Name: マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶマウス骨髄前駆体32D/G-CSF-R細胞の培養と遺伝子改変による増殖・分化解析の手法。ウイルス感染とアッセイを用いて骨髄球の発生機構を解明し、血液学研究に貢献します。

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著者は、教授ルード ・ Delwel と 32D/G-CSF-R セルラインをご提供する教授 Ivo Touw と教授ダニエル g. Tenen Bosc23 細胞株をご提供するためにありがとうございます。この作品は MA J にチェコ共和国 (GACR 15 03796S と GACR 17 02177S) の助成機関の補助金によって支えられた、MA - j、ジョージア州英国フェローシップ (プロジェクト号 341015) チェコ科学アカデミー (RVO 68378050) の分子遺伝学研究所からのサポートPD にプラハ ・ カレル大学から MK とジョージア州英国親睦 (プロジェクト号 1278217) にプラハのチャールズ大学。

メモ: 手順は、拡張を記述する、分化および 32D/-r-CSF G 細胞の伝達以下に示します。
1. 準備
<ol><li>メディアの準備
	<ol>
<li>250 mL の培養液の準備: FBS (ウシ胎児血清) とマウス IL 3 に 10% 熱 (ロズウェル パーク記念研究所) RPMI 1640 培が不活化 (10 ng/mL)。<ol>
<li>また、自家製の IL 3 を使用します。自家製 IL 3 を生成するには、IL 3 表現するベクトルを HEK293 細胞を変換し、IL-3 清22を含むを収集します。 注: 抗生物質、ペニシリン G など (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ g/mL) は、特に明記しない限り、プロトコルのすべてのステップで, 培養細胞の使用できます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分化培地 50 mL を準備: RPMI 1640 中 10% 添加した引受とヒト G-CSF (100 ng/mL)。 注: しないすべての血清バッチ サポート 32D/-r-CSF G 細胞の分化 (重要)。実験開始前に、血清中の別のバッチをテストします。少なくとも 4 つの異なるバッチをテストし、最適な区別する 32D/G-CSF-R セルの能力に基づいて選択することをお勧めします。32D/G-CSF-R 分化プロトコルの以下を参照してください。</li>
		<li>凍結培地 10 mL を準備: RPMI 1640 中 40% 添加した引受と 10 %dmso (ジメチルスルホキシド)。</li>
	</ol></li>
	<li>レトロ ウイルスの生産
	<ol>
<li>Bosc23 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 18 mL で育んでいます。 注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。細胞数は、異なるメソッド (ここに示すプロトコルの残りの部分に有効) を使用して実行できます。サンプル数が少ない、場合 Bürker チャンバーを用いた顕微鏡下で手動カウントを推奨します。この場合、死んだ細胞の排除のためトリパン ブルー色素を使用します。セル 1:1 を混ぜて 0.4% トリパン ブルー PBS で。多くのサンプル数のカウントを実行するには、セルの自動カウンターを用いることができます。</li>
		<li>レトロ ウイルスの構造 (たとえば、MSCV) の 40 μ g、pCL エコ (包装ベクトル)23の 20 μ g、PEI (ポリエチレンイミン) の 80 μ l と減少血清媒体 (例えばオプティ-MEM) 媒体 (抗生物質) なしの 2 mL を組み合わせます。部屋の温度 (RT) で 20 分のこの混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>16 ml の 2% を DMEM Bosc23 細胞中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。 注: トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使わない。</li>
		<li>1.2.2 で混合物を追加します。注意深く、Bosc23 滴文化と 37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性により 6 h 未満までのインキュベーションを制限します。</li>
		<li>インキュベーション後、Bosc23 媒体を 18 mL に変更 10% を含む DMEM を予め加温 FBS、37 ° C で 48 時間のための細胞を養うとバイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。</li>
		<li>50 mL の円錐管に 25 mL の血清ピペットを使用して Bosc23 媒体 (含まれているマウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子) を収集し、4 ° C で保存 注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。</li>
		<li>18 mL 加温 DMEM の 10% を追加 Bosc23 に FBS 細胞し、24 h の育成します。</li>
		<li>1.2.6 のステップを繰り返します。 注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば 1.2.6 1.2.8 からレトロ ウイルス上清をプールできます。</li>
		<li>ウイルス上清中に Bosc23 の汚染を避けるためには、4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピンします。分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、その作りたてのウイルスは凍結する在庫より感染効率の面で高品質。 注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。</li>
	</ol></li>
	<li>レンチ ウイルスの生産
	<ol>
<li>HEK293T (人間の萌芽期の腎臓の 293 t) 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM の 18 mL で育んでいます。 注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。</li>
		<li>15 μ g のプラスミド pCMVdR8.74 (ギャグ/ポル、12 μ g のエンコーディング) をパッケージ化 (pGhU6) などレンチ ウイルスの構造を組み合わせると pMD2.VSVG (VSV G、1.4 μ g のエンコーディング)、85.2 μ L PEI、(抗生物質) なし減少血清培地 2 mL。室温に 20 分間のこの混合物を孵化させなさい</li>
		<li>2 %dmem の 16 ml HEK293T の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。</li>
		<li>慎重に 1.3.2 HEK293T 細胞培養への準備混合物をドロップし、37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性を防ぐために 6 時間以内に潜伏期間を制限します。</li>
		<li>18 mL に変更培地加温 DMEM の 10 %fbs と 37 ° C で 48 時間のための細胞を育成バイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。</li>
		<li>HEK293T 媒体 (含む・ ロープ ・ レンチ ウイルス粒子) 50 mL コニカル チューブに 25 mL の血清ピペットを使用してを収集し、4 ° C で保存 注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。</li>
		<li>慎重に予め温めておいた DMEM の 18 mL を追加し 10% FBS HEK293T 細胞へ。37 ° C で 24 時間を育成します。</li>
		<li>1.3.6 のステップを繰り返します。 注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば、1.3.6 1.3.8 からレンチ ウイルス上清をプールできます。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピン HEK293T 細胞とウイルス上清の汚染を避けるためには、分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、凍結する在庫よりも感染効率の面で高い品質の作りたてのウイルスそれは注意してください。 注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。</li>
	</ol></li>
	<li>GFP レポーターを含むウイルスの滴定
	<ol>
<li>シード DMEM の 300 μ L で 1 × 10 5/NIH 3T3 細胞 10 %24 ウェル プレートによくあたり FBS。7 つの井戸が 1 つのウイルスの力価が適用されます。</li>
		<li>37 ° C でウイルスを解凍し、1、5、10、50、100、500 μ L のウイルスを NIH 3T3/文化に追加します。すべてのウイルスをネガティブ コントロールにも追加しません。37 ° C で 48 時間のウイルスの存在下で細胞を養う</li>
		<li>トリプシン/EDTA (エチレンジアミン四酢酸) の 30 μ L を使用して/NIH 3T3 細胞を収穫 (0.25% トリプシン、PBS で 0.01 %edta) 細胞の FACS (蛍光活性化細胞選別) 管で 250 μ L の PBS の場所と。</li>
		<li>各サンプル24フローサイトメトリーによる GFP+細胞の頻度を決定します。ヘキスト 33258 などの生存性色素の添加により死んだ細胞を除外します。</li>
		<li>(GFP+細胞のめっきされたセルの数と割合に基づく) GFP+のセルの合計数を計算してウイルス感染症用のボリュームに対してそれらをプロットします。 注: (重要) 性感染症はウイルス大量が適用されるときに高原に達する。したがって、どの感染効率が線形の範囲 (例を表 1に示すように) 発生ウイルス濃度に基づいて価を推定することが重要です。GFP+細胞の数は、特定のウイルス量の機能性ウイルス粒子 (TU - 変換ユニット) の数を示します。TU の mL 数を再計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>ピューロマイシン レポーターを含むウイルスの滴定
	<ol>
<li>シード 3 mL DMEM に 5 × 10 4/NIH 3T3 細胞 10 %6 ウェル プレートのウェルあたり FBS6 井戸 1 つのウイルスの力価を採用してください。37 ° C で一晩文化</li>
		<li>次の日は、表 2に示されているようにウイルスを希釈します。ウイルスを希釈に使用して予め温めておいた DMEM 10 %fbs。ボルテックスにかけないでください。</li>
		<li>NIH/3T3 細胞から培養液を外し、希薄ウイルスの 1 つの mL を追加します。</li>
		<li>37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>優しくウイルス含有培地 2 ml に予め温めておいた DMEM の 10% を取り替える政府短期証券、37 ° C で一晩インキュベートし、</li>
		<li>優しく NIH 3T3/媒体を 2 mL に予め温めておいた DMEM 10 %fbs 含むピューロマイシン (2 μ G/ml) に置き換えます。</li>
		<li>37 ° C ・ ピューロマイシン 3 日おきに更新中慎重に、中が黄色の文化。</li>
		<li>感染後 10-12 日、各ウェルから培地を吸引、PBS でやさしく洗浄します。</li>
		<li>クリスタル バイオレット溶液 (0.5% 20% エタノールと dH2O でクリスタル バイオレット)、1 mL で常温では、2 分を汚し、慎重に PBS で 2 回洗います。</li>
		<li>顕微鏡 (倍率 X4) 各ウェルに存在の青いコロニーをカウントします。コロニーを守らなければなりませんない負の制御にも。</li>
		<li>TU/ml の希釈倍率を考慮した数字の合計を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 拡張と 32D/-r-CSF G 細胞の維持
<ol><li>32D/G-CSF-R セルが固定されている場合、因数を取ると雪解けの 1 分の 37 ° C の水浴のセルと直接に 10% に予め温めておいた RPMI 1640 培の 10 mL バイアルから細胞を注ぐ 15 mL チューブに FBS。反転チューブ 3 回し、400 × g にセルをスピンダウンは、上清を除去し、IL 3 0.3 × 106セル/mL の濃度で含まれている培地の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>最適な細胞成長濃度は 0.25 0.5 × 106セル/mL。セルを分割する濃度 0.1 0.2 × 10 にそれらをもたらす 2 日ごと6セル/mL。 注: (重要) 32D/G-CSF-R セルは部分的に 1 × 106セル/mL 以上の濃度に成長した場合を区別するために彼らの能力を失う可能性があります。したがって、時間に 32D/G-CSF-R セルを分割するのに非常に重要です。</li>
	<li>必要に応じて、凍結し、-80 ° c または液体窒素中での時間の長い期間のセル因数を格納します。スピン ・ ダウン 3 × 106細胞培養上清を削除し、凍結培地 1 mL で再懸濁します。-80 ° C で凍結容器にチューブを入れる長期保管のため液体窒素のセルの位置を変更します。</li>
</ol>3. 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達
<ol><li>0.3 × 106セル/mL の濃度で 6 ウェル プレートにプレート 32D/G-CSF-R セルです。</li>
	<li>10 と 40 の間の MOI (感染症の多様性) に到達するウイルスの適切な量を追加します。 注: 高い MOI は興味の遺伝子の発現の高いレベルと同様に、GFP+細胞の増加の割合になります。10; の MOI で 0.3 × 106に感染するには、細胞の例。3 × 106 TU 32D/G-CSF-R セルに追加する必要があります。</li>
	<li>最終濃度 8 μ g/mL に polybrene を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベートまたは、スピン接種手順を実行: スイング バケツ ローターを用いた培養プレートに 30 ° C で 90 分 1200 × g で遠心し、37 ° C で 3 時間インキュベート</li>
	<li>収集細胞は 15 mL チューブに移し、5 分 (4 ° C) 450 × g でスピンします。</li>
	<li>上澄みを廃棄、6 ml の培地の小球形にされた細胞を再懸濁します、37 ° C でコート t25 フラスコ細胞培養用フラスコ、文化が、</li>
	<li>48 時間後に、細胞を収穫し、450 の × g で 5 分 (4 ° C) で、それらをスピンします。上清を捨てます。</li>
	<li>GFP レポーターの場合: 流れの cytometry の選別機を使用して PBS と並べ替えの GFP+セルを 500 μ l 添加にセルを配置します。ベクターを含むピューロマイシン レポーターの場合: 2 μ g/mL ピューロマイシンを含む培養液中の細胞を配置。</li>
	<li>さらなる分析と実験に必要なセルを展開します。 注: (オプション) Transduced セルできます-80 ° C の凍結容器でメディアを凍結で冷凍、さらに液体窒素で保存します。</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R セル拡散の試金
<ol><li>増殖率場所 0.2 × 106細胞培養培地 1 mL を評価し、37 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>次の日はセルの数をカウントし、0.2 × 10 の6セル/mL の培養液を使用しての濃度に戻るそれらを希釈します。37 ° C で一晩インキュベートします。細胞濃度および表 3を使用して毎日文化に適用される希薄の記録を保持します。</li>
	<li>増殖を評価する必要がある日数の 4.2 の手順を繰り返します。 注: 増殖アッセイの長さは、興味の遺伝子の影響に依存します。強い表現型の場合 8-9 日は (参照してください図 3 a) 有意な効果を観察するための十分な可能性があります。ただし、軽度の表現型の場合、時間の長い期間は必要あります。</li>
	<li>表 3に示すように増殖曲線を作る、細胞増殖を評価します。</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R 細胞分化アッセイ
<ol><li>0.2 × 106 32D/G-CSF-R 細胞サイトカインなし RPMI 培地で 2 回洗います。 注: 残留 IL 3 の存在が分化を阻害するので文化への G-CSF の添加前に洗浄のステップは重要です。</li>
	<li>細胞濃度 0.2 × 106セル/mL (0 日目) の結果、24 ウェル/プレートで 1 mL 分化培地 (100 ng/mL、G-CSF を含む) にセルを配置します。37 ° C で一晩文化</li>
	<li>細胞/ml (ステップ 1.2.1) 上記の数をカウントします。</li>
	<li>Cytospin 2 5 × 104セル (76 mm × 26 mm) スライド ガラスに遠心分離機を用いた 20 × g で必要なアダプターです。</li>
	<li>24 ウェル/プレート (1 日) に 0.2 × 105セル/mL の濃度で分化培地とプレート細胞を更新します。古い板を廃棄して続行するステップ 5.6 新しいプレートとの次の日。</li>
	<li>2 に 7 日 5.5 5.3 の手順を繰り返します。手順 4 で説明した G-CSF の存在下で細胞増殖を評価します。 注: (重要) 分化、細胞増殖が遅く、したがって G-CSF の存在下で 3 〜 4 日後より高い濃度で培養細胞に十分です。</li>
	<li>細胞の形態に基づく 32D/-r-CSF G 細胞の分化状態を評価します。<ol>
<li>常温 5 分のメタノールのステップ 5.4 からセルを修正し、風乾するスライドを残します。 注: 0 に 7 日目からスライドすることができます RT に格納されているし、同時に固定します。同様に、彼らも保存できます RT で固定後より長い一定期間のため。</li>
		<li>次の製造元のプロトコルを汚す 5 月グリューンヴァルト ギムザを使用してセルを汚します。</li>
		<li>顕微鏡と X40 の倍率を使用して染色の細胞を可視化します。</li>
		<li>爆発、中間分化した細胞は、および図 1と表 4で説明のイラストを使用して成熟した顆粒球の数を定量化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

実験的なモデルの選択は、研究の主要な課題の 1 つです。主な動物やヒトの細胞は、最も生物学的に関連するデータを生成すると考えられている、これらのモデル倫理的な問題を伴うことがあります、高価なまたは洗練された養殖/分離のプロシージャに関連付けられていることが多い。一次電池の数は限られて、それらは遺伝的に操作するは難しい。さらに、一次電池はデータ解釈29を複雑にする可能性がありますさまざまなセルタイプの構成異種集団を表します。対照的に、細胞生物材料の事実上無制限のソースを提供する、費用対効果、倫理的な問題を回避することができます。しかし、そのセルの行は、遺伝子と表現型に起源のティッシュとは異なる人工実験システムと見なされますを考慮する重要です。それにもかかわらず、細胞実験の他のアプローチと組み合わせれば、再現性と生物学的関連性の高いデータの世代の貴重なモデルを提供します。
32D/G-CSF-R セルラインとして 32D cl 3 セル、実績のあるし、広くマウス好中球分化14,</...

造血幹・前駆細胞の人口の成熟細胞は、骨髄系 (好中球、好酸球、好塩基球、単球) から細胞を含む広い範囲から有機物を供給します。造血幹細胞の骨髄系細胞の生産を運転するプロセスはイエウサギと呼ばれ、十分な生産要求の変化への応答で成熟した骨髄系細胞がストレスと生物の適切な対処のための前提条件感染症や出血量などの条件。成熟した骨髄系細胞の分泌不足は、病原体、減らされた血凝固および他の生命にかかわる条件1,の2を除去する無力をもたらすかもしれない。さらに、骨髄系開発の変化が急性骨髄性白血病 (AML)3などの造血器腫瘍に関連付けられてあります。細胞表面の受容器4、トランスクリプション要因5の変更された式の欠陥障害シグナリング経路6形成の突然変異のように、様々 な理由によってイエウサギの変化が発生する/遺伝子7、または8腫瘍サプレッサーの遺伝子の不活化の活性化。
様々 な方法は、骨髄性の開発を研究し、このプロセスで特定の遺伝子変異の影響評価開発されています。イエウサギを研究するために使用する一般的なアプローチは、初代培養細胞およびトランスジェニック マウスを含みます。これらのモデルは、生物学的関連性の高いデータの取得を許可する、しかし彼らは特定の制限があります。一次電池の使用細胞の限られた数および遺伝子発現とその後の生物学的または生化学的な分析を変更する可能性を絞り込む、文化の制限期間が発生します。トランスジェニック マウスは高価であり、生物学的正当性の合理的な程度を必要とします。さらに、体内モデルでの作業は、特定のプロセスの興味の遺伝子の役割を理解することの複雑さの程度を追加します。したがって、これらの制限を回避するために代替的なアプローチが必要です。細胞は疑う余地のない利点を持っている: (1) 彼らは生化学的・生物学的研究のための十分な材料を生成することができます無制限の増殖能力を持っている、(2) 彼らは (ノックダウン、ノックアウト、遺伝子操作を受けやすい過剰発現)、(3) コストは比較的低く、(4) 彼らは特定の実験的アプローチに必要な生物学的簡素化の程度を許可します。
親の IL 3 (インターロイキン-3) 依存 32D セルライン グリーンバーガーおよび同僚によって、友人マウス白血病ウイルス9C3h/hej マウス骨髄細胞の感染によって 1983 年に設立されました。いくつか 32D クローンは文献で記述されていた: cl 239cl 3 の10、および cl 1011。32D cl 3 細胞は IL 3 に増殖し、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)10の治療に好中球に分化する示されていた。それどころか、もともとは G-CSF の治療に反応ながら IL 3 依存 32D の cl-10 セルを区別することがないです。1995 年に博士 Ivo Touw のグループは、この受容体11の機能的に重要な領域を識別するために野生型と G-CSF 受容体 (G CSF R) の変異形 32D の cl-10 セルを遺伝子導入。本研究により IL 3 に同様に依存している、32D/G-CSF-R のセルの生成が、細胞が増殖、成熟好中球に分化する不可逆的停止 g-csf IL 3 の交換後 6 ~ 10 日以内。これらの特性は、32D cl 3 と 32D/G-CSF-R セル 2 つの明確に定義された成長と分化因子 - IL 3 と G-CSF によって変調することができますマウスの好中球分化の簡略化モデルを作る。最後の十年の間に複数のグループは、文化12,13,14,15骨髄細胞の分化と増殖における特定の遺伝子の役割を研究するのに 32D/G-CSF-R セルを使用しています。,16、G-CSF シグナル17,18を検討します。重要なは、この細胞ラインを使用して得られた結果は、初代培養細胞およびトランスジェニック マウス16,19,20,21で得られるデータと相関。したがって、この問題に対処する他の方法と並行して使用することができます骨髄性の微分を調査する貴重なシステムを表す 32D/G-CSF-R セル、広く使用され、確立されたモデルであると考えます。
ここでは、32D/G-CSF-R セル行の処理を説明する詳細なプロトコル、どのカバー拡大、分化およびこれらの細胞の分化・増殖の評価が表示されます。32D/-r-CSF G 細胞の遺伝の変更の詳細については、ウイルスの滴定のためのプロトコルと同様に、レトロ ウイルスやレンチ ウイルスの伝達によっていずれかが提供されます。また、32D/-r-CSF G 細胞の潜在的なアプリケーションを示すいくつかの代表的な結果が提供されます。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 粉末培地</td><td>メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国</td><td>T 121-10</td><td>NaHCO3 なし、L-グルタミン付き</td></tr><tr><td>DMEM サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、米国</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、米国</td><td>31985-047</td><td>L-グルタミン、フェノールレッド</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>PAA Laboratories (GE Healthcare、シカゴ、イリノイ州、米国)</td><td>MT35011CV</td><td>32D/G-CSF-R細胞の分化用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、米国</td><td>10270</td><td>HEK293T、NIH3T3、BOSC23細胞の培養に使用</td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>シグマ-アルドリッチ(メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>Sigma-アルドリッチ(メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国)</td><td>S9137</td><td>ストレプトマイシン硫酸塩粉末</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>ヒト G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth,ニュージャージー州、米国)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>VWR ケミカルズ、ペンシルバニア州ラドナー、米国</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ アルドリッチ (米国ニュージャージー州ケニルワース、メルク)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>クリスタル バイオレット</td><td>シグマ アルドリッチ (ニュージャージー州メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>シグマ アルドリッチ (米国、ニュージャージー州ケニルワース、米国)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich(Merck、Kenilworth、NJ、USA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml;nwald Giemsa</td><td>DiaPath、Martinengo、BG、イタリア</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス骨髄前駆体 32d/g-csf-r の増殖・分化細胞

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

造血幹・前駆細胞の生物学の理解では、再生医療と血液病理の治療にとって重要な意味を持ってください。生体内でモデルや初代培養を使用して得ることができる最も関連性の高いデータ、にもかかわらず造血幹・前駆細胞の低豊富はかなり彼らの調査のための適切な技術のプールを制限します。したがって、細胞の使用は、上映または大規模な細胞数を必要とする試金のパフォーマンスのための生物材料の十分な生産できます。ここで詳細な説明、読み出し、イエウサギと好中球の分化に関与するプロセスの調査のために使用されている増殖・分化アッセイの解釈を提案します。これらの実験は、IL 3 存在下で増殖し、G-CSF で区別する能力を持って 32D/G-CSF-R サイトカイン依存マウス骨髄細胞ラインを採用しています。32D/G-CSF-R セルを処理するためのプロトコルを最適化を提供し、議論する主要な落とし穴とデメリット説明アッセイと予想される結果を危険にさらす可能性があります。さらに、この資料には、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの生産、滴定、および 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達のためのプロトコルが含まれています。機能分子研究一次造血幹・前駆細胞や生体内でモデルで得られた結果を補完することができますを正常に実行するこれらの細胞の遺伝的操作を用いることができることを示す.

32D/-r-CSF G 細胞の増殖と分化
32D/G-CSF-R pro 増殖とプロの分化条件下で細胞の増殖を評価するために IL 3、G-CSF をそれぞれ含んでいる媒体で 32D/-r-CSF G 細胞を培養されました。IL 3 含む媒体 (10 ng/mL) で培養された細胞分割 (図 2 a) すべて 24 h 約であることが観察されました。徐々 に減速し、4 日 (図 2 a) 後停止の G-CSF (100 ng/mL) 増殖と IL 3 の交換に。さらに、5 月グリューンヴァルト ギムザ染色サイトスピン細胞を用いた G-CSF の存在下で培養された細胞の分化状態を評価しました。前日に 0 (G-CSF の治療の開始)、細胞提示未熟な骨髄芽球のような形状、大きな核と暗い細胞質 (図 2...

ここでマウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R 細胞株を培養、ウイルス感染および増殖と分化アッセイを行う目的として詳細なプロトコルが表示されます。この細胞株は、骨髄性細胞と骨髄細胞の増殖および好中球分化の興味の遺伝子の役割を勉強に適しています。

マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

この実験の全体的な目的は、目的遺伝子の過剰発現またはサイレンシングによってマウス骨髄系32D-G-CSF-R細胞を遺伝的に改変し、これらの変化が細胞株の増殖および好中球分化に及ぼす影響を決定することです。この手法は、目的のタンパク質が骨髄系前駆細胞の増殖および分化にどのように関与しているかなど、血液学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この細胞株の主な利点は、無限の増殖能を持ち、遺伝子操作が容易であり、コストが比較的低く、特定の実験的アプローチに必要とされるある程度の生物学的簡略化が可能であることです。本日の手順の実演は、私の研究室の博士課程学生であるPetr Danekが行います。熱不活化10%胎児牛血清および10 ng/mLのマウスinterleukin-3を添加したRPMI-1640培地を250 mL調製します。次に、分化培地を50 mL調製します。16 cmのペトリ皿に、10%胎児牛血清を添加した18 mLのDMEM培地を用い、Bosc23細胞の単一細胞懸濁液を播種します。コンフルエンシーが80%に達するまで、約24時間培養します。次に、MSCVレトロウイルス構築物、PCL-echoパッケージングベクター、ポリエチレンイミン、および抗生物質を含まない低血清培地を混合します。この混合液をFlowbox内で室温にて20分間インキュベートします。その後、Bosc23細胞の培養液を、37 °Cに保温した2%胎児牛血清添加DMEM培地16 mLに注意深く置換します。続いて、レトロウイルス混合液をBosc23細胞に滴下して加えます。その後、培養液を37 °Cで4時間インキュベートします。インキュベーション終了後、Bosc23培地を吸引し、10%胎児牛血清を含む予熱したDMEM培地を18 milliliters添加します。細胞を37 degrees Celsiusで48時間インキュベートします。25 milliliterセロロジカルピペットを用いて、Bosc23ウイルス含有培地を50 milliliterコニカルチューブに回収します。チューブを4 degrees Celsiusで保存します。その後、Bosc23細胞に10%胎児牛血清を含む予熱したDMEM培地を18 milliliters添加し、細胞を24時間培養します。 ウイルス含有上清を 4 °C で 1,500 ×g、10 分間遠心分離します。その後、ウイルスを分注し、液体窒素で急凍結させて -80 °C で保存します。 6ウェルプレートの各ウェルに、10%胎児牛血清を添加した3mLのDMEM培地を用いて、ウイルス力価測定用のNIH/3T3細胞を播種します。細胞を37°Cで一晩培養します。翌日、ウイルス粒子をボルテックスせずに、あらかじめ温めておいた培地でウイルスを希釈します。NIH/3T3細胞から培養液を吸引し、各ウェルに希釈ウイルス液を1mLずつ加えます。37°Cで一晩インキュベートします。翌日、希釈ウイルス培地を慎重に吸引し、10%胎児牛血清を含む2mLのDMEM培地と交換し、再び37°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、古い培地を吸引し、2µg/mLのピューロマイシンを含むDMEM培地と交換します。3日ごとに、または培地が黄色に変化した際に、ピューロマイシンを含む新鮮な培地を補充して培養を継続します。感染後10日から12日の間に、ウェルから培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水で静かに洗浄します。次に、1 mLのクリスタルバイオレット溶液を用いて室温で2分間染色します。染色後、リン酸緩衝生理食塩水で注意深く2回洗浄します。顕微鏡下で、各ウェルに存在する青色コロニーの総数をカウントします。32D-G-CSF-R細胞を6ウェルプレートに播種します。感染多重度（MOI）10から40でウイルスを添加します。次に、細胞にポリブレンを最終濃度8 µg/mLとなるように添加し、37 °Cで6時間インキュベートします。インキュベート後、細胞を15 mLチューブに回収し、4 °Cで450 ×gにて5分間遠心分離します。32D細胞は、1 × 10⁶ cells/mLを超える濃度で培養すると分化能を部分的に喪失する場合があるため、適切なタイミングで細胞を継代し、過成長させないことが非常に重要です。上清を捨て、熱不活化10%胎児牛血清および10 ng/mLのマウスインターロイキン-3を添加した6 mLのRPMI-1640培地を含むT25培養フラスコに細胞を再懸濁する。細胞を37 °Cで48時間インキュベートする。サイトカインを含まないRPMI-1640培地で32D-G-CSF-R細胞を2回洗浄します。次に、0日目に24ウェルプレートの各ウェルに分化培地1 mLとともに細胞を播種し、37 °Cで一晩インキュベートします。細胞が成熟顆粒球に分化するまで7〜9日かかります。その後、トリパンブルーを用いて死細胞を除外し、細胞数を計測します。IL-3は分化過程を抑制する可能性があるため、細胞をGCSFで培養する前に、このサイトカインの痕跡を完全に除去することが極めて重要です。適切なアダプターを装着した遠心分離機を用いて、細胞をガラススライド上に20 ×gで5分間サイトスピンします。次に、室温でメタノールを用いて細胞を5分間固定し、乾燥させます。製造元のプロトコルに従い、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色を用いて細胞を染色します。染色後、染色された細胞を40倍の倍率で観察します。細胞形態に基づき、染色された細胞中の芽球、中間分化細胞、および成熟顆粒球の数を定量します。ここでは、interleukin-3および顆粒球コロニー刺激因子を含む培地における32D-G-CSF-R細胞の増殖を示すグラフを示します。x軸は処理日数、y軸は対数スケールでの細胞数 representsしています。黒色のプロットは、細胞をinterleukin-3含有培地で培養したときの増殖を示しています。青色のプロットは、顆粒球コロニー刺激因子含有培地で培養したときの細胞増殖の低下を示しています。ここでは、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有培地における32D-G-CSF-R細胞の割合と分化形態を示す代表的な円グラフおよびMay-Grunwald Giemsa染色像を示します。円グラフは、G-CSF処理後0日、2日、4日、および6日における芽細胞、中間分化細胞、および好中球の割合を示しています。0日目のGiemsa染色細胞は、特徴的な大きな核と暗い細胞質を有しています。6日目には、核のサイズが縮小し、細胞質は拡大していますが、暗くはありません。ここでは、顆粒球コロニー刺激因子を含む培地において、コントロールMSCVベクターと比較してBCR-ABL融合タンパク質を導入した際に芽球の割合が高くなることを示す代表的な円グラフを示しています。下パネルのギムザ染色は、コントロールまたはBCR-ABL融合タンパク質を導入した際の細胞の代表例です。MSCVコントロールベクターを導入した細胞は6日目に好中球への分化が認められましたが、BCR-ABLを導入した細胞はほとんどが芽球であり、成熟好中球は見られませんでした。この手法に習熟すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。この手順を行う際は、指示された濃度で32D-G-CSF受容体細胞を培養することを忘れないでください。本手順に続き、さらなる疑問を解消するために、遊走アッセイや生存実験などの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、レンチウイルスおよびレトロウイルス導入による遺伝子操作、拡大培養、分化、ならびにこれらの細胞の増殖と分化の評価を含む、32D-G-CSF受容体細胞株の取り扱い方法について十分に理解できるはずです。ウイルスを扱う際は危険が伴うため、本手順の実施中は、常に手袋や保護メガネの着用などの予防策を講じることを忘れないでください。

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

JoVE Journal

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学ぶマウス骨髄前駆体32D/G-CSF-R細胞の培養と遺伝子改変による増殖・分化解析の手法。ウイルス感染とアッセイを用いて骨髄球の発生機構を解明し、血液学研究に貢献します。

マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞

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