Name: 生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶマウス血液脳関門透過性アッセイ法。蛍光トレーサー腹腔内投与による定量的・視覚的評価で、脳血管透過性を測定し、神経疾患における治療効果と回復メカニズムの解明に貢献します。

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著者は、この作業を支援する Leduq 財団によって資金を供給 Sphingonet コンソーシアムを認めたいと思います。この作品も「血管分化と改造」共同研究センターによって支えられた (CRC/Transregio23、プロジェクト C1) と 7。FP、COFUND、ゲーテ国際ポスドク プログラム移動で、291776 号の資金。我々 はさらに処理および遺伝子型解析マウスと彼女のテクニカル サポートのキャサリン ・ ソマーを認めます。

すべての動物は、処理中に痛みや不快感を最小限に抑え最大限大切に取り扱われました。この手順では、当院の動物医療のガイドラインに従って、(承認番号 FK/1044 Regierungspraesidium ダルムシュタット) のローカル委員会によって承認されています。
マウスにおける透過試金の生体内でのための作業手順の概略を図 1に示します。各手順の詳細は次のとおりです。
1. 動物取扱
<ol><li>
準備およびトレーサーと麻酔薬の投与
	<ol>
<li>透磁率測定前日の埋め込み、少なくとも組織のラベルの付いたチューブと金型を準備します。きれいな発煙のフードの下で働いて、80% エタノールで洗浄ツールを使用して、プロトコルの中で無菌状態を維持します。現在のプロトコルのための 3-6 ヶ月の成熟した大人の年齢層の男性または女性の野生型 (WT) またはアンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) の CD1 マウスを使用します。10を前述のようにマウスのジェノタイピングを実行します。 注: 80% アルコール滅菌器具にはなりませんが、試料の汚染を最小限に抑えられます。</li>
		<li>2 mM 株に滅菌 PBS ですべてのトレーサーを希釈し、-20 ° C で光から保護因数を格納</li>
		<li>(テトラメチル ローダミン) TMR などのトレーサーを選択し、(かに) 個別励起/蛍光スペクトルとの FITC は、蛍光顕微鏡による色素間の干渉を最小限に修正可能なリジン (TMR を使用してまたはFITC フィルターそれぞれ)、蛍光測定透水性測定用のプレート リーダー。 注: TMR デキストラン 3 kD FITC デキストラン 3 kD 研究に使用修正可能な両方のリジンおよびそれ故にされる可能性がありますもとアルデヒドの免疫組織化学的解析ポスト固定の地域差を調査するために。</li>
		<li>すべての動物を介護施設ガイドラインに従い細心の注意をもって処理します。1:1 の混合10,13各トレーサーの 100 μ L を使用して追加のトレーサーを組み合わせた場合、200 μ L まで増やすことができます 100 μ L トレーサー ソリューションで各マウス腹腔内を挿入します。トレーサー蛍光バック グラウンド減算の偽コントロールとしてではなく単独で PBS で少なくとも 1 匹の動物を注入します。</li>
		<li>トレーサー注入後 5 分麻酔のケタミン ・ キシラジン i.p 注入と動物 (100 mg と 5-10 mg 0.9% で本体重量 kg あたり生理食塩水重量、それぞれ 25 g マウスあたりカクテル 150 μ L)。 注: 獣医軟膏適用されませんでした目のプロシージャの間に動物の麻酔と灌流/犠牲間の期間は短かったと (10 分) が観察場所目の任意の乾燥はなかった。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血のコレクションおよび心臓の血流
	<ol>
<li>心筋灌流 10 分局所麻酔薬投与後の動物を準備します。動物の麻酔外科平面に達したことを確認するために足けいれん反応がないことを確認してください。</li>
		<li>自分の背中に動物を置き、80% エタノールを腹部の皮膚に適用されます。小さなハサミを使用して、胸郭のすぐ下に小さな切開 (2 cm) で腹壁を開きます。横隔膜から肝臓を分離し、ゆっくりと横隔膜の胸腔内15の公開を切り取ります。</li>
		<li>両側に胸郭をカットし、左心室を公開するためにカットの胸骨を修正します。左心室の後部の蠕動灌流システムに接続されている 21 ゲージ蝶針を挿入します。</li>
		<li>右心房を穴をあけるとすぐに (10 s) 血清採血管に血液 (と最後カットオフ) 1 mL ピペット チップを使用して胸腔内に放出の 200-300 μ L を収集して氷の上保存します。 注: この灌流プロシージャは非生存です。</li>
		<li>血液を収集すると、すぐに灌流システム (10-12 rpm, 5 mL/分) に切り替えるし、暖かい (RT) 1x PBS で 3 分のための動物を灌流 (Ca の無料2 +/Mg2 +イオン)。 注: PBS 含んでいる Ca2 +/Mg2 +イオンはより良い心臓の活動の灌流中に利用できます。灌流に使用される PBS の合計量は 15 〜 20 mL の範囲内です。</li>
		<li>肝臓の色に注意して灌流品質を評価する腎臓灌流後ホワイト/ペールに表示されます。 注: 腎臓や肝灌流必ずしも大動脈から脳が特に心房穿刺中に手順 3 で準備中に破裂を得る動脈 (頸動脈・椎骨) 到達として脳血流。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ティッシュの処理
<ol><li>オルガン コレクションとストレージ
	<ol>
<li>灌流末、頚部転位と収穫脳と腎臓によって動物の死を確認します。脳血流を脳 (髄膜の血管で目に見える血) の色によって灌流の品質が良い場合、透磁率の解析から動物を除外するを確認します。メス (図 1) を使用して 2 hemibrains に脳を分けます。</li>
		<li>メスの 1 つ hemibrain の嗅葉と小脳の無料で解剖し、大脳半球を 2 mL チューブに転送します。小脳の透水性評価に必要な場合、その他のチューブでヘミ小脳を格納します。</li>
		<li>1 つの腎臓を別の 2 mL チューブに転送します。ドライアイスにサンプルをすぐに保存します。</li>
		<li>組織-tek 社最適切削温度 (O.C.T) ドライアイスの化合物で残りの腎臓とヘミ脳 (小脳と嗅葉から成る) をネイティブで埋め込みます。</li>
		<li>最終的には、遠心分離機の 10、000 g、4 ° C で 10 分間で血清採血管で氷の上保存血液サンプル血清培養上清を 1.5 mL チューブに転送し、ドライアイス コンテナーに配置します。</li>
		<li>さらに処理まで-80 ° C の冷凍庫にドライアイスで収集されたすべてのサンプルを転送します。 注:、凍結融解後の均質化効率の増加として均質化の手順に進む前にサンプルを凍結することが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>均質化および遠心分離
	<ol>
<li>氷-80 ° C でダウン凍結ヘミ大脳と腎臓のサンプルを解凍し、臓器を含むチューブの重量を量る。これらの重みから組織重量を得るためのいくつかの空管 (約 20) の平均値を減算します。追加 300 μ L、200 μ L 冷 1 の腎臓とヘミ-大脳をそれぞれ含むチューブ X PBS。 注: (ヘミ小脳、100 mg 以下) のような組織の量を減らすため個々 のチューブを計量することをお勧めします。</li>
		<li>約 15 ストロークを実行することによって電気のオーバーヘッド攪拌 (1, 000 rpm) に接続されているポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 杵と元エッペン チューブ内の各サンプルを均質化 (1 ストロークを 1 と 1 を =)。サンプルの間に PBS で杵を洗い、次のサンプルに進む前に乾燥拭いてください。 注: 螢光を潜在的な干渉により均質化時に洗剤の使用を避けた。ただし、組織を徹底的に均質化、1 つのラウンドの凍結融解後、どちらがより効率的に細胞内のトレーサーがこのプロトコルで検出されたも。</li>
		<li>光と卓上遠心分離機で 4 ° C、20 分 15,000 g で最後にすべて一緒に遠心から保護されている氷の上の均質化のサンプルを格納します。即時蛍光または後で解析する-80 ° C で氷の上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光測定と定量化
	<ol>
<li>前の手順の最後に固定されている場合は、氷の上箔と光から守り-80 ° C で保存組織培養上清、血清サンプルを解凍します。</li>
		<li>黒 384 ウェル プレートに希釈血清 (30 μ L 1 × PBS + 20 μ L の血清) または組織培養上清 (として) の 50 μ L をピペットします。適切な背景差分を確保するため血清および組織培養上清の偽動物から少なくとも 1 つのサンプルは、この組織ホモジネートの背景は通常希釈剤として使用される PBS のそれより高い。 メモ: 3 偽動物の平均は偽蛍光値 (データは示されていない) に非常に小さな変動が観察されたが、自発に使用できます。また脳サンプルなど低蛍光サンプルの信号対雑音比を高めることができる PBS で希釈して使用される血清の量を減らせます。40 μ L の PBS で希釈し最大 10 μ L の血清を調べた。泡が井戸に存在しないことを確認します。</li>
		<li>384 ウェル ブラック プレートをプレート リーダーに挿入し、蛍光測定を選択する新しいスクリプトを開きます。</li>
		<li>ゲインを最適に設定し、それぞれ TMR や FITC dyee の 550/580 または 490/520 の励起/蛍光 (nm) の値に使用生蛍光ユニット (RFUs) を取得する測定を開始します。</li>
		<li>プレート リーダーから未加工の蛍光ユニット (RFUs) を使用して、対応する偽値を差し引いた透磁率指数 (PI) を計算します。<ol>
<li>
* 透水性インデックス(mL/g)= (組織 RFUs/g 組織重量)/(血清血清 RFUs/mL)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>例の計算脳透磁率指数 (PI) 動物 GOF1 (表 1):<ol>
<li>GOF1 脳 RFUs - 偽脳 RFUs 154 22.5 を = = 131.5</li>
			<li>GOF1 血清 RFUs - 偽血清 RFUs 38305 27 を = = 38278</li>
			<li>脳の重量 (g) = 0.195</li>
			<li>血清量 (ml) = 0.02</li>
			<li>脳の透過性インデックス (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 注: 透磁率指数の計算は、絶対と同等の実験と組織型との間にある値を得られます。これらはしかし 2 グループ12間の比較の容易さのための比率として表示できます。1 まだ維持間の動物変化対照群をコントロール グループ平均を運転、制御グループの平均 PI と両方のグループで各動物の PI を割ることによってこれを実現できます。この変換は、1 に設定されて、コントロール グループを基準にして実験的グループ (またはグループ) の値を提供します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>トレーサーの蛍光可視化
	<ol>
<li>クライオスタットのセクションは-20 ° C に設定し、室温で置かれたスライドをセクションを転送 10 μ m に組織-tek 社化合物 (O.C.T) (ステップ 2.1) でネイティブに埋め込まれた腎臓/ヘミ-脳ブロックをカットします。セクション乾燥 (約 30 分)、一度転送は使用するまで-80 ° C のフリーザーにスライドします。</li>
		<li>染色の日に 10 分、37 ° C でスライドを解凍し、PBS でクイック洗濯後室温で 10 分間 4 %paraformaladehyde (PFA) のセクションを修正します。</li>
		<li>室温で 1 時間 0.5% トリトン X-100 pH 7.5 1 %bsa を含む滅菌 PBS の透過/ブロック バッファーのセクションを孵化させなさい。</li>
		<li>CD31 一次抗体と室温で 1.5 h のスライドを孵化させなさい (0.5 mg/ml、クローン メック 13.3)、トリトン X-100 (pH 7.2) PBS の 3 つの 5 分洗浄後滅菌 PBS、0.5% BSA 0.25% を含むバッファーの 1: 100 で希釈しました。</li>
		<li>蛍光標識抗体希釈 1: 500 (2 mg/mL) の種特異的に室温で 1 時間上のバッファーの二次抗体の孵化を実行します。CD31、1: 500 の希釈でヤギ抗ラット 568 アレクサやアレクサ 488 を使用できます。DAPI を含める (300 μ M) 二次抗体で、核を染色する (1:1、ストックから 000 希釈) をミックスします。</li>
		<li>アクア polymount とステンド グラスのセクションをマウントし、暗闇の中で常温で重合のために一晩置いておきます。</li>
		<li>スペクトル イメージング共焦点レーザー スキャン顕微鏡システムを使用して画像を取得します。NIS 要素ソフトウェア (バージョン 4.3) によってイメージを分析します。モンタージュの数字の生成のため、Photoshop などのソフトウェアを使用できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

血液脳関門の機能障害は、プライマリとセカンダリの脳腫瘍や脳卒中を含む神経疾患の数に関連付けられます。BBB 破壊はしばしば命にかかわる中枢神経浮腫を関連付けです。開始の分子機構の解明や BBB の閉鎖したがって神経疾患一般の治療的意義の調査の研究者。ただし、調査方法は蛍光画像17,18の面倒で主観的な定量化に依存する技術的な問題に関連付けられている、BBB 透過性体内の報告は本邦では、します。,19します。 さらに、メソッドのいくつかは、それはより堅い障壁を形成しない表面的な脳血管の透過性を示すものとして虚偽は全脳蛍光イメージング。動物は多くの場合重要な血液分画による誤った解釈につながる灌流客観的脳組織吸光度 (例えばエバンス ブルー透過性評価) に基づく定量化が実行されているときでも。脳の重量は、透磁率の計算に含まれていない多くの場合、血管透過性に起因する浮腫、重量が増加し、純の透過性を変更する必要があります別の変数です。さらに、セ...

血液脳関門 (BBB) は、基底膜の鞘は、密接に関連するペリサイト (Pc)、および自分の終わり足の1 で基底膜を包むアストロ サイト (ACs) でサポートされている微小血管内皮細胞 (Ec) で構成されています ,2。ECs は、いくつかの細胞の種類をサポートし、主に ACs と Pc、バリア機能を調節すると対話も神経細胞とミクログリア、すべての一緒にユニットを形成、神経血管 (NVU)。NVU は、血液媒介性毒素や脳を入力してから病原体の輸送を制限する BBB の機能にとって重要です。この関数は、ECs ともトランスポーター p 糖タンパク質 (P ・ gp) その流出内皮を入力分子に戻すなどの操作のために存在するクローディン 5, オクルーディン, 精巣毛細血管-1, などタイト結合分子の結果1,ルーメン32,船。ただし、BBB は EC 膜1,2,3で表現される特定のトランスポーターで栄養 (ブドウ糖、鉄、アミノ酸) など重要な分子の輸送のためできます。EC 層は内腔 (血側) と特定とベクトル輸送機能報4,5 ように abluminal (脳向け膜) の間様々 なトランスポーターの分布に関して高偏極します。.BBB は中枢神経系の環境をしっかりと規制に関して保護、機能 BBB とパーキンソン病などの疾患に CNS ドラッグデリバリーのための大きな課題です。BBB 機能障害神経疾患でもバリア機能障害はアルツハイマー病 (AD) のように、例えば特定のトランスポーター ターゲットへの損傷を含めることができます、特に脳薬物送達が増加することを想定できません。広告で LRP1、怒り、P gp などいくつかのアミロイド β のトランスポーターが調節不全として知られている、無駄な6,7、8をかもしれないそれ故にこれらの運送者を対象とします。BBB は、ストローク、広告、髄膜炎、多発性硬化症と脳腫瘍9,10,11などのいくつかの神経疾患の障害です。治療戦略の重要な部分は、バリア機能を回復させる、従ってその評価は重要です。
この仕事については客観的かつ我々 正しく適用されているマウスのいくつかの行に両方実験的な遺伝子疾患モデル10,12,13 齧歯動物で透水性の試金のための量的なプロトコル ,14。メソッドは、血管コンパートメントからトレーサーを削除するマウスの灌流が続く蛍光トレーサーの単純な腹腔内注射に基づいています。脳や他の臓器が収集した記事の灌流および透水性の客観的評価と蛍光プレート リーダーで組織ホモジネートの測定に基づく絶対透磁率インデックス。組織ホモジネートまたは任意のトレースを受け取りません偽動物からの血清を使用して背景のすべての未加工の蛍光値が修正されます。十分な正規化は、血清量、血清蛍光組織、従って絶対と同等の実験と組織型との間にある透過性インデックスを降伏の重量に含まれます。グループ間の比較を容易にするため絶対浸透率のインデックス値容易に変換できる比率と我々 は以前に12を実行していた。同時に、ストアド ヘミ脳や腎臓に利用できる可視化トレーサー蛍光顕微鏡10。古典的な蛍光顕微鏡とはいえ面倒な切片と半定量分析のためのイメージの主観的な選択のために透磁率の地域差を取得する価値があります。プロトコルの詳細な手順が表示されます、適切な場所にノートが追加されます。これは、他の小動物にスケーリングすることができますマウスの体内透過性アッセイを正常に実行するために必要な情報を提供します。アッセイは、トレーサーの多くの種類に適用できる特異的な蛍光スペクトルとトレーサーの組み合わせによって透過性評価に基づいた料金とサイズを可能にします。

<table><tbody><tr><td>テトラメチルローダミン(TMR)デキストラン3kD</td><td>サーモスフィ</td><td>ッシャーD3308</td><td></td></tr>フル<tr><td>オレセインイソチオシアネート(FITC)デキストラン3kD</td><td>サーモスフィ</td><td>ッシャーD3306</td><td></td></tr>ケ<tr><td>タミン(ケタベ)</td><td>ゾエティス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン(ロンプン)</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9%生理食塩水</td><td>フレゼニウスカビドイツGmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T化合物</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルマルデヒド溶液</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>4% 溶液</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン、フラクション V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗 CD31 抗体、クローン MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ラットアレクサ568</td><td>分子プローブ</td><td>A-11077</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ラットアレクサ488分子</td><td>プローブ</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>アクアポリマウント</td><td>ポリサイエンス株式会社</td><td>1860621</td><td></td></tr><tr><td>ゲージバタフライニードル</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>血清コレクションチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech精密ワイプ ティッシュワイパー</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルブラックプレート</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>スライド スーパーフロストプラス</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 乳棒</td><td>ウィートン</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>電動オーバーヘッドスターラー</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 スペクトルイメージング 共焦点レーザー走査型顕微鏡システム</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動灌流システム</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超小型遠心機</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

血液脳関門 (BBB) は、毒素や病原体循環から脳微小環境を保護し、脳の恒常性を維持する特殊なバリアです。バリアの主な場所はタイトジャンクショ細胞間と細胞膜に発現排出トランスポーター起因するバリア機能が脳の毛細血管の内皮細胞です。この関数は、ペリサイトおよび単位 (NVU) を形成しているアストロ サイトによって規制されています。脳卒中、アルツハイマー病 (AD) などいくつかの神経疾患脳腫瘍は BBB 機能障害に関連付けられます。BBB 透過性の評価は神経疾患の重症度と治療戦略を採用の成功の評価に重要なため。
いくつかのマウスに正常に適用されている堅牢な透磁率測定モデル遺伝的および実験両方まだここで単純なを提示します。メソッドは、定量性は一般的に適用される顕微鏡によるトレーサー蛍光分析と比較して客観的にです。このメソッドは、マウスはマウスを麻酔続いて水性の不活性蛍光トレーサーのミックスと腹腔内注入されます。動物の心臓の血流は、脳、腎臓や他の臓器を収穫する前に実行されます。臓器の均質化し、遠心上清からの蛍光測定が続きます。直前に灌流心臓穿刺から採血血管コンパートメントに正規化の目的提供しています。組織蛍光が量的に入手するぬれた重量および血清蛍光に正規化されたトレーサー透磁率インデックス。追加の確認のため蛍光可視化用トレーサー対側の半脳免疫組織化学のために保存を利用できます。

我々 は最近、アンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) マウスではある健康の条件10の高いコントロール マウスより脳血管透過性を示しています。脳卒中誘発マウス、GOF マウスが大きな梗塞サイズは、コントロールの同腹子より大きな透磁率を持っていたことを示していますがだった。これらの結果は、BBB で透磁率にアン 2 の重要な役割を表示します。プロトコルは、GOF マウスを利用したがって、体内透過試金を記述する同腹子を制御するそれらを比較します。ただし、このメソッドは、疾患モデル、遺伝子組換えマウスの任意のモデルに適用することができます。 または BBB 透過性を変更我々 は、 10、11,12,13では以前と同じ治療薬。
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血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

この手順の全体的な目標は、蛍光標識トレーサーを使用してマウスの脳血管系の透過性を評価し、動物モデルの血液脳関門機能障害を評価することです。この方法は、疾患における神経血管透過性とその治療後の回復に関連する血液脳関門領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、シンプルで定量的であることです。これにより、定量的な蛍光測定法による透過性の評価と、局所防御のための蛍光顕微鏡法による透過性の評価を同時に行うことができます。この技術の意味は、脳腫瘍、脳卒中、アルツハイマー病などのいくつかの神経疾患の診断と治療にまで及びます。これらの疾患は、生命を脅かす脳浮腫と、主要な治療標的としてのBBD機能の改善に関連しています。手順の一部を実演するのは、研究所の科学技術担当官であるJadranka Macas氏です。マウスに100マイクロリットルの2ミリモルトレーサー溶液を腹腔内注射します。FITCで標識されたデキストランや、色素間の干渉を最小限に抑えるために明確な励起発光スペクトルを持つTMRなどのリジン固定可能なトレーサーを選択してください。トレーサーを組み合わせる場合は、200マイクロリットルの混合トレーサー溶液を腹腔内に注入します。.自家蛍光バックグラウンド減算の偽コントロールとして機能するビヒクルのみの注射を含めます。各注射後、承認された施設のプロトコルに従ってマウスに深く麻酔をかける前に5分間待ちます。麻酔薬投与の10分後に動物を心臓灌流のために準備します。マウスが麻酔の外科的平面に到達したことを確認するために、足のけいれん反応がないことを確認してください。灌流するマウスを背中に置き、腹部の皮膚に80%エタノールを塗布します。小さなハサミを使用して腹壁に2センチの切開を作成した後、肝臓を横隔膜から分離し、次に横隔膜をゆっくりと切り込み、複数の空洞を露出させます。胸郭を両側に切り、切り取った胸骨を固定して左心室を露出させます。蠕動灌流システムに接続された21ゲージのバタフライ針を左心室後部に挿入します。右心房に穴を開けてから、端を切り取った1ミリリットルのピペットチップを使用して、放出された血液の200〜300マイクロリットルをすばやく収集し、血清収集チューブに移します。集めた血液を氷上に保存します。採血後すぐに灌流システムのスイッチを入れ、室温のカルシウムとマグネシウムイオンフリーのPBSを動物に3分間灌流します。灌流後に青白く見える肝臓と腎臓の色に注意して、灌流の品質を評価します。脳を採取した後、髄膜の血管に血液が見えないことを確認します。灌流品質が悪い場合は、サンプルを透過性分析から除外する必要があります。メスを使って脳を2つの半脳に分けます。次に、片方の半脳から小脳と嗅葉を解剖し、半大脳を2ミリリットルのチューブに移します。採取した腎臓を別の2ミリリットルのチューブに入れます。すぐにサンプルをドライアイスの上に置きます。残りの腎臓と半脳を小脳と嗅葉をそのままTissueTechの最適な切断温度コンパウンドにネイティブに埋め込み、ドライアイスの上に置きます。最後に、血液サンプルを摂氏4度で10,000Gで10分間遠心分離した後、血清上清を1.5ミリリットルのチューブに移し、ドライアイス容器に入れます。サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に移し、凍結融解後に均質化効率が向上します。半大脳と腎臓のサンプルを氷の上に置いて解凍し、臓器を含むチューブの重量を量ります。これらのウェイトから、約 20 本の空のチューブの平均値を差し引いて、組織の重量を求めます。腎臓を含むチューブに300マイクロリットルの冷たいPBSを追加し、半大脳を含むチューブに200マイクロリットルを追加します。元のマイクロチューブ内の各サンプルを、電動オーバーヘッドスターラーに取り付けられたPTFE乳棒で、約15ストロークを使用して均質化します。均質化されたサンプルは、光から保護された氷上に保存します。サンプルの間にPBSで乳棒をすすぎ、拭いて乾かしてから次のサンプルに進みます。すべてのサンプルが均質化されたら、15, 000 Gおよび摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離後、上清を氷上の新しい1.5ミリリットルチューブに移してから、蛍光測定と定量に進みます。上清を384ウェルプレートに移し、プレートを蛍光リーダーに挿入します。トレーサーに正しい励起波長と発光波長が含まれていることを確認し、ゲインを最適に設定します。測定を開始し、データをスプレッドシートとしてエクスポートして、プロトコルに記載されているように計算を実行します。染色当日は、スライド上に載せた10ミクロンのクライオスタット切片を37°Cで10分間解凍します。次に、切片を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、続いてPBSで急速洗浄します。1%PSAおよび0.5%Triton X-100を含む滅菌PBSで室温で1時間インキュベートすることにより、切片内の非特異的結合を透過処理し、ブロックします。ブロッキング後、スライドを1:100に希釈したCD31一次抗体と室温で1.5時間インキュベートします。PBSで3回、各5分間洗浄した後、種特異的蛍光標識抗体を用いて室温で1時間二次抗体をインキュベートします。染色した切片をアクアポリ/マウントでマウントし、暗所で室温で重合するために一晩放置します。最後に、スペクトルイメージング共焦点レーザー走査型顕微鏡システムを使用して画像を取得します。透過性アッセイのトレーサー循環時間を確立するために、トレーサー注入後15分という短い循環時間と比較して、2時間という長い循環時間を比較します。循環時間が 2 時間という長いため、腎臓へのトレーサーの蓄積量が少なくなりますが、循環時間は 15 分と短い場合、血管コンパートメントから緑色で示されているクリアランスが高いためである可能性があります。この影響は、血液脳関門が密集しているため、脳内ではさらに劇的です。赤いチャネルに見られるCD31染色は、検査した時点と脳の両方の時点で腎臓に血管が存在することを確認しました。この手法を習得すると、2人の科学者が協力して10匹のマウスで5〜6時間以内に実行できます。この手法を試みる際には、血液脳関門の透過性に関する質問に答えるために、適切な分子量、チャート、および蛍光特性のトレーサーを使用することを忘れないでください。この手順に続いて、BBDの免疫組織化学や因子の疾患充填などの他の方法を実行して、疾患部位の重症度や局在などの追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、フルオレセインナトリウム分子を使用してin...

血液脳関門模倣透過性アッセイ:トレーサー分子に対するBBB模倣物の透過性を評価するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、EAEマウスモデルにおける血液脳関門の破壊を評価する手順を示しています。さまざまなサイズの蛍光色素が眼窩後方向に注入され、脳の血管を循環します。小さい色素は隙間から脳組織に漏れますが、大きい色素は混乱が深刻な場合にのみ入り、バリア損傷の程度と相関します。...

EAEマウスモデルにおける蛍光色素を用いた血液脳関門破壊の決定

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。...

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

ラット脳微小血管内皮細胞とアストロサイトの共培養に基づく血液脳関門のin...

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

本研究では神経変性条件下で血液-脳関門の破壊を評価するための簡単で効率的な手順を提案する.我々 の目的を達成するために我々 は高分子量かにラベル (FITC)...

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

中枢神経系腫瘍にターゲティングは大きな課題です。ここで我々 はマウスやヒトの細胞を用いた血液脳腫瘍関門の in vitro...

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本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo...

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

本研究では、フルオレセインイソチオシアネート標識(FITC)デキストラン を経口強制 投与してマウスに投与し、 in vivo...

フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

血液脳関門(BBB)の破壊による色素の血管外漏出を可視化する方法として、異なる時点のマウスに2種類の蛍光色素を投与することで可視化する方法を開発しました。グリセロールを凍結保護剤として使用すると、同じサンプルでの免疫組織化学が促進されました。...

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

このプロトコルは、エヴァンの青色色素ベースの評価を使用して、成体ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)モデルの血液脳関門(BBB)の完全性を評価する信頼性の高い方法を提示し、神経血管破壊の定性的分析と定量的分析の両方を可能にします。...

ゲートキーパーの視覚化:成体ゼブラフィッシュにおける血液脳関門透過性のEvanの青色色素ベースの評価

学ぶマウス血液脳関門透過性アッセイ法。蛍光トレーサー腹腔内投与による定量的・視覚的評価で、脳血管透過性を測定し、神経疾患における治療効果と回復メカニズムの解明に貢献します。

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

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