トリコスタチン A とビタミン C の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。

この実験の全体的な目標は、体細胞核移植を使用して再構築された胚とクローンマウスの生産効率を向上させることです。この方法は、基礎生物学、発生生物学、および絶滅危惧種の動物の救助分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。胚発生、核プログラミング、遺伝子研究の保存など。

この方法および技術の主な利点は、簡単な手順で実用的な効率でクローニングマウスを作製できることである。テキストプロトコルに従って培地を調製した後、1.2グラムのBSAを10mLの滅菌室温の水に溶解します。約0.12gの混合イオン交換樹脂ビーズをBSA溶液に室温で、穏やかに攪拌しながら加えます。

ビーズの色が青緑色から金色に変わったら、ピペットを使用して上清溶液を回収し、ビーズを新しいバッチと交換します。新鮮なビーズの色が変わらないことを確認した後、溶液を回収します。次に、250マイクロリットルの10.5%重炭酸ナトリウムを追加します。

0.45ミクロンのフィルターを使用して上清を滅菌し、DBSA原液としてラベル付けし、摂氏マイナス20度で保存します。テキストプロトコルに従って超排卵を受けた雌マウスに安楽死を行った後、標準的な解剖技術を使用して腹部を切開し、生殖管にアクセスしました。小さなまっすぐなハサミとピンセットを使用して卵管を摘出し、濾紙に移して表面の血液を拭き取ります。

次に、卵管を鉱油にセットし、解剖針を使用して卵管の膨大部を切断し、膨大部から来る卵丘卵母細胞複合体を0.1%ヒアルロニダーゼを含むHCZB培地の200マイクロリットル滴に移します。組織を保温プレート上で5分間インキュベートします。実体顕微鏡で、卵丘細胞が卵丘卵母細胞複合体から放出されることを確認した後、残りの卵丘細胞を含む第2減数分裂またはM2中期卵子を0.3%DBSAを含むMKSOM培地に移します。

培地中でピペッティングしてM2ステージの卵子を4回洗浄し、残りの卵丘細胞を剥離します。次に、卵子を摂氏37度と二酸化炭素5%の培地で核摘出するまでインキュベートします。剥離した卵母細胞を卵丘卵母細胞複合体から単離するには、ピペットを使用しながら実体顕微鏡で、卵丘卵母細胞複合体から分散した残りの卵丘細胞の少数を6%DBSAのHCZB培地に移します。

体細胞核移植またはSCNTに必要になるまで、卵丘細胞を摂氏37度の加温プレートに置きます。テキストプロトコルに従ってPVP培地およびCBストック溶液を調製した後、CB1ミリリットルあたり5マイクログラムを含む20マイクロリットルのHCZB培地で滅菌ピペットを使用して、M2ステージの卵子を洗浄します。洗浄を5回繰り返した後、温めプレート上の核液で卵子を10分間インキュベー

次に、除核チャンバーを準備し、ピペットを使用してM2卵子をチャンバーに移します。4マイクロリットルの除核液を加え、チャンバーを鉱物油で覆います。室温の顕微鏡下で、M2期の卵子の紡錘体と染色体を同定します。

次に、保持ピペットとマイクロピペットを使用して、紡錘体と染色体の位置が3:00または9:00の位置になるように、卵母細胞を顕著な最初の極性体で向きます。パイゾパルス強度を3〜6に設定し、マイクロマニピュレーションピペットを使用して透明帯にドリルで穴を開けます。その後、最小限の細胞質で紡錘体と染色体を完全に除核します。

可視光下で、細胞質に染色体がないことを確認し、次にCBを欠く0.3%DBSAを含むMKSOM培地で、除核卵子を徹底的に洗浄します。細胞が融合するまで、皿を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。HBJEを調製するには、凍結乾燥したHVJ-Eに260マイクロリットルの氷冷HBJE懸濁液を加え、完全に懸濁するまでピペットで上下させます。

溶液の5マイクロリットルのアリコートを準備し、細胞融合まで摂氏マイナス80度で保存します。細胞融合を行うには、20マイクロリットルの細胞融合バッファーを使用して、5マイクロリットルのHVJ-E溶液を希釈します。希釈したHBJE溶液を使用まで氷の上に置きます。

ここに示すように細胞融合チャンバーを調製した後、ピペットを使用して、除核卵子をチャンバー内のHCZB培地に移します。図のように各溶液を4マイクロリットル追加し、チャンバーを覆うために約1ミリリットルの鉱油を使用します。除核卵子を入れたチャンバーを室温で、400倍の倍率の顕微鏡下に置きます。

次に、マイクロマニピュレーションピペットを使用して、ドナー細胞をHVJ-E懸濁液に移します。卵丘細胞を1つずつ吸引して均等に分離し、連続的な細胞融合を可能にします。次に、ホールディングピペットを使用して、除核卵子をHCZB培地に保持し、マイクロマニピュレーションピペットでパイゾパルスを使用して透明帯をドリルします。

透明帯に穴を開けた後、HVJ-E溶液の約5倍の容量で卵丘細胞をピペットで動かし、膜を通さずに卵母細胞膜にしっかりと排出します。細胞融合の操作後、卵子を0.3%DBSAを含むMKSOM培地に速やかに移し、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに1時間移動します。核形成された卵子をHCVB培地に顕微鏡下に置いてからインキュベーターに戻すまで、10分以内に完了する必要があります。

細胞融合後、400倍の倍率で顕微鏡下で、再構築された卵子の早期染色体凝縮を確認します。再構築した卵子をトリコスタチンAまたはTSAを含む活性化培地に移し、摂氏37度、二酸化炭素5%で空気中で6時間インキュベートします。SENT胚で前核の形成を観察し、次に0.3%TBSAを含むMKSOM培地でさらに2時間のTSA処理を適用します。

テキストプロトコルに従ってビタミンC治療を実施します。この表に見られるように、クローンマウス卵子に対するTSAおよびビタミンC処理は、非常に高い前核形成率を示し、すべての条件下で2細胞段階に発達しました。卵丘細胞に由来し、2つの細胞期に発達した一部のクローン胚は、偽妊娠女性の卵管に移植されました。

この図は、TSAとビタミンCの連続治療により、3人の妊婦から産生された72個の移植胚から発生した6つのクローン子孫を示しています。最後に、ここで示したように、TSAとVCによる治療により、胚盤胞期までのin vitro胚発生の効率が大幅に向上しました。この手順を試行する際には、必要なすべての培地と試薬が事前に準備されていることを覚えておくことが重要です。手順自体は、従うのが簡単で、よく準備された資料であり、期待される結果を確実に達成します。

このビデオを見れば、再構築された卵子の作り方をよく理解できるはずです。