マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞

この実験の全体的な目的は、目的遺伝子の過剰発現またはサイレンシングによってマウス骨髄系32D-G-CSF-R細胞を遺伝的に改変し、これらの変化が細胞株の増殖および好中球分化に及ぼす影響を決定することです。この手法は、目的のタンパク質が骨髄系前駆細胞の増殖および分化にどのように関与しているかなど、血液学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この細胞株の主な利点は、無限の増殖能を持ち、遺伝子操作が容易であり、コストが比較的低く、特定の実験的アプローチに必要とされるある程度の生物学的簡略化が可能であることです。本日の手順の実演は、私の研究室の博士課程学生であるPetr Danekが行います。

熱不活化10%胎児牛血清および10 ng/mLのマウスinterleukin-3を添加したRPMI-1640培地を250 mL調製します。次に、分化培地を50 mL調製します。

16 cmのペトリ皿に、10%胎児牛血清を添加した18 mLのDMEM培地を用い、Bosc23細胞の単一細胞懸濁液を播種します。コンフルエンシーが80%に達するまで、約24時間培養します。次に、MSCVレトロウイルス構築物、PCL-echoパッケージングベクター、ポリエチレンイミン、および抗生物質を含まない低血清培地を混合します。この混合液をFlowbox内で室温にて20分間インキュベートします。その後、Bosc23細胞の培養液を、37 °Cに保温した2%胎児牛血清添加DMEM培地16 mLに注意深く置換します。続いて、レトロウイルス混合液をBosc23細胞に滴下して加えます。その後、培養液を37 °Cで4時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、Bosc23培地を吸引し、10%胎児牛血清を含む予熱したDMEM培地を18 milliliters添加します。細胞を37 degrees Celsiusで48時間インキュベートします。25 milliliterセロロジカルピペットを用いて、Bosc23ウイルス含有培地を50 milliliterコニカルチューブに回収します。チューブを4 degrees Celsiusで保存します。その後、Bosc23細胞に10%胎児牛血清を含む予熱したDMEM培地を18 milliliters添加し、細胞を24時間培養します。

ウイルス含有上清を 4 °C で 1,500 ×g、10 分間遠心分離します。その後、ウイルスを分注し、液体窒素で急凍結させて -80 °C で保存します。

6ウェルプレートの各ウェルに、10%胎児牛血清を添加した3mLのDMEM培地を用いて、ウイルス力価測定用のNIH/3T3細胞を播種します。細胞を37°Cで一晩培養します。翌日、ウイルス粒子をボルテックスせずに、あらかじめ温めておいた培地でウイルスを希釈します。NIH/3T3細胞から培養液を吸引し、各ウェルに希釈ウイルス液を1mLずつ加えます。37°Cで一晩インキュベートします。翌日、希釈ウイルス培地を慎重に吸引し、10%胎児牛血清を含む2mLのDMEM培地と交換し、再び37°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、古い培地を吸引し、2µg/mLのピューロマイシンを含むDMEM培地と交換します。3日ごとに、または培地が黄色に変化した際に、ピューロマイシンを含む新鮮な培地を補充して培養を継続します。

感染後10日から12日の間に、ウェルから培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水で静かに洗浄します。次に、1 mLのクリスタルバイオレット溶液を用いて室温で2分間染色します。染色後、リン酸緩衝生理食塩水で注意深く2回洗浄します。顕微鏡下で、各ウェルに存在する青色コロニーの総数をカウントします。

32D-G-CSF-R細胞を6ウェルプレートに播種します。感染多重度（MOI）10から40でウイルスを添加します。次に、細胞にポリブレンを最終濃度8 µg/mLとなるように添加し、37 °Cで6時間インキュベートします。インキュベート後、細胞を15 mLチューブに回収し、4 °Cで450 ×gにて5分間遠心分離します。32D細胞は、1 × 10⁶ cells/mLを超える濃度で培養すると分化能を部分的に喪失する場合があるため、適切なタイミングで細胞を継代し、過成長させないことが非常に重要です。

上清を捨て、熱不活化10%胎児牛血清および10 ng/mLのマウスインターロイキン-3を添加した6 mLのRPMI-1640培地を含むT25培養フラスコに細胞を再懸濁する。細胞を37 °Cで48時間インキュベートする。

サイトカインを含まないRPMI-1640培地で32D-G-CSF-R細胞を2回洗浄します。次に、0日目に24ウェルプレートの各ウェルに分化培地1 mLとともに細胞を播種し、37 °Cで一晩インキュベートします。細胞が成熟顆粒球に分化するまで7〜9日かかります。その後、トリパンブルーを用いて死細胞を除外し、細胞数を計測します。

IL-3は分化過程を抑制する可能性があるため、細胞をGCSFで培養する前に、このサイトカインの痕跡を完全に除去することが極めて重要です。

適切なアダプターを装着した遠心分離機を用いて、細胞をガラススライド上に20 ×gで5分間サイトスピンします。次に、室温でメタノールを用いて細胞を5分間固定し、乾燥させます。製造元のプロトコルに従い、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色を用いて細胞を染色します。染色後、染色された細胞を40倍の倍率で観察します。

細胞形態に基づき、染色された細胞中の芽球、中間分化細胞、および成熟顆粒球の数を定量します。

ここでは、interleukin-3および顆粒球コロニー刺激因子を含む培地における32D-G-CSF-R細胞の増殖を示すグラフを示します。x軸は処理日数、y軸は対数スケールでの細胞数 representsしています。黒色のプロットは、細胞をinterleukin-3含有培地で培養したときの増殖を示しています。青色のプロットは、顆粒球コロニー刺激因子含有培地で培養したときの細胞増殖の低下を示しています。

ここでは、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有培地における32D-G-CSF-R細胞の割合と分化形態を示す代表的な円グラフおよびMay-Grunwald Giemsa染色像を示します。円グラフは、G-CSF処理後0日、2日、4日、および6日における芽細胞、中間分化細胞、および好中球の割合を示しています。0日目のGiemsa染色細胞は、特徴的な大きな核と暗い細胞質を有しています。6日目には、核のサイズが縮小し、細胞質は拡大していますが、暗くはありません。

ここでは、顆粒球コロニー刺激因子を含む培地において、コントロールMSCVベクターと比較してBCR-ABL融合タンパク質を導入した際に芽球の割合が高くなることを示す代表的な円グラフを示しています。下パネルのギムザ染色は、コントロールまたはBCR-ABL融合タンパク質を導入した際の細胞の代表例です。

MSCVコントロールベクターを導入した細胞は6日目に好中球への分化が認められましたが、BCR-ABLを導入した細胞はほとんどが芽球であり、成熟好中球は見られませんでした。

この手法に習熟すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。この手順を行う際は、指示された濃度で32D-G-CSF受容体細胞を培養することを忘れないでください。本手順に続き、さらなる疑問を解消するために、遊走アッセイや生存実験などの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、レンチウイルスおよびレトロウイルス導入による遺伝子操作、拡大培養、分化、ならびにこれらの細胞の増殖と分化の評価を含む、32D-G-CSF受容体細胞株の取り扱い方法について十分に理解できるはずです。ウイルスを扱う際は危険が伴うため、本手順の実施中は、常に手袋や保護メガネの着用などの予防策を講じることを忘れないでください。