Name: トリコスタチン A とビタミン C の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ トリコスタチンAとビタミンCを用いたマウス体細胞核移植法。培養液調製、卵母細胞の核除去、細胞融合、活性化処理の手順を解説し、クローン胚の発生効率向上と発生生物学研究への応用を示します。

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この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 JP15H06753、JP16H01321、JP16H01222、キロ住友財団基礎科学研究 (150810 キロに) に JP17H05045 によって支えられました。近代大学研究助成金 (15-私-2 キロと修士)。ミズーリ州は、癌研究イギリス (C6946/A24843) および Wellcome の信頼 (203144/Z/16/Z) によって提供されるコアのサポートを認めます。 証明書の読み取り、Backes 上村さん (名) と氏・ j ・ ホルバートに感謝します。

動物のすべてのプロシージャは、ケアと実験動物の使用のための近代大学のガイドラインに適合。
1. 培地の調製
<ol><li>成る 95 mM の NaCl, KCl 2.5 mM、0.35 mM KH2PO4, 0.2 mM MgSO4 · 胚培養に変更された KSOM (mKSOM) メディアを準備します。7 H2O、1.71 mM CaCl2 ·2 H2O、0.2 mM D-(+)-グルコース、0.2 mM ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM 1.0 g/L ポリビニルピロリドン (PVP)、25.07 mM NaHCO3、L-グルタミン 10 mM DL-乳酸ナトリウム、0.05 g/L、ペニシリン、0.05 g/L の滅菌水にストレプトマイシン。</li>
	<li>胚操作、81.5 mM の NaCl、KCl、4.8 mM 1.7 mM CaCl2 · から成る Hepes バッファー CZB (HCZB) メディアを準備します。2 H2O、1.18 mM MgSO4 ·7 H2O、1.18 mM KH2PO4、0.11 mM EDTA ·36.1 mM 2Na ナトリウム DL-乳酸、5.55 mM D-(+)-グルコース、0.025 g/mL ペニシリン、ストレプトマイシンの 0.035 g/L、0.014 mM フェノール レッド、1.0 g/L ポリビニル アルコール、5.0 mM NaHCO3と 20.0 mM Hepes ナトリウム塩を滅菌水。</li>
	<li>卵母細胞の活性化のため活性化メディアの準備: 50 nM TSA、2 ミリメートル グリコールエーテルジアミン四酢酸、5 μ G/ml サイトカラシン B (CB) と 5 mM SrCl2と mKSOM 培。</li>
</ol>2. 準備の純水ウシ血清アルブミン (地場)
<ol><li>ウシ血清アルブミン (BSA) の 1.2 g を常温 (12% の最終的な集中) 滅菌水 10 mL に溶かしてください。</li>
	<li>穏やかな攪拌しながら常温で滅菌水に BSA の 12% を用意して上記に混合イオン交換樹脂ビーズ約 0.12 g を追加します。</li>
	<li>ビーズが青緑色から色を変更するとき金にピペットを使用して培養上清中の解決策を回復します。新鮮なとビーズを置き換えるもの (図 1)。 メモ: ビーズの交換は一度だけ実行されます通常。おそらく、完全な脱塩し、いくつかの代替が必要です。ビーズの色が変わらない場合、ガイドとしてのみゴールド ブルー グリーン、そのイオン交換が完全なことを示します。</li>
	<li>ビーズの色の変化がないことを確認した後、ソリューションを回復します。 注: 回収液は曇りになると、遠心 (175 x g、5 分) のフィルターの目詰まりを防ぐために。</li>
	<li>回復した補足 10.5% NaHCO3の 250 μ L でソリューション。 注: このプロセスは、ph を中和する地場ソリューション用です。ただし、NaHCO3が不可欠であることができます。</li>
	<li>0.45 μ m のフィルターを使用して上清を殺菌し、地場原液として-20 ° C で保存します。</li>
</ol>3. 採卵
注: すべてのマウスは、光制御とエアコン付きの客室で維持されました。
<ol><li>妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG) 7.5 IU の腹腔内投与による各女性の B6D2F1 マウス (高齢者は 8-10 週間) のスーパー排卵とひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 48 h PMSG 投与後の 7.5 IU。</li>
	<li>頚部転位 14-16 h で安楽死 hCG 注射後。標準的な解剖技術13を用いた生殖管にアクセスする腹部を切開します。簡単に、皮をつまむし、ハサミで正中線で小さな横切開を行います。皮膚切開部の上下にかかわらずしっかりと押しながらヘッドとテールに向かって皮膚を引っ張ったりします。はさみを使って腹膜を切り取って腸のコイルをプッシュ方法のうち、子宮、卵管、卵巣の 2 つの角の存在を確認します。</li>
	<li>ストレートのハサミとピンセットで卵管を勧めた、表面の血を拭くためのフィルター紙のシート上に配置します。鉱物油で卵管を設定します。解剖針を使用して卵管の膨大部をカットし、200 μ L 滴 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中に卵管の膨大部からくる卵丘卵子複合体を移動します。温暖化のプレート上で 5 分間インキュベートします。 注意: 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中 10 分以上の露出は卵母細胞の有害でしょう。</li>
	<li>転送第 2 減数分裂中期 (MII) 段階卵子 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場いくつかの残りの卵丘細胞を顕微鏡下で - 卵子複合体から卵丘細胞が解放されることを確認します。上下にピペッティングにより MII 期卵子を 4 回、洗って (のピペットを使用して < 100 μ m の内径) mKSOM 中含まれている 0.3% 地場残りの卵丘細胞のデタッチのために。 注: 小さなピペットの使用卵丘細胞の剥離が容易になります。</li>
	<li>MKSOM 中含まれている 0.3% 地場 37 ° c 未満 5% に Mll ステージ卵をインキュベート摘出まで CO2インキュベーター。 注:、卵母細胞のそれより若干大きい直径の小さなピペットをお勧めします。</li>
</ol>4. ドナー細胞の核移植のための準備
<ol><li>手順 3.3 3.5 後、裸出卵子は卵丘卵子複合体から分離されます。顕微鏡下でピペットを使用して 6% 地場と HCZB 培地に 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 培地で卵丘卵子複合体から分散して残りの卵丘細胞の少量 (約 2 μ L) を転送します。</li>
	<li>37 ° c まで法に必要な地球温暖化のプレートに 6% 地場と HCZB 中に卵丘細胞を配置します。 注: とき線維芽細胞 (e.g。、マウス胎児線維芽細胞) が培養皿からセルを外し、ペレットにそれらを遠心分離機ドナー細胞として使用する。HCZB 培 6% 地場における細胞のペレットを再懸濁します。</li>
</ol>5. 卵母細胞の核出
<ol><li>0.9 g PVP を 10 mL HCZB 中に追加することによって 9 %pvp メディアの準備、(4 ° C)、一晩冷蔵庫で保存し、0.45 μ m のフィルターを使用してそれを殺菌します。</li>
	<li>CB 原液 (1 Mg/ml の濃度) を準備するには、ジメチルスルホキシド (DMSO) 5 mL に CB の 5 mg を追加します。HCZB 中 (最終濃度 5 μ G/ml) CB 原液を希釈し、摘出解決策として使用します。</li>
	<li>吸い込むと滅菌ピペットを吐き出す HCZB 培 5 μ G/ml CB (摘出ソリューション) の 20 μ L Mll ステージ卵母細胞を洗い (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から)。5 回洗濯手順を繰り返します。摘出プロセスを開始する前に摘出ソリューションで温暖化のプレートに約 10 分を待ちます。</li>
	<li>図 2 aに示すように、核出術室を準備します。核出術室に転送 Mll 卵子は吸い込むと吐き出すピペットを使用して、(内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);摘出ソリューションの 4 μ L を置き、チャンバー内に鉱物油をカバーします。 注: 代わりに、商工会議所、60 mm のペトリ皿のカバーを使用することができます。</li>
	<li>スピンドルと室温で顕微鏡 (400 倍) で MII 期卵子の染色体を識別します。ホールディング ピペット、マイクロ ピペットを使用して (図 2 b) 位置 3 または 9 では染色体とスピンドルの位置決め、顕著な第一極体と Mll 段階卵子に合わせます。 注: 使用される顕微鏡は、合計で 400 倍の倍率のレンズをあります。また、対物レンズ N.A は 5 X/0.12 と 40 X/0.55 です。ピペットのピエゾ パルス駆動透明帯の急速な掘削を許可します。さらに、レーザー システム (例えばXYClone) もピエゾ駆動システムの代わりに透明帯の掘削に使用可能です。</li>
	<li>3 - 6、ピエゾ パルス強度を設定し、ピエゾ パルス駆動マイクロ ピペット (7-8 μ m 内径フラット エンド チップ) を使用して透明帯にドリルします。透明帯に穴を開ける後、完全にスピンドルと細胞質 (図 2) の最低量の染色体を摘出します。 注: この処理中に卵がちしっかりと皿の底を付けるまたは BSA14なし媒体によるピペットします。10 分以内摘出を完了する必要がありますと除核卵子がインキュベーターに返却する必要があります。適切な 1 つ摘出で操作することができます卵母細胞数は 10 と 20 の間です。卵母細胞の大きなバッチは、摘出術の手順が繰り返されます。</li>
	<li>可視光 (図 2中間)、細胞質の染色体の有無を確認し、mKSOM 培 CB を欠けている 0.3% 地場で除核卵子を徹底的に洗います。37 ° C 未満 5% でインキュベーターに皿を紹介細胞融合までの CO2 。 注: 摘出後卵から削除される細胞質含むスピンドルと染色体。</li>
</ol>6. 除核卵子ドナー細胞の融合
<ol><li>
HVJ エンベロープベクターの準備
	<ol>
<li>凍結乾燥 HVJ-E に冷たい HVJ-E 懸濁液ソリューションの 260 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください) とピペットの上下まで十分に中断されました。 注: 凍結乾燥 HVJ-E の適切な量は、瓶の中の準備し、260 μ L HVJ-E 懸濁液ソリューション キットに含まれております。</li>
		<li>HVJ-E 溶液 5 μ L の因数を準備し、細胞融合まで-80 ° C で保存します。 注意: それは温度に敏感なので慎重に氷の上 HVJ-E を扱います。実験、適切にオートクレーブ HVJ-E 材料およびウイルス コンポーネントを完全に不活化するコンテナーの完了後。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞融合
	<ol>
<li>使用直前に細胞融合バッファーの 20 μ L で HVJ-E ソリューションの 5 μ L を希釈します。氷の上に使用されるまで薄めた HVJ-E を配置します。 注: セル融合バッファーは、HVJ-E キットに含まれます。</li>
		<li>図 3 aに示すように、セル核融合炉チェンバーを準備します。ピペットを使用して細胞融合の商工会議所の除核卵子を HCZB 媒体に転送 (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);各ソリューションの場所 4 μ L (HCZB 培ドナー細胞、HVJ-E ソリューション、HCZB 培地、6% BSA 9 %hczb 中 PVP) と鉱物油の約 1 mL とチャンバーをカバーします。 注: 適切な除核卵子が 1 つの細胞融合手順中の操作のために部屋に転送される数は、30 に 5 からです。卵母細胞の大きなバッチは、細胞融合手順が繰り返されます。商工会議所、代わりに 60 mm シャーレ カバーできる使用可能な場合。</li>
		<li>HCZB 中 400 X magnificationat 室温で顕微鏡下除核卵子を配置します。(6 7 μ m 内径フラット エンドの先端)、マイクロ ピペットを使用してドナー細胞を吸引、HVJ-E 懸濁液ソリューションに細胞を追放します。</li>
		<li>その後、卵丘細胞一つずつシリアル細胞融合を有効に、お互いから分離する均等に HVJ-E 懸濁液の解決策を吸い出しなさい。ホールディング ピペットを使用して HCZB 媒体に除核卵子をしてください。ピエゾ パルス (3-6、2 - 3 速の強さ) をマイクロ ピペットで透明帯をドリルします。</li>
		<li>透明帯に穴開いたら、卵膜を経由せず卵丘細胞量の 5 倍のボリュームと HVJ-E 懸濁液の解決策と共に、卵膜にしっかりと積雲の細胞を配置します。 注: は、卵丘細胞をマイクロ ピペットの 6-7 μ m 内径先端フラット エンドを準備します。ピペットは、平滑リリースを維持するため定期的に 9 %pvp 中を使用して洗浄する必要があります。6.2.5 6.2.3 - の手順は 10 分以内に終えなければならないまたは細胞融合の効率は低くなります。HVJ エンベロープベクターの膜融合活性はオートクレーブ、洗剤、または 70% エタノール投与による不活化します。実験の後の HVJ-E ソリューションを適切に破棄する必要があります。</li>
		<li>細胞融合の操作後、速やかに mKSOM 媒体含む 0.3% 地場、卵母細胞を転送し、37 ° C 5% 未満で保育器に移動 1 h の CO2 。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 再建された卵母細胞と治療トリコスタチン A とビタミン C の活性化
<ol><li>
TSA の準備
	<ol>
<li>3 μ 因数に 5 mM TSA ソリューションを省略し、-20 ° C でソリューションを格納</li>
		<li>1 mL の DMSO (12.5 μ M の濃度) に 5 mM TSA 原液の 2.5 μ L を追加します。</li>
		<li>活性化中小企業 mKSOM 培地 2 mL に 12.5 μ M TSA 貯蔵液 8 μ L を希釈 (最終濃度 50 nM)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VC の準備
	<ol>
<li>滅菌のエンドトキシン フリーの水の 1 mL に VC の 1 mg を追加し、-20 ° C で保存</li>
		<li>MKSOM 培地 (最終濃度 10 μ G/ml) に VC 原液を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再建された卵母細胞の活性化
	<ol>
<li>細胞融合後 1 時間は、時期尚早の染色体凝縮 (PCC) 再建された卵母細胞 (図 3 b) 顕微鏡 (400 倍) を使用してを確認してください。</li>
		<li>再建された卵子を活性化媒体に転送 (手順 1.3 参照)、TSA を含む、37 ° C 未満 5% で 6 時間インキュベート CO2空気 (図 3)。Pro-核法胚の形成を観察し、適用 2 mKSOM 中含まれている 0.3% (図 2) 地場で TSA 治療のより多くの時間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>VC と mKSOM 培に TSA 治療胚を転送し、 3 D 図で示すように、7 時間孵化させなさい。</li>
	<li>VC 治療の 7 時間後 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場 VC 治療胚を転送し、37 ° C 未満 5% で 4 日間インキュベート空気中の CO2 。 メモ: クローン マウスを生成するためには、通常形態の 2 細胞期胚を転送擬似妊娠したメスマウス (MCH(ICR)) (偽妊娠の 0.5 日)15見つかったら腟栓日の卵管に。19.5 日後帝王切開後着床と新生児の数が記録されます。</li>
</ol>

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<li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichostatin+A+%28TSA%29+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos%2C+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li>
<li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

結論として、示唆こと提示法法でした技術的な問題を減らすと遺伝の修正および mRNA の補足 (表 1表 2) を必要とせず法の効率を高めることを確認クローン胚の安定生産。このメソッドは、私たちの生存率と簡略化されたプロトコルのための従来の方法よりもより多くの法胚を再構築すること。このプロトコルでは 1 つの重要なステップは細胞融合です。正常に生成されたクローン マウスを HVJ-E プロトコルで説明されている適切な量が細胞融合プロセス中に維持、卵母細胞は 6.2.5 6.2.3 - の手順で 10 分以内のインキュベーターに返却する必要があることを確認する重要です。20 に 30 ドナー細胞は、操作ピペットで一度に HVJ-E と共に吸気することができます、ので、1 つの操作によって得られる卵の数は既存のメソッドのより大きい。最後に、我々 は 10 分以内約 20 に 30 再構築卵子を生成できます。6.2.3 - 6.2.5 の手順を繰り返して、卵 (100 以上)、大規模なバッチで細胞融合手順の作業は時間がかかる必要がある場合でも以下のもの。メソッドとここで紹介する手法は、簡略化された技術的な要件と効率的なプロトコルとして使用できます。
現時点では、法の胚の開発の基礎となる分子メカニズムはまだ不明です。この改良法法は、このメソッドはのみ 1 つの実験で多くのクローン胚を作り出すことができるので、このようなリプログラミングの機構を勉強にも貢献します。このメソッドは、そのまま細胞膜は細胞を使用して細胞融合を。したがって、尾先端細胞16、セルトリ細胞17、および胚性幹 (ES) 細胞18など、他のセルにこのアプローチを適用することがあります。尻尾先端電池などの比較的大きな細胞を注射で使用する従来法直接卵母細胞の細胞質になるもライブ胚を取得するより技術的に厳しい。また、比較的硬い細胞、セルトリ細胞など、ピペッティングを注入するため、断ち切ることは困難。これらの様々 な細胞のタイプを考慮する場合、HVJ-E を利用した細胞融合法はシンプルで効果的です。値、HVJ-E の安全性は、説得力のある実証19,20をされていますが、農業や医療の目的でクローン動物を生産するため HVJ-E を使用しての可能性を再検討することが重要ででしょう。
さらに、最近 1 つのグループは正常に尿細胞21から派生したクローン マウスを生産しました。今後哺乳類の絶滅危惧種を救うため尿細胞などの非侵襲的な方法で収集した細胞を用いた法が理想的であります。最近では、別のグループが直接抗原特異的 cd 4 を使用してクローン マウスを生成+ T 細胞22。それは、この方法は、効率的にそのような細胞からマウスのクローンに適用される場合は、検討は興味深いでしょう。さらに、Latrunculin A は、眼球摘出と単為法卵子23の中にアクチンの重合を阻害するためのより良い代替手段として報告されています。今後の研究は、サイトカラシン B のではなく、Latrunculin A 治療がさらにクローン動物の子孫の世代を改善かどうかを明らかにするかもしれない。さらに、TSA の治療使用されています正常にマウス、豚24、ウサギ25で治療時間、期間、および濃度を変更することによって。さらに、VC だけでなく豚法10、萌芽期の開発を強化、また人間とマウス26iPS 細胞生産を向上させます。したがって、TSA と VC の治療は他の哺乳類種にも適用でき、それぞれの種の TSA と VC の治療時間を最適化する必要があります推測するもっともらしいです。
結論としては、このメソッドは、簡単な手順で効率の実用的なレベルでクローン マウスを生成することが可能でしょう。したがって、本研究の結果は、私たち希少動物の遺伝資源の保全と分化と初期胚の分子機構を理解するために法技術を使用する可能性があります。

法技術により、除核卵子に転送する 1 つだけの体細胞や核を用いたクローン動物の生産。法技術の目的の 1 つは、クローン胚からの核移植胚性幹細胞 (NT Esc) 線の派生です。1998 年、和歌山ら。 名前 Cumulina 最初時間1正常にクローン マウスを生産で報告された。その後、マウスのクローニングは広く研究されていると核体細胞核のリプログラミングに多くの重要な洞察を取得されています。その一方で、この手法は、ことはかなり困難である多数のマイクロマニピュレーション ステップ伴われるマスター、3 ヶ月2以上の集中的な訓練を必要とします。
法を用いたクローン マウスの生産は、日本 (HVJ)4センダイウイルスベクターによる細胞融合法に元ホノルル法1融合の方法3から進化しています。ただし、有棘を介して細胞核の直接注入は卵母細胞生存に不利に作用する傾向があります。各細胞膜は最適条件を決定するが難しく、硬さが異なるので、融合は低効率です。HVJ の取り扱いは、研究者と実験動物の安全のために特定の機器が必要なため面倒です。最近では、ドナーの細胞と卵母細胞の細胞質の融合、HVJ-E に使用される5をされています。HVJ エンベロープベクターは、ウイルスの増殖や感染能力なし膜を融合する能力のみが。HVJ のゲノム Rna は HVJ e. で完全に活性化HVJ エンベロープベクターの使用したがって細胞融合法中の使いやすさをサポートします。
いくつかのレポートは、TSA、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と法胚の治療が 1% から 6.56,7未満からライブ子犬の生産効率を大幅に向上を示しています。TSA 治療法胚8のヒストンを修飾によるリプログラミングを加速します。最近、特定の Mrna、ヒストンのリジン デメチラーゼ亜科ヒストン H3 ライシン 9 (H3K9) を削除する 4 (KDM4) の注入法胚で、耐 reprograming 地域で特にトリメチルの開発の増加に示されているクローンとして作られました。マウス胚9。一方、VC、ヒストン修飾としても、H3K910トリメチルを減少しています。また、VC はブタ法10の胚を強化し。それは、法胚に地場の注入は胚11の改善につながることが報告されています。
以前、地場、一緒に小分子、すなわち TSA と VC の組み合わせが大幅に法胚12の開発を強化とわかった。ここでは、非常に効率的でシンプルなクローン作成の手順12を表しますマウス、以前に報告された法方法を詳しく説明します。HVJ E の処理についても述べるこれらは、遺伝資源を保存またはこの法による遺伝子改変動物を生産する発達と生殖生物学の分野で多くの研究者を助けることができます。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td>シ<td>グマ-アルドリッチ、株式会社、LCC。</td><td>28-2270-5</td><td>中型</td></tr><tr><td>KCl</td>用 <td>和光純薬工業(株)</td><td>169-03542</td><td>中型用</td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>和光純薬工業株式会社</td><td>165-04242</td><td>中</td></tr>型<tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>137-00402</td><td>中型</td></tr><tr><td>CaCl2 & middot; 2H2O</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>039-00431</td><td>中型</td></tr><tr><td>用 D(+)-グルコース</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>041-00595</td><td>中型ピル</td></tr><tr><td>ビン酸ナトリウム</td>用 <td>和光純薬工業(株)</td><td>199-03062</td><td>中型</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>G3126</td><td>中型</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td>用 <td>和光純薬工業(株)</td><td>168-17042</td><td>中型</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31213-15</td><td>中型</td></tr><tr><td>ナトリウムDL-乳酸</td><td>Nacalai tesque、Inc.</td>用<td>31605-72</td><td>中ペ</td></tr><tr><td>ニシリン</td>用 <td>明治製菓ファルマ(株)</td><td>4987222637671 (GTIN-13)</td><td>中型</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td>用 <td>明治精華ファルマ(株)</td><td>4987222665643 (GTIN-13)</td><td>中</td></tr><tr><td>滅菌水用、エンドトキシンフリー</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>196-15645</td><td>中</td></tr><tr><td>型EDTA用・中ドット 2Na</td><td>同人堂研究室</td><td>345-01865</td><td>ミディアム</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P0290</td><td>中</td></tr><tr><td>HEPESナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich、Co.、Lcc。</td><td>H3784</td><td>中型</td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>用 Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P8136</td><td>中期</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td>用 <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A3311</td><td>中型</td></tr><tr><td>BT AG 501-X8 (D) レジン</td><td>バイオ・ラッド ラボ インク</td><td>143-7425</td><td>dBSA</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td>の調製 <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3506</td><td>卵子・卵丘細胞採取用</td></tr><tr><td>サイトカラシンB</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>034-17554</td><td>核摘出・卵子活性化用</td></tr><tr><td>ピエゾマイクロマニピュレーター</td><td>Prime tech, Co., Ltd.</td><td>PMM-150FU</td><td>マイクロマニピュレーション</td></tr><tr><td>用HVJエンベロープ細胞融合キット GenomONE-CF</td><td>石原産業株式会社</td><td>CF001</td><td>HVJ-E懸濁液0.5mLと細胞融合用細胞融合緩衝液10mL含有</td></tr><tr><td>SrCl2 & middot; 6H2O</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>193-09442</td><td>卵母細胞活性化用</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>E8145</td><td>卵子活性化用</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>045-24511</td><td></td></tr>溶剤<tr><td>用トリコスタチンA</td><td>シグマアルドリッチ、Co.、Lcc。</td><td>T1952</td><td>SCNT胚とのインキュベーション用</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A5960</td><td>SCNT胚とのインキュベーション用</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>M8410</td><td>カバー媒体用</td></tr></tbody></table>

トリコスタチン a とビタミン c の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

体細胞核移植法は、直接ドナー細胞からクローンとして作られた動物を生成するユニークな機会を提供しています、熟練した技術が必要です。さらに、クローン作成の効率は、クローン動物、特にマウスの成功の生産以来低残っています。クローン作成の効率を向上させる多くの試みがずっとあるとトリコスタチン A (TSA)、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、クローン作成の効率を高めるために広く使用されています。ここでは、マウスで劇的に改善されたクローンの作成方法を報告します。この体細胞核移植法には、簡単な操作を可能にする日本の封筒 (HVJ-E)、センダイウイルスベクターの使用が含まれます。また、TSA との脱ウシ血清アルブミン (地場)、ビタミン C (VC)、2 つの小さな分子を用いた治療は萌芽期の開発のために非常に効果的。このアプローチは追加注入も遺伝子操作を必要とし、こうしてシンプルで適切な活用法を示します。このメソッドは、培養細胞からの遺伝子改変動物を生産する研究者のための技術的に可能なアプローチになるかもしれない。さらに、クローニングを介して絶滅寸前の動物の救助のための便利な方法ででしょう。

クローン マウス胚を作り出す、卵丘細胞と胎児線維芽細胞を使用されました。再建された卵と 2 細胞期に卵母細胞活性化後の開発の数は表 1のとおりです。前核形成 (89 ~ 100%) と 2 細胞期 (77 に 89%) に開発の非常に高い割合は、あらゆる条件下で観察されました。卵丘細胞から派生され、2 細胞期に開発された、クローンとして作られた胚の一部は擬似妊娠雌の卵管に移されました。72 転送胚から六つのクローンとして作られた子孫は、TSA の VC (図 4) シリアル処理による 3 妊娠中の女性から生産されました。クローン胚の約 15% は、この法の手順12を次で長期的に開発に報告されています。さらに、他の機関でのクローンの 2 細胞期胚の転送クローン胚の単一の TSA の治療よりもより良い開発を表します 9 ~ 15% 生きている子孫を遂げています。また、TSA と VC 治療が胚盤胞期胚培養の効率を大幅に改善 (表 2、 P &lt; 0.05、スチューデントの t 検定)。これら体外発育のデータは、TSA と VC の肯定的な効果のマウス系統も細胞の種類によって限られたことを示します。この法法がクローンとして作られた胚の発生能を促進が示唆されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg"> 図 1: 地場の準備。 地場のソリューションを準備するための手順が描かれています。イオン交換の範囲は、ビーズの色の変化で判断できます。上左図 BSA の 1.2 g を常温で滅菌水 10 mL で溶解します。BSA が解散した後、イオン交換樹脂ビーズには (右上) が追加されます。イオン交換樹脂ビーズの BSA 溶液の混合物が青緑色から色を変更すると金 (右下)、新鮮なものでビーズを置き換えます。左下図は、ビーズの色が青緑のイオン交換が完了したことを示しています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg"> 図 2: 摘出プロシージャ。 (A) 摘出術室の図。卵母細胞の摘出は、CB が HCZB 中で実行されます。ピエゾ駆動系 9 %pvp 中のスポットが摘出のためガラス ピペットを準備する使用されます。スポットは、鉱物油で覆われています。(B) A 図と顕微鏡写真は、スピンドルと摘出する前に染色体の位置を示します。黒の矢印: スピンドルと染色体。赤矢印: 第一極体。(C) A の図および成功した眼球摘出を顕微鏡写真。黒の矢印: スピンドルと染色体。赤矢印: 第一極体。青い矢印: 透明帯に穴。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg"> 図 3: セルの融合のプロシージャおよび文化法胚の状態。 (A) セル核融合炉チェンバーのイラスト。6% 地場を含む HCZB 培地で細胞融合を行います。9 %pvp 中のスポットを使用して、細胞融合用ガラス ピペットを準備します。スポットは、鉱物油で覆われています。(B) A 図と時期尚早の染色体凝縮の顕微鏡写真は形成細胞融合 (黒矢印) 後 1 時間です。(C) A の図、前核構造の顕微鏡写真は、活性化 (黒矢印) 後 6 時間を形成しました。(D) 法胚の地場、VC、TSA の治療法緑の矢印は、TSA、0.3% 地場 (青い矢印) と mKSOM 培下で VC (黄色の矢印) と孵化によって続かれて治療を表します。矢印は、媒体を変更するタイミングを示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg"> 図 4: クローン動物の子孫は帝王切開後妊娠の 19.5 日の直後に卵丘細胞から派生しました。 一番上の行に胎盤があります。ここに示すクローン動物の子孫は、核移植実験 3 母親から 1 つに発生しました。胎盤サイズが体外受精によって作り出されるそれらのサイズより 1.5 倍から 2 倍大きくなった。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>グループ</td>
			<td>ドナー細胞型</td>
			<td colspan="2">マウス緊張</td>
			<td>違います。卵使用の</td>
			<td>違います。卵母細胞の融合</td>
			<td>違います。時期尚早の染色体凝縮を示す卵母細胞の</td>
			<td>違います。卵前核形成 (%) を表示</td>
			<td>違います。開発前核形成卵母細胞の 2 細胞胚 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA、VC</td>
			<td>積雲</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
<tr>
<td>未処理</td>
			<td>積雲</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA、VC</td>
			<td>胎児線維芽細胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
<tr>
<td>未処理</td>
			<td>胎児線維芽細胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: TSA は、VC の処理に及ぼす影響、体外クローン マウス 2 細胞期胚の開発。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">グループ</td>
			<td rowspan="2">ドナー細胞型</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">マウス緊張</td>
			<td rowspan="2">違います。2 細胞期胚を使用</td>
			<td colspan="3">違います。2 細胞期胚の各段階 (%) を開発</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 セル</td>
			<td>桑実胚</td>
			<td>胚盤胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA、VC</td>
			<td>積雲</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) 、
</td>
		</tr>
<tr>
<td>未処理</td>
			<td>積雲</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA、VC</td>
			<td>胎児線維芽細胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>未処理</td>
			<td>胎児線維芽細胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) d
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
a b c d同じドナー細胞の内で別の上付き文字を表す有意差 (P 0.05 &lt;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: TSA は、VC の処理に及ぼす影響、体外クローン マウス胚盤胞期胚の開発。

トリコスタチン A、ビタミン C、および脱イオン ウシ血清アルブミンを使用してマウスのクローニングのため大幅に向上手法について述べる。クローン胚の効率的な開発をサポートする簡略化された、再現可能なプロトコルを示す.したがって、このメソッドは、マウスのクローニングのための標準化された手順になります。

トリコスタチン A とビタミン C の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

この実験の全体的な目標は、体細胞核移植を使用して再構築された胚とクローンマウスの生産効率を向上させることです。この方法は、基礎生物学、発生生物学、および絶滅危惧種の動物の救助分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。胚発生、核プログラミング、遺伝子研究の保存など。この方法および技術の主な利点は、簡単な手順で実用的な効率でクローニングマウスを作製できることである。テキストプロトコルに従って培地を調製した後、1.2グラムのBSAを10mLの滅菌室温の水に溶解します。約0.12gの混合イオン交換樹脂ビーズをBSA溶液に室温で、穏やかに攪拌しながら加えます。ビーズの色が青緑色から金色に変わったら、ピペットを使用して上清溶液を回収し、ビーズを新しいバッチと交換します。新鮮なビーズの色が変わらないことを確認した後、溶液を回収します。次に、250マイクロリットルの10.5%重炭酸ナトリウムを追加します。0.45ミクロンのフィルターを使用して上清を滅菌し、DBSA原液としてラベル付けし、摂氏マイナス20度で保存します。テキストプロトコルに従って超排卵を受けた雌マウスに安楽死を行った後、標準的な解剖技術を使用して腹部を切開し、生殖管にアクセスしました。小さなまっすぐなハサミとピンセットを使用して卵管を摘出し、濾紙に移して表面の血液を拭き取ります。次に、卵管を鉱油にセットし、解剖針を使用して卵管の膨大部を切断し、膨大部から来る卵丘卵母細胞複合体を0.1%ヒアルロニダーゼを含むHCZB培地の200マイクロリットル滴に移します。組織を保温プレート上で5分間インキュベートします。実体顕微鏡で、卵丘細胞が卵丘卵母細胞複合体から放出されることを確認した後、残りの卵丘細胞を含む第2減数分裂またはM2中期卵子を0.3%DBSAを含むMKSOM培地に移します。培地中でピペッティングしてM2ステージの卵子を4回洗浄し、残りの卵丘細胞を剥離します。次に、卵子を摂氏37度と二酸化炭素5%の培地で核摘出するまでインキュベートします。剥離した卵母細胞を卵丘卵母細胞複合体から単離するには、ピペットを使用しながら実体顕微鏡で、卵丘卵母細胞複合体から分散した残りの卵丘細胞の少数を6%DBSAのHCZB培地に移します。体細胞核移植またはSCNTに必要になるまで、卵丘細胞を摂氏37度の加温プレートに置きます。テキストプロトコルに従ってPVP培地およびCBストック溶液を調製した後、CB1ミリリットルあたり5マイクログラムを含む20マイクロリットルのHCZB培地で滅菌ピペットを使用して、M2ステージの卵子を洗浄します。洗浄を5回繰り返した後、温めプレート上の核液で卵子を10分間インキュベートします。次に、除核チャンバーを準備し、ピペットを使用してM2卵子をチャンバーに移します。4マイクロリットルの除核液を加え、チャンバーを鉱物油で覆います。室温の顕微鏡下で、M2期の卵子の紡錘体と染色体を同定します。次に、保持ピペットとマイクロピペットを使用して、紡錘体と染色体の位置が3:00または9:00の位置になるように、卵母細胞を顕著な最初の極性体で向きます。パイゾパルス強度を3〜6に設定し、マイクロマニピュレーションピペットを使用して透明帯にドリルで穴を開けます。その後、最小限の細胞質で紡錘体と染色体を完全に除核します。可視光下で、細胞質に染色体がないことを確認し、次にCBを欠く0.3%DBSAを含むMKSOM培地で、除核卵子を徹底的に洗浄します。細胞が融合するまで、皿を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。HBJEを調製するには、凍結乾燥したHVJ-Eに260マイクロリットルの氷冷HBJE懸濁液を加え、完全に懸濁するまでピペットで上下させます。溶液の5マイクロリットルのアリコートを準備し、細胞融合まで摂氏マイナス80度で保存します。細胞融合を行うには、20マイクロリットルの細胞融合バッファーを使用して、5マイクロリットルのHVJ-E溶液を希釈します。希釈したHBJE溶液を使用まで氷の上に置きます。ここに示すように細胞融合チャンバーを調製した後、ピペットを使用して、除核卵子をチャンバー内のHCZB培地に移します。図のように各溶液を4マイクロリットル追加し、チャンバーを覆うために約1ミリリットルの鉱油を使用します。除核卵子を入れたチャンバーを室温で、400倍の倍率の顕微鏡下に置きます。次に、マイクロマニピュレーションピペットを使用して、ドナー細胞をHVJ-E懸濁液に移します。卵丘細胞を1つずつ吸引して均等に分離し、連続的な細胞融合を可能にします。次に、ホールディングピペットを使用して、除核卵子をHCZB培地に保持し、マイクロマニピュレーションピペットでパイゾパルスを使用して透明帯をドリルします。透明帯に穴を開けた後、HVJ-E溶液の約5倍の容量で卵丘細胞をピペットで動かし、膜を通さずに卵母細胞膜にしっかりと排出します。細胞融合の操作後、卵子を0.3%DBSAを含むMKSOM培地に速やかに移し、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに1時間移動します。核形成された卵子をHCVB培地に顕微鏡下に置いてからインキュベーターに戻すまで、10分以内に完了する必要があります。細胞融合後、400倍の倍率で顕微鏡下で、再構築された卵子の早期染色体凝縮を確認します。再構築した卵子をトリコスタチンAまたはTSAを含む活性化培地に移し、摂氏37度、二酸化炭素5%で空気中で6時間インキュベートします。SENT胚で前核の形成を観察し、次に0.3%TBSAを含むMKSOM培地でさらに2時間のTSA処理を適用します。テキストプロトコルに従ってビタミンC治療を実施します。この表に見られるように、クローンマウス卵子に対するTSAおよびビタミンC処理は、非常に高い前核形成率を示し、すべての条件下で2細胞段階に発達しました。卵丘細胞に由来し、2つの細胞期に発達した一部のクローン胚は、偽妊娠女性の卵管に移植されました。この図は、TSAとビタミンCの連続治療により、3人の妊婦から産生された72個の移植胚から発生した6つのクローン子孫を示しています。最後に、ここで示したように、TSAとVCによる治療により、胚盤胞期までのin vitro胚発生の効率が大幅に向上しました。この手順を試行する際には、必要なすべての培地と試薬が事前に準備されていることを覚えておくことが重要です。手順自体は、従うのが簡単で、よく準備された資料であり、期待される結果を確実に達成します。このビデオを見れば、再構築された卵子の作り方をよく理解できるはずです。

combinational-treatment-trichostatin-vitamin-c-improves-efficiency

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールと​​して使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。...

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

新生児マウスの中枢神経系への治療薬を導入する脳（脳室）と（静脈内）2）全身に1）：この記事では、注入の2つの非常に異なる方法を示しています。...

マウスの脳室内（ICV）と静脈（IV）注入による治療薬のデリバリー

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

この研究は、奇形腫を生成せずに、生体内での体細胞の多能性に向けた再プログラミングを示しています。ヤマンカ因子をコードするプラスミドDNAの流体力学的尾静脈注入を使用して、成体肝細胞の多能性が強化された細胞へのin...

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

我々 はマウス胚性幹細胞を培養するための 2 つの化学ベースのプロトコルについて説明します。この新しいメソッドは、(ビタミン C)、テトを介した酸化を促進し、DNA 低いメチル化とマウス胚性幹細胞の多能性を維持するために、5-メチルシトシン (PD0325901)...

MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。...

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

ここでは、胚性幹細胞を用いた遺伝子改変マウスモデル、特に大型DNAノックイン(KI)の開発のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して調整されているため、従来の相同組換えを介した直鎖状DNAターゲティング法と比較して、KI効率が大幅に向上します。...

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

本プロトコルは、2iおよびLIF培地による培養中のマウス胚性幹細胞の逆ポリトランスフェクションの方法を記述する。この分析法は、従来のフォワードトランスフェクションプロトコルよりも高い生存率と効率をもたらすと同時に、プラスミド比のワンポット最適化も可能にします。...

核酸比の迅速な探索のための最適化されたマウス胚性幹細胞ベースのリバースポリトランスフェクション技術(英語)

このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro...

クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術

学ぶ トリコスタチンAとビタミンCを用いたマウス体細胞核移植法。培養液調製、卵母細胞の核除去、細胞融合、活性化処理の手順を解説し、クローン胚の発生効率向上と発生生物学研究への応用を示します。

トリコスタチン A とビタミン C の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。

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