Name: 時間経過、ラベル無料、定量的相休眠とアクティブなひと癌細胞のイメージング研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶ定量的位相イメージング法によるヒト骨肉腫細胞の形態・増殖・運動性の同時解析。休眠状態と活性化状態のがん細胞表現型を定量的に評価し、腫瘍進行メカニズムの解明に貢献する。

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作者は感謝して乳房がん研究振興財団と高度な医療研究財団のサポートを認めます。

ここで説明したすべてのメソッドは、ボストン子供病院制度バイオ セーフティ委員会によって承認されています。
1. セル準備
<ol><li>
KHOS A を融解し、-n 個のセル
	<ol>
<li>ウォーム アップ培地、すなわち、ダルベッコ修飾イーグル培 10% (巻/巻) 牛胎児血清 (FBS) と 1% (巻/巻) ペニシリン/ストレプトマイシン。</li>
		<li>液体窒素タンクからセルのセラム チューブを取る、暖かい水 37 ° C の水浴中にバイアルの底を浸し、解凍処理を加速するセラム チューブを軽く振る。汚染を避けるために水へのお問い合わせからセラム チューブのふたを保ちます。細胞を解凍すると、すぐに、70% エタノール溶液を噴霧し、バイアルを拭く、セラムを滅菌します。</li>
		<li>層流フードの極低温バイアルから細胞懸濁液をすぐに吸引し、優しく温めて 10 mL 培養液 (1.1.1 で説明) で中断します。5-7 分の約 200 x g で細胞を懸濁液を遠心します。</li>
		<li>培地 10 mL を温めて、細胞ペレットを再懸濁します、T75 フラスコに移します。軽く均等に 10 mL のピペットを使用してセルを中断する数回をピペットします。</li>
		<li>5% (巻/巻) CO2と加湿雰囲気 37 ° C の定温器にフラスコを配置します。細胞の少なくとも 12 時間の接続を許可します。</li>
		<li>80-100% 合流まで約 3-7 日間細胞を孵化させなさい。2-3 日毎の培養培地を変更します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
KHOS A を分割し、-n 個のセル
	<ol>
<li>フラスコから文化メディアを削除します。</li>
		<li>洗浄 5 mL 滅菌 PBS のセル (1 x) カルシウムとマグネシウム、非付着性のセルまたは分数を削除するなし。</li>
		<li>フラスコ、1 mL 0.05% トリプシン EDTA 溶液を追加し、簡単にトリプシン-EDTA が均等に分散されるようにフラスコを旋回します。</li>
		<li>37 ° C の定温器で 2 〜 3 分または室温で 3-5 分のフラスコを孵化させなさい。セルは切り上げし、切り離されたことを確認する約 400 倍の倍率での顕微鏡の下のセルを確認します。</li>
		<li>セルを取り外したら、一度培地 10 mL を追加し、そっとピペット 10 mL のピペットを使用して単一細胞懸濁液に細胞集塊を破るために数回上下中。</li>
		<li>細胞カウンターを使用してセルをカウントします。2 × 10 の6セルの密度または 1:4 の比率で新しい T75 フラスコに細胞懸濁液をシードします。</li>
		<li>QPI 実験のため播種する前に 80-100% の合流点に成長する細胞を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
KHOS A シードと QPI の - n 個のセル
	<ol>
<li>シード KHOS A とセル カウンター カウント後培地 5 mL を 50,000 300,000 細胞/ウェルの密度で 6 ウェル プレートで - n 個のセル。 注: 播種密度は細胞増殖率およびイメージングの期間に依存するために < 100% 取得、イメージング中に合流。</li>
		<li>添付ファイルを許可するように少なくとも 12 時間のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>QPI を行う前に新鮮なメディア媒体を変更します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QPI 買収
<ol><li>
カバー スリップを設定
	<ol>
<li>脱イオン水を実行して数回の洗浄によってカバー スリップをきれいにし、カバー スリップを入れ乾燥滅菌層流フード 15 分の浸漬で 75% エタノール溶液で消毒します。</li>
		<li>明白な泡を避けるために 6 ウェル プレート カバー スリップを慎重に配置します。カバー スリップの下が文化メディア (最小 5 mL/ウェル) に没頭していることを確認します。</li>
		<li>(37 ° C、5% CO2、および加湿雰囲気) 少なくとも 15 分平衡にインキュベーターにプレートを配置します。カバー スリップ上に霧を形成、それをきれいに拭くため滅菌綿棒を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
顕微鏡で細胞のイメージング
	<ol>
<li>露出時間、パターン コントラスト、およびホログラム ノイズの自己校正を含むシステムを初期化するソフトウェアを開きます。値が許容される (緑または黄色の範囲で表示) を確認します。</li>
		<li>QPI 顕微鏡のステージ上に 6 ウェル プレートを配置します。</li>
		<li>「Live Capture"をクリックしてし「ソフトウェア フォーカス」で「手動」を選択「顕微鏡の設定」の作業距離を調整することによって細胞の位相画像を粗く集中位相画像のセルのアウトラインを取得しますします。「ソフトウェア フォーカス」で、「自動」に変更します。</li>
		<li>「新しい実験」をクリックして新しいテストを作成します。テンキー、マウスまたは矢印キーを使用してイメージの取得位置の選択を開始します。各選択した後「保存」をクリックします。通常の各サンプルに対して 3-5 場所が選択されます。</li>
		<li>「タイムラプス」セクションのイメージの間隔と期間を設定します。 注: がん細胞を明確に追跡するには、間隔が 5 分 48 時間は組み合わせ QPI 分析の期間として設定より短いでする必要があります。</li>
		<li>「キャプチャ」をクリックして自動的に焦点を当て、設定の時点で画像を取得する実験を開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>
細胞の形態解析
	<ol>
<li>「細胞を識別」をクリックバック グラウンド ノイズからのセル領域が分離できるように、「背景のしきい値」の数値の設定を調整します。「オブジェクト サイズ」の設定数を調整それぞれセルに 1 つの核を確認しますします。比較する必要がある最終的な面積と体積の測定に影響を与える可能性がありますこれらのサンプルのための一貫したパラメーターを維持します。手動で必要な場合、「手動で変更、」を使用して、セル セグメントを変更します。</li>
		<li>ソフトウェアの「データの分析」関数を使用して、セル分析。「新分析」をクリックしてして新しいデータ解析をを開始します。セル領域 (2μ m)、光学膜厚 (μ m)、ボリューム (μ3) すべての個々 のセルに対してなど「ソース フレーム」タブと細胞形態のパラメーターに選択した画像をドラッグします。表や図としての散布図のプロットやヒストグラム モードとエクスポート データを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞増殖の解析
	<ol>
<li>(例えば初期、12 h、24 h、36 h、および 48 h) 興味の別の時間ポイントの少なくとも 5 枚の画像を選択します。ソフトウェアによって提供されるレコードの携帯番号。</li>
		<li>倍加時間を推定するには、初期の番号の正規化後細胞数をプロットし、指数関数的成長曲線にフィットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞運動解析
	<ol>
<li>ソフトウェアの「細胞を追跡する」関数を使用します。「新分析」をクリックして新しいデータ分析を開始します。(例えば、24 時間培養後 4 h)、「ソース フレーム」タブに選択した時間帯のイメージのドラッグ シリーズ ランダムに「セルを追加」選択モード下のセルをクリックしてして 10-30 セルを選択します。エッジとそれらのビューのフィールドの外に移動セルを除外します。</li>
		<li>一連の画像でトラッキングを入念にチェックします。システムはセルのトラックを失うまたは誤ったセルを追跡、こと手動でセルの位置を変更するのには「選択」モードの下で追跡携帯を調整細胞を識別するために「識別する」をクリックするか、「場所の変更」をクリック。</li>
		<li>「プロット運動」におけるセル軌道バラ プロットまたは移行率直さ、移行 (μ m) (μ m) の運動運動速度 (μ m/h) などの「印刷機能」で、そのほかの運動関連パラメーターのプロットを選択します。データを表や図としてエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li>
<li>Harper, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tumor+angiogenesis%3A+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications.</a> EXS. (96), 223-268 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+tumor+dormancy%3A+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).</li>
<li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-2+is+required+for+the+switch+to+the+angiogenic+phenotype+in+a+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+switch+of+dormant+tumors+to+fast-growing+angiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype.</a> Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signature+for+angiogenic+and+nonangiogenic+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).</li>
<li>Harper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+the+zinc+finger+transcription+factor+ZNF24%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24.</a> Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+of+VEGF+by+ZNF24%3A+mechanistic+studies+and+vascular+consequences+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo.</a> Blood. 121 (4), 707-715 (2013).</li>
<li>Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+zinc+finger+transcription+factor%2C+ZNF24%2C+modulates+the+angiogenic+potential+of+human+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+dormancy+of+human+liposarcoma+is+associated+with+impaired+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+micro+RNAs+governing+the+switch+of+dormant+tumors+to+the+fast-growing+angiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype.</a> PloS One. 7 (8), e44001(2012).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PloS One. 7 (9), e44395(2012).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+induced+by+the+tumor+dormancy-associated+microRNA-190%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190.</a> Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).</li>
<li>Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+control+the+angiogenic+switch+in+mouse+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis.</a> Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+angiogenesis+during+the+transition+from+hyperplasia+to+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.</a> Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).</li>
<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopescu%2C+G+%22Quantitative+phase+imaging+of+cells+and+tissues%22">Quantitative phase imaging of cells and tissues</a>. , McGraw-Hill: New York. (2011).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Phase+Imaging+Techniques+for+the+Study+of+Cell+Pathophysiology%3A+From+Principles+to+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications.</a> Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).</li>
<li>Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Phase+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Phase Imaging.</a> Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).</li>
<li>Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptychography--a+label+free%2C+high-contrast+imaging+technique+for+live+cells+using+quantitative+phase+information%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information.</a> Scientific Reports. 3, 2369(2013).</li>
<li>Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+holographic+microscopy+for+non-invasive+monitoring+of+cell+cycle+arrest+in+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells.</a> PloS One. 9 (9), e106546(2014).</li>
<li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dormant+and+active+human+cancer+cells+by+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Advancement+of+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PloS One. 9 (2), e89000(2014).</li>
<li>Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+testing+at+the+single+cell+level+using+quantitative+phase+and+amplitude+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+red+blood+cell+mechanics+during+morphological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).</li>
<li>Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+blood+testing+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real time blood testing using quantitative phase imaging.</a> PloS One. 8 (2), e55676(2013).</li>
<li>Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+prostate+cancer+recurrence+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9976(2015).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+surface+area+and+deformability+of+individual+human+red+blood+cells+over+blood+storage+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 6, 34257(2016).</li>
<li>Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-mechanical+signatures+of+cancer+cells+based+on+fluctuation+profiles+measured+by+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry.</a> Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

本研究生体外で、非侵襲的、無料のラベルを用いた QPI ひと骨肉腫細胞の血管新生と血管新生以外の表現型を特徴づける定量的をについて説明します。増殖率、倍加時間、移行の率直さ、運動速度、移行と運動細胞容積、セル厚セル領域を含むこの統合、ハイスループット法による細胞の複数のパラメーターを同時に分析されています。
細胞の形態や細胞の挙動を評価する従来法と比較して, このメソッドだけでなく、時間と労力を節約できますより正確で詳細な情報も提供します。たとえば、QPI システム (セル インキュベーター) 内の場所は、周囲環境 (部屋の温度と雰囲気)23で撮影するなどの環境変化から障害を低減します。さらに、光学セル厚及び位相シフトから変換されたボリュームを取得でした QPI とセル領域のみが伝統的な細胞イメージング プロセスによって測定される一方。QPI のこの機能は、異なる細胞の表現型の量的な比較のためのより詳細な情報を生成します。
興味のセルの適切な播種密度は現在の方法...

開発・進行固形腫瘍の初期のチェックポイントの 1 つは、血管新生形質、がんの特徴の習得です。この進行には、様々 な生化学的・分子過程1,2,3が含まれます。腫瘍の進行のこの重要なステップにおける技術的な課題は、継続的かつ定量的評価し、公平な方法で生きているがん細胞の血管新生と血管新生以外の表現型を区別するためのツールの欠如です。通常血管新生と非血管新生細胞の細胞の挙動を調査するために使用されている伝統的な試金は高価な試薬・機器を必要とする、たとえば、細胞増殖・遊走アッセイ4,5、 6,7,8,9,10、11,12,13,14か高い専門性と集中を必要とすると同様に相補的な生体内評価4,5,6,8,15,16、時間と労働消費。
最近では、定量位相イメージング (QPI) は、様々 な細胞形態および動作パラメーター17,18,19,の時間経過およびラベリング無料評価を可能にする手法として浮上しています。20,21,22. 従来の光学顕微鏡とは異なり QPI を定量化位相差画素ごとのバリエーション光、光物体を通り抜けるし、変換の光学的厚さとボリューム、自筆を再構築後、直通ができ生きているセル、次の機能の解析: (4) 同時多重パラメーター イメージング (3) ラベル無料画像、(2) 非侵襲とタイムラプス イメージング (1) 定量的イメージング。これらの機能は、QPI に評価し、細胞レベルで病態を理解するための強力なツールを作る。
最近の研究で我々 は定量的評価し、血管新生を区別する QPI を利用 KHOS A および体系的かつ定量的に、細胞形態の分析を組み合わせることでひと骨肉腫細胞の非血管新生 KHOS N の表現型増殖、および運動23。血管新生と血管新生以外のひと骨肉腫細胞の細胞形態および行動のパラメーターを比較した定量的画像解析ソフト、パネルを使用して、5 つの特徴的な違いは、これらの 2 つの識別されました。表現型。この手法は、さまざまな生物学的に関連する細胞の特性を評価するため統合と定量的なプラットフォームを提供します。

<table><tbody><tr><td>T75フラスコ</td><td>コーニング、ニューヨーク、米国</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート&nbsp;</td><td>コーニング、ニューヨーク、米国</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'Thermo</td> <td>Fisher Scientific, MA, USA</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)&nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals, GA, USA</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Z1 Coulter counter</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>Z1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HoloMonitor M4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>M4</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Hololid</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>PHI 8020</td><td></td></tr><tr><td>HStudioM4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>HStudioM4</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

時間経過、ラベル無料、定量的相休眠とアクティブなひと癌細胞のイメージング研究

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

血管新生形質の獲得は腫瘍休眠からの脱出の重要なコンポーネントです。これらのメソッドは時間を調査し、非血管新生と血管新生細胞の表現型を特徴付けるいくつかのクラシックの in vitroアッセイ (例えば増殖、移行、および他の人) と体内のモデルが開発されているが労働集約的なと、多くの場合高価な試薬、機器と専門的な技術を必要とします。最近の研究で血管新生と血管新生以外のひと骨肉腫 KHOS 細胞の時間経過およびラベリング-無料の特徴づけを行う新規定量位相イメージング (QPI) を使用しました。細胞の形態・増殖・運動を含む携帯電話のパラメーターのパネルは、定量的に測定したし、QPI を用いています。この小説と定量的アプローチは、継続的に、非侵襲的シンプルで統一された方法で関連する細胞プロセス、動作、およびがん細胞の特性および他の細胞型を勉強する機会を提供します。このレポートでは、セルの準備、QPI 集録、データ分析など当社の実験プロトコルについて説明します。

図 1は、典型的な細胞形態特性を示しています。画像は、ホログラフィー (図 1 aB) と 2次元画像 (図 1D) として掲載されています。(屈折率と光路長から計算) 光学セルの厚さは線またはセル全体の測定で定量化しました。散布図の面積と厚み KHOS A と図 1E-g、これらの 2 つの表現型が異なる分布を表示されるように、セル全体を測定 KHOS N セルがプロットされました。ヒストグラム (図 1 HM) またはエクスポートされたファイルからの平均の数字を示した KHOS A 細胞細胞領域が小さいと KHOS N 細胞より大きい厚さが...

休止状態とアクティブな癌細胞の表現型は、定量的な位相画像を用いた特徴付けられました。細胞の増殖、移行、および形態の試金を統合し、1 つの単純な方法で分析します。

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

この実験の全体的な目標は、細胞の形態、増殖、および運動性の分析を組み合わせて、体系的な方法でヒト骨肉腫細胞の血管新生および非血管新生表現型を定量的に特徴付けることです。この方法は、ヒトのがんの確立と進行に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。特に、腫瘍休眠からの脱出と内因性スイッチ。この手法の主な利点は、この統合された高拡散法により、多細胞パラメータを同時に分析できることです。これには、細胞面積、細胞の厚さ、細胞体積、増殖速度、倍加時間、運動速度、遊走、および運動性が含まれます。まず、培地を水浴で摂氏37度に予温します。次に、血管新生および非血管新生ヒト骨肉腫細胞の極低温バイアルを液体窒素タンクから取り出します。バイアルの底を摂氏37度の水浴に浸し、極低温バイアルを静かに振って解凍プロセスを加速します。細胞が解凍されたらすぐに、バイアルに70%エタノールをスプレーし、バイアルを拭いて滅菌します。次に、バイアルから細胞懸濁液を直ちに吸引し、10ミリリットルの温めた培地に穏やかに懸濁します。次に、細胞懸濁液を5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。フードに戻り、上清を取り除き、温めた培地10ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液をT75フラスコに移します。細胞懸濁液を数回静かにピペットで動かして、細胞を均一に分散させます。フラスコをインキュベーターに入れ、細胞を少なくとも12時間付着させます。培地は2〜3日ごとに交換してください。細胞が80〜100%のコンフルエントに達したら、フラスコから培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を洗浄します。次に、0.25%トリップソンEDTA溶液1ミリリットルをフラスコに加え、フラスコを短時間攪拌します。フラスコを2〜3分間インキュベートしてから、顕微鏡で細胞をチェックし、細胞が丸められて分離していることを確認します。細胞が剥離したら、ピペットを使用して10ミリリットルの培養培地を追加し、培地を数回ゆっくりと上下させて、残っている細胞凝集体を分解します。細胞を数えた後、200万個の細胞を新しいT75フラスコに播種します。フラスコをインキュベーターに入れ、細胞を80〜100%のコンフルエンスまで成長させてから、定量的位相イメージング実験のために細胞を播種します。トリプソン消化によって細胞を収穫し、ウェルあたり50, 000〜300, 000細胞の密度で6つのウェルプレートに血管新生および非血管新生ヒト骨肉腫細胞を播種します。細胞を合計5ミリリットルの培地で覆います。その後、プレートを少なくとも12時間インキュベートして、細胞が付着する時間を確保します。イメージングする前に、メディアを新しいメディアと交換してください。カバースリップは、流す脱イオン水で数回すすいで清掃します。次に、75%エタノール溶液に15分間浸します。滅菌したカバースリップを層流フードに入れて乾かします。次に、カバースリップを6ウェルプレートに慎重に置き、明らかな気泡を避けます。プレートをインキュベーターに入れて、少なくとも15分間平衡化します。プレートの蓋に霧が発生した場合は、イメージングする前に滅菌綿棒を使用してきれいに拭いてください。定量位相イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化します。露光時間、パターンコントラスト、ホログラムノイズのセルフキャリブレーションで値が許容できることを確認してください。次に、6ウェルプレートを定量位相像顕微鏡のステージに置きます。ソフトウェアに戻り、[ライブキャプチャ]をクリックします。次に、ソフトウェアのフォーカスメニューに移動し、[手動]を選択します。次に、顕微鏡設定メニューに移動し、作業距離を調整して細胞の位相像に粗く焦点を合わせ、位相像の細胞の輪郭を取得します。終了したら、ソフトウェアのフォーカスメニューに戻り、フォーカス設定を自動に変更します。次に、新しい実験をクリックします。マウスまたはテンキーの矢印キーを使用して、画像取得位置の選択を開始します。各選択の後に [記憶] をクリックします。すべての位置を選択したら、タイムラプスセクションに移動し、イメージング間隔を5分未満で合計時間が48時間になるように設定します。[キャプチャ] をクリックして実験を開始します。これにより、各インターバル時間ポイントで選択した位置に自動的に焦点を合わせ、画像を取得します。画像取得に続いて、最初に[Identify cells]をクリックして細胞の形態を解析します。背景しきい値の数値設定を調整して、セル領域が背景ノイズから十分に分離されるようにします。次に、オブジェクトサイズの設定数を調整して、各セルの核が1つだけになるようにします。この要件に一致しないセル セグメントは、手動変更を使用して手動で変更します。次に、ソフトウェアのデータ解析機能を使用して細胞を分析します。新しい分析をクリックして、新しいデータ分析を開始します。選択した画像をソースフレームタブにドラッグし、セルの面積、光学的厚さ、個々のセルの体積など、セルの形態パラメータを記録します。終了したら、散布図またはヒストグラム モードを選択し、データをテーブルまたは図としてエクスポートします。12時間間隔で少なくとも5つの画像を選択し、ソフトウェアによって提供されるセル番号を記録します。初期細胞数で正規化し、細胞数をプロットすることにより、細胞の増殖速度を推定します。最後に、指数関数的成長曲線を使用してデータポイントを適合させることにより、倍増時間を推定します。細胞の動きを解析するには、ソフトウェアのトラックセル機能を使用します。まず、新しい分析をクリックして、新しいデータ分析を開始します。次に、対象の期間から一連の画像をソースフレームタブにドラッグします。次に、セルの追加選択モードで、10〜30個のセルをクリックしてランダムに選択します。一連の画像のトラッキングを必ず確認してください。システムがセルの追跡を見失った場合、または間違ったセルを追跡した場合は、[識別]をクリックしてセルを識別するか、選択モードに移動して[位置の変更]をクリックしてセルの位置を変更して、追跡セルを手動で調整します。終了したら、移動をプロットしてセル軌跡の行プロットを選択するか、プロット機能に移動して、運動速度、運動性、移動、移動の直接性などの他の運動関連パラメータをプロットします。データを表または図としてエクスポートします。このプロトコルでは、定量的な位相画像がホログラフとして提示されます。ここに示す細胞は、血管新生および非血管新生のヒト骨肉腫細胞の典型的な細胞形態を示しています。セルの厚さは、屈折率と光路長によって計算され、ここでは散布図として示されています。2つの異なる細胞表現型は、異なる分布パターンを示し、血管新生細胞が非血管新生細胞よりも細胞面積が小さく、細胞の厚さが大きいことを示しています。2つの細胞タイプの細胞増殖速度は、セグメント化され、2日間にわたるこれらのような2D画像から計算できます。これらの特定の細胞タイプについては、有意差は認められませんでした。細胞の細胞運動特性を決定するには、個々の細胞を選択し、経時的に追跡する必要があります。ここでは、追跡されたセルは異なる色で囲まれています。個々のセルは 4 時間にわたって追跡され、ここでは、ゼロ点が開始位置、最終位置が色付きのドットで示されている合計パス軌跡について説明します。このビデオを見れば、定量的位相イメージングを使用して、細胞の形態学的および挙動パラメータを定量的に比較する方法を十分に理解できるはずです。この場合、血管新生細胞表現型と非血管新生細胞表現型の間。この開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が腫瘍休眠からの脱出とこのプロセスにおける血管新生の役割を探求する道を開きました。連続的で非ラベリングのプラットフォーム。ヒト細胞株の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、3D定量的位相イメージングによるリンパ球の形態と生化学のラベルフリー同定を示しています。この技術により、リンパ球の徹底的な分析が可能になり、ラベリング手順を必要とせずにリンパ球の内部構造と特性を明らかにすることができます。...

リンパ球のサブタイプを特徴付けるための三次元定量的位相イメージング

出典: Parker, J. J., et al. 抗侵襲薬の腫瘍細胞遊走と患者特異的効果を研究するためのヒト神経膠芽腫器官型スライス培養モデル。J. Vis. 経験。(2017年)このビデオでは、共焦点顕微鏡による緑色蛍光タンパク質 (GFP)...

タイムラプス走査共焦点顕微鏡を使用した神経膠芽腫組織における腫瘍細胞遊走のイメージング

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。...

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

ここでは、抗がん治療薬に応答して単一細胞を縦断的に追跡する長期のタイムラプス顕微鏡法について説明します。...

鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。...

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング...

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

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M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

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デジタル顕微鏡を用いた細胞死開始の研究

ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。...

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このプロトコルは、生きたヒト乳がん細胞のラベルフリー、非侵襲的な表現型解析のためのラマン分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルアプローチを提示します。これには、迅速で定量的な形態化学分析のためのユーザーフレンドリーでヒューマンバイアスのない分析パイプラインが含まれており、がん研究や細胞生物学への応用で詳細な分子および構造の洞察を提供します。...

生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

学ぶ定量的位相イメージング法によるヒト骨肉腫細胞の形態・増殖・運動性の同時解析。休眠状態と活性化状態のがん細胞表現型を定量的に評価し、腫瘍進行メカニズムの解明に貢献する。

時間経過、ラベル無料、定量的相休眠とアクティブなひと癌細胞のイメージング研究

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