラスコ;その後、揺動なし 20 分の 37 ° C の定温器にフラスコを配置します。</li>
	<li>一方、細胞がトリプシン、24 ウェル プレートに多孔性ポリカーボネート膜 (細孔径、0.4 μ m; 表面積 0.33 cm2材料の表を参照してください) を含む場所を挿入します。基底の商工会議所 (膜の下の領域) に 1.0 mL の培地を追加します。</li>
	<li>ピペット 5 mL のフラスコと精力的にピペットにメディアのフラスコの側に対する細胞 5-10 倍緩い、個々 のセルまたは 2-3 セルを達成するために群生します。</li>
	<li>
頂の商工会議所 (膜の上部の空間) に (1:8 の希釈倍率を達成する) セルの 0.166 mL をプレートします。3 週間、37 ° C で孵化させなさい。
	<ol>
<li>フィードのセル 3 回毎週よく圧力ポンプを使用してそれぞれの基底のコンパートメントからメディアを慎重に吸引します。軽く各挿入の頂の商工会議所にメディアの 1 mL を滴下します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 上皮メーター (ボルト/オーム) テルを測定するための使用
注: ポリカーボネート膜における文化の約 3 週間後炭酸カルシウム 2BBe セル、テルの測定にも対応。
<ol><li>サイトカイン研究、測定、前日は肝腎の 10 ng/mL を含むメディアで基底メディアを置き換えます。実験の日、TNF の 2.5 または 7.5 ng/mL を含む HBSS でメディアを置き換えます。 注: 肝腎治療 TNF 受容体 2 (TNFR2) の発現を増加させる16。</li>
	<li>メーターを修正するには、入力ポートに補正電極を挿入し、「オーム」モードを選択します。メーター表示 1,000 Ω を読むまでは、ドライバーで R Adj スクリューを調整します。</li>
	<li>15-30 分の 70% エタノールにそれらを置くことによって電極を滅菌し、それら空気乾燥 15 s. リンス実験細胞の培地に電極します。</li>
	<li>電源をオンにし、「オーム」モードを選択します。慎重に基底の商工会議所と根尖部の商工会議所に短い端に電極橋の長い端を配置します。長い電極メディアがこれらの組織培養インサートの表面の下の短い電極を維持しながら、皿の底に触れることを確認します。電極を垂直に保つために。</li>
	<li>サンプル挿入の抵抗を測定し、0、1、2、3、4 h サイトカイン治療後に (すなわち、文化挿入セルなく HBSS) 空白を挿入します。抵抗値を記録します。</li>
	<li>異なるプレート フォーマット間での一貫性を達成するため、抵抗と有効膜面積の積を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> 24 ウェル挿入、有効膜面積は 0.33 cm2です。</li>
</ol>3. デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) のマウスモデル-誘発大腸炎
<ol><li>3.5% (重量/巻) の最終濃度にオートクレーブ養生水に DSS を追加します。</li>
	<li>3.5% を管理する 7 日間の合計は 8 週齢雄 c57bl/6 マウス DSS。コントロール マウス DSS せず定期的な飲料水を与えます。<ol>
<li>7 日後、定期的な飲料水に DSS を含む水を切り替えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの重さし、毎日各マウスの臨床スコアを評価します。その初期の体重ごとのマウスの体重を正規化します。スコアは、疾患の重症度によると 4 つのパラメーターによって定義されます: アクティビティ (0-2)5出血 (0-2)、スツールの一貫性 (0-2) 直腸脱 (0-2)。最終的な臨床スコアのこれらのパラメーターからの点数を合計します。</li>
	<li>結腸組織の病理組織学的条件を分析し、1.2% (巻/巻) Avertin (0.6 mL/10 g 体重) 7 日間ポスト DSS 処理 (i. p.) 腹腔内注入によるマウスを安楽死させます。100% タヴェルタンの在庫を準備、tert アミル アルコール 10 ml で 2,2,2 tribromoethanol の 10 g を混ぜます。 4 ° C で暗闇の中で保存します。使用して、水で 2% に 100% 株式を希釈します。</li>
	<li>コロンおよび盲腸を切り分け、コロン5の長さを測定します。</li>
	<li>一晩 10% ホルマリン 10 mL を含む 15 mL ファルコン管内遠位大腸や修正から 0.5 cm セグメントをカットします。傾斜エタノール固定組織を洗う (75、95、および 100%)、キシレン。パラフィンの組織を埋め込み、ヘマトキシリン ・ エオジン染色8の 6 mm のセクションをカットします。</li>
</ol>4. DSS 誘発大腸炎マウス上皮関門の透過性の測定
<ol><li>DSS 投与の開始後 7 日関門の透過性を測定します。</li>
	<li>アッセイの日、3 h のマウスの高速します。</li>
	<li>オートクレーブ、強制経口投与は不妊、150 μ L 80 mg/mL 4 kDa 滅菌水で FITC デキストラン、強制経口投与マウスを確実に針し、血清コレクション後標準曲線を測定する未使用の FITC デキストランを維持します。透過性の計算のためのマウスの重量を量る。 注: FITC デキストラン ソリューションは、水にすべきであります。</li>
	<li>はさみのペアを使用して、尾の 1 cm 部分をクリップし、血清採血管に尾から 100 μ L の血液を収集します。室温で 10 分間、10,000 × g で収集した血液をスピンします。</li>
	<li>血清 1:4 水で希釈します。標準的なカーブ、000、000、1:3、1:1、1: 300 で水と未使用 FITC デキストランを希釈する 1:10、000、1:30, 000、1: 100 000、1: 300 000、1:1, 000, 000、1:3, 000, 000。96 ウェル プレートに 100 μ L/ウェルの血清および標準曲線サンプルを追加します。</li>
	<li>485 励起/528 発光プレート リーダーの蛍光を読み取る。基準曲線に基づいた透磁率の値を計算し、希薄化の修正に 4 を掛けます。</li>
	<li>(これによりマウスが病気および重量を失っている場合に FITC デキストラン配信の違いを正規化) 値を正規化する重量で FITC デキストラン濃度を割ります。</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

プロトコルのいくつかの重要な手順があります。カコ 2BBe (ブラシの境界線-表現) 細胞は常にブラシの縁の蛋白質の表現のため炭酸カルシウム 2 細胞ラインから選択したテル測定用します。カコ 2BBe 細胞膜絨毛の吸収性表現型があるとき (文化後合流点の約 3 週間) 後十分に区別される17。測定時の汚染を避けるために、電極を滅菌する必要があります。プロシージャが非滅菌のためほとんどの場合 8 h までの測定をのみ実行できます。測定中、我々 は挿入外 2 点の抵抗値を決定しました。様々 なサイトで抵抗測定時に大きく細胞状態の違いにより異なる場合これ法の主要な制限です。ただし、この変化が、大幅に統計的な方法および他の方法で削減できます。テル法は、肺上皮細胞や血管内皮細胞のバリアの整合性を判断するなど、他のセルに適用できます。さらに、テルの測定は、薬物毒性試験で使用できます。
拡散によって腸の粘膜上皮を入力すると、難消化性の高分子の管理は、腸の透過性を評価する使用できます。このメソッドの利点は、腸のバリア機能が検査された生体内で<...

腸管上皮細胞のみ、栄養素の吸収に責任がないが、また、病原性微生物や微生物毒素に対して守るために重要な障壁を形成します。この腸管バリア機能はタイトな接合部の透過性と上皮細胞の整合性1,2,3、によって調整され上皮バリア機能の機能不全、炎症性腸に関連付けられて病気 (IBD)。Perijunctional アクトミオシン リング (PAMR) タイトな接合に密接に隣接セルの中にあります。ミオシン軽鎖 (MLC) によって規制されている PAMR の収縮はタイト結合透磁率4,5,6,7、8の規則のために重要です 9,10。腫瘍壊死因子 (TNF) 骨折腸上皮 MLC キナーゼ (軽) 式、オクルディン内面11,12,13を誘導する腸の壁損失の中心です。
+の Na および Cl-などのイオンは、孔またはリーク経路14傍細胞領域を越えることができます。「漏れやすい」上皮におけるテル変化主に透磁率変化のタイトな接合を反映します。テルの測定は、タイトな接合部の透過、+の Na および Cl-、主に細胞膜のインピー ダンスに基づくを定量化する一般的な電気生理学的アプローチです。腸管上皮細胞、肺の上皮細胞と血管内皮細胞を含む多様な細胞型は、テル測定の報告されています。この方法の利点は、テルの測定が、非侵襲的、リアルタイムで生きているセルの監視に使用することができることです。さらに、テルの測定技術、薬剤毒性研究15に適しています。
カコ 2BBe 細胞は、構造と機能分化の小さい腸上皮細胞に似たひと上皮大腸腺癌細胞: たとえば、これらの細胞がある微絨毛と小さい腸ブラシに関連する酵素境界線。したがって、培養炭酸カルシウム 2BBe 単分子膜がバリア機能をテストするための in vitroモデルとして利用されています。
マウス腸管傍細胞透過性を勉強する 1 つの方法は、FITC デキストランの内腔から血液に入り込む能力を測定することによってです。したがって、腸の透過性は gavaging デキストラン投与によりマウスと血液内の蛍光測定に直接によって評価されます。次のプロトコル記述する腸上皮の透過性を評価するために 2 つの単純なメソッドの in vitroとin vivoの両方。

<table><tbody><tr><td>22 G 強制針</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>蛍光用黒色 96 ウェルプレート</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 マウス</td><td>南京大学</td><td></td><td></td>南京生物医学研究所</tr><tr><td>Caco-2BBe 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム</td><td>MP バイオメディカル</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>高グルコースおよびピルビン酸ナトリウム</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>上皮(ボルト/オーム)メーター</td><td>ミリセル-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シノファーム ケミカル試薬</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ (15 mL)</td><td>コーニング</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4、15.0 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、25 mM グルコース&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>モジュラー組織包埋センター</td><td>ライカ</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>血清収集チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75</td>フラ<td>スココーニング</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>シグマ</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートの膜(トランズウェル)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr>圧力<tr><td>ポンプ</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトミー</td><td>ライカ</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sinopharm Chemical試薬</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

腸粘膜バリアーを病原性微生物と微生物毒素に対して守る。その機能はタイトな接合部の透過性と上皮細胞の整合性によって調整され、腸管バリア機能の破壊は、消化管と全身性疾患の進行に貢献します。2 つの単純な方法は小腸上皮の透過性を測定するとおりです。体外、単層として炭酸カルシウム 2BBe 細胞培養ウェルズにメッキパーツをし上皮電気抵抗 (テル) は上皮 (ボルト/オーム) 計で測定できます。このメソッドは、そのユーザーフレンドリーな操作性と再現性のため説得力が。生体内で、マウスが 4 kDa かに (FITC) と gavaged-デキストランと FITC デキストラン濃度上皮の透過性を決定するためのマウスから収集された血清検体で測定されます。経口は、正確な用量を提供します、生体内で腸の透磁率を測定する方法です。一緒に取られて、これらの 2 つの方法腸上皮体外と体内の透水性を測定することができます、したがって病気とバリア機能間の接続を調査する使用します。

文化では、カコ 2BBe 細胞が単層として成長し、ゆっくりと刷子縁がある成熟の吸収上皮細胞に分化します。このプロトコルでは炭酸カルシウム 2BBe セルされたポリカーボネート膜の高密度めっきし、細胞に達した 100% の confluency 播種後 1 日。ただし、セルは、この段階では差別化ではない: 完全にセルを区別するためにメディアが 3 週間ごとに 2-3 日間に変更されました。細胞核と染色し、F アクチン汚れ未分化や分化した細胞間の相違点を表示します。ストレスファイバーは未分化細胞で明らかに見られます。未分化細胞と比べると、分化した細胞があるより小さいボリューム, 大きい核と少ないストレスファイバー (図 1)。
TNF は、ミオシン依存タイト結合規制を通じて腸粘膜バリアー損失の中心です。なし、または異なる時点で TNF 治療とセルのテルを行った。<strong class="xfi...

2 つのメソッドは、腸管のバリア機能を決定するここで掲載されています。上皮メーター (ボルト/オーム) は、組織培養の井戸に直接培養上皮細胞の上皮電気抵抗の測定に使用されます。マウスで FITC デキストラン強制経口投与メソッドを使用して、体内の腸の透過性を判断します。

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

この実験の全体的な目的は、腸内の上皮細胞透過性をインビトロおよびインビボで測定することによって上皮バリア機能障害によって引き起こされる疾患を研究することです。この方法は、炎症性腸疾患に関連するものなど、腸バリア機能分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腸内上皮細胞の透過性がインビトロおよびインビボの両方で評価できることである。腸上皮バリア機能障害がこれらの疾患に寄与するため、この技術の意味は、胃腸疾患の治療または診断に及ぶ。この方法は、腸のバリア機能に関する洞察を提供することができますが、薬物毒性研究や他の細胞タイプのバリア完全性などの他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、いくつかの手順を学習することが困難であるため、重要です。この方法の正確な動作は、テキスト記述によって理解できるようになりました。まず、Caco-2bbe細胞を培地でT75フラスコで増殖させます。細胞密度に応じて、フラスコを定期的に供給します。細胞が80%コンフルエントである場合は、培地を取り除き、カルシウムなしで1〜2ミリリットルの無菌PBSを使用してリンスします。トリプシンEDTAを1.5ミリリットル加え、フラスコをそっと揺らします。その後、37°Cインキュベーターに20分間、揺れることなく置きます。細胞がトリプシン化されている間、多孔質ポリカーボネート膜を含むインサートを24ウェルプレートに入れる。次に、膜の下部スペースである基底室に培養培地を1ミリリットル加えます。フラスコに培地5ミリリットルを加え、フラスコの内側に対して細胞を5~10回激しくピペットし、培養液を緩い個々の細胞、または2〜3個の細胞塊に分離する。膜の上部スペースである天端チャンバに細胞の0.166ミリリットルをプレートします。その後、37°Cでプレートを最大3週間インキュベートします。細胞を週3回送り、圧力ポンプを用いて各井戸の基底コンパートメントから培地を慎重に吸気する。その後、各インサートの尖体室に1ミリリットルの培地をそっと滴り落とします。サイトカイン研究では、経上皮電気抵抗またはTER測定の1日前に、インターフェロンガンマの1ミリリットル当たり10ナノグラムを含む媒体で基底媒体を交換する。実験の日に、TNFの1ミリリットルあたり2.5または7.5ナノグラムを含むHBSSで媒体を交換してください。メーターを補正するには、入力ポートに補正電極を挿入し、オームモードを選択します。次に、ドライバを使用して、メーターに 1,000 Ω の測定値が表示されるまで R 調整ねじを調整します。70%エタノールで15~30分間殺菌し、15秒間空気乾燥させます。次に、実験細胞培養培地中の電極をすすい。次に、電源を入れ、オームモードを選択します。電極を垂直に保ちながら、電極ブリッジの長い端を基底室に慎重に配置し、皿に触れられるようにします。次に、短い端を補助室に入れ、それらが培地の表面の下にとどまることを確認しますが、組織培養は挿入します。サイトカイン処理後0、1、2、3、および4時間でサンプルおよびブランクインサートの抵抗を測定します。その後、抵抗を記録します。異なるプレートフォーマット間で一貫性を達成するために、次に示すように抵抗と有効な膜領域の積を計算します。24ウェルインサートの場合、有効な膜面積は0.33平方センチメートルです。大腸炎を誘発するには、DSSをオートクレーブ水に加え、体積当たり3.5%の重量の最終濃度にします。次に、DSS溶液を使用して、8週齢の雄C57黒6匹のマウスのケージ内の飲料水を合計7日間交換します。マウスを制御するためにDSSなしで定期的な飲料水を与えます。7日目以降、DSS水を通常の飲料水に切り替えます。毎日、マウスの体重を量り、直腸脱出、便の一貫性、出血、および活性の4つのパラメータによって疾患の重症度に従って定義された臨床スコアを評価する。これらのパラメータのスコアを合計して、最終的な臨床スコアを得ます。DSS治療後7日間の大腸組織の病理組織状態を解析し、テキストプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、結腸と盲腸を単離し、結腸の長さを測定する。遠位結腸から0.5センチメートルのセグメントを切断し、10ミリリットルのホルマリンを一晩含む15ミリリットルのハヤブサチューブに組織を固定する。グレードエタノールとキシレンで固定組織を洗浄します。その後、パラフィンに組織を埋め込み、ヘマトキシリンとエオシン染色のための6ミリメートルのセクションを切断します。DSS誘導マウスにおける上皮バリア透過性を測定するために、DSS投与開始から7日後、マウスを3時間速くする。ガバジ針をオートクレーブして無菌性を確保し、滅菌水中に4キロダルトンFITCデキストランあたり150マイクロリットルを使用してマウスを飼育し、未使用のFITCデキストランを維持して血清採取後の標準曲線を測定します。次に、透過性計算のためにマウスを重み付けします。4時間後、IP注入によりマウスを麻酔した後、反射神経およびウィスカーの動きの欠如によって適切な麻酔を確認する。その後、マウスをヒートブロックに5分間置きます。はさみを使用して、尾の1センチメートルの部分をクリップし、血清採取チューブに尾から血液の100マイクロリットルを収集します。採取した血液を10,000倍g、室温で10分間回転させます。水で、血清を1~4個希釈します。次に、標準曲線を作るために、水を使用して未使用のFITCデキストランの希釈液を調製する。血清のウェルあたり100マイクロリットルを加え、標準曲線サンプルを96ウェルプレートに加えます。プレートリーダーを使用して、励起485と528の発光で蛍光を読み取ります。標準曲線に基づいて透過性値を計算し、希釈を補正するために 4 を掛けます。FITC デキストランの濃度を重みで割って値を正規化します。これは、マウスが病気で体重が減った場合にFITCデキストランデリバリーの差を正常化するのに役立ちます。ここに示すCaco-2bbe細胞は、未分化細胞と分化細胞の違いを示すために核およびF-アクチン染色で標識した。ストレス繊維は未分化細胞にはっきりと見られます。分化された細胞は、未分化細胞よりも体積が小さく、核が大きく、ストレス繊維が少ない。TNFはMLCK依存性の堅い接合の調節を通して腸の障壁損失に中心である。この図に見られるように、TNFは用量依存的にCaco-2bbe単層のTERを有意に減少させ、TNFが上皮透過性を増加することを示唆している。最初の体重と比較して、DSSで治療されたマウスはかなりの量の体重を失う。大腸炎の重症度は、直腸脱、便の一貫性、出血、および活動によって採点される。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された大腸組織の断面は、DSS処置マウスにおける大腸粘膜損傷を示す。さらに、大腸暗号の長さだけでなく、結腸自体も、DSS処理マウスでは減少する。最後に、DSS処置マウスのFITCデキストラン染色のレベルは、コントロールマウスと比較して約2倍に増加しています。この手順を試みる際には、運用手順を標準化し、統計的手法を利用して、エラーを最小限に抑えることを忘れないようにしてください。その開発後、この技術は、モデル生物と細胞株の両方で胃腸疾患を探求する腸バリア機能の分野の研究者への道を開いた。このビデオを見た後、TERを測定し、FITCデキストランを見学し、形態学的および組織化学的変化を観察することによって、腸上皮透過性を決定する方法をよく理解する必要があります。

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、腸バリア機能のex...

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

炎症性腸疾患（IBD）の現在の治療は、疾患の症状の緩和を目指すが、重篤な副作用を引き起こす可能性があります。したがって、代替戦略は、動物大腸炎モデルにおいて研究されています。ここでは、臨床的なIBDの兆候にダイエットサプリメントの有益な効果は、このような大腸炎モデルで分析されている方法について説明します。...

実験的大腸炎の間、腸上皮バリア機能に栄養補助食品の有益な効果を分析

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

栄養素、微生物叢代謝および循環に医薬品へのアクセスは、腸・血液関門 (GBB) によって制御されます。直接 GBB...

腸血液関門と微生物叢製品の肝代謝を評価するためのIn Vivo法

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。...

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。...

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。...

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。...

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

動物全体でMG53を介した細胞膜修復のと細胞​​レベルで動的なプロセスを視覚化するために使用されるプロトコルは、ここで説明する。これらのメソッドは、細胞膜の再シール性と再生医療の細胞生物学を調査するために適用することができます。...

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

学ぶ腸管上皮細胞の透磁率測定法。上皮電気抵抗測定とFITC-デキストラン経口投与法を用いて、炎症性腸疾患などの消化管疾患における上皮バリア機能障害を評価する技術です。

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

さらに動画を探す