凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

オルガノイドは、生体内の腸上皮の多くの分子的特徴だけでなく、ネイティブの構造組織を再現するので、この技術は、実験室での正常な生物学や病気の状態を研究することができます。この技術の主な利点は、細胞毒性の低い非常に高効率な伝達アプローチを使用してオルガノイドを遺伝子操作する能力であり、したがって、これらの遺伝子操作されたオルガノイドの機能研究を可能にする。この技術の意味は、腸のオルガノイドを薬物やその他の薬剤や介入にさらす可能性があるため、腸疾患の治療にまで及んでいます。

この方法は、乳房組織などのオルガノイド培養や標準的な2D条件下で増殖する細胞に適した他のシステムにおける発達および病理学的プロセスの研究に適用することができる。一般的に、この方法に新しい個人は、操作が困難なオルガノイドまたは他の細胞での伝達で成功します。オルガノイドや幹細胞を形容する困難に遭遇したとき、私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていました。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、サンプルが凍結切断のために地下マトリックスに埋め込むプロセス中に適切に処理されない場合に発生する可能性があり、オルガノイドの構造的損失が起こり得るので重要である。ウイルス伝達のためのオルガノイドを成長させるために、48ウェルプレートで1ウェルあたり200マイクロリットルのトランスダクション培地を含む種子オルガノイド細胞培養物を、標準組織培養インキュベーターでインキュベートする。ウイルスのバイアルをトランスダクション用に解凍し、48ウェルプレート内の各ウェルの導入に約50マイクロリットルの濃縮ウイルスを可能にする。

1.5ミリリットルのチューブで、磁気ナノ粒子溶液の12マイクロリットルとウイルスを混合し、室温で15分間インキュベートします。15分後、磁性ナノ粒子溶液とウイルス混合物を細胞に加えて、細胞を導入する。48ウェルプレートを磁気プレートの上に置き、少なくとも2時間は標準的な組織培養インキュベーターでインキュベートする。

ウイルストランスフェクションが完了したら、感染したオルガノイド細胞クラスターとトランスダクション培地を各ウェルから1.5ミリリットルチューブに移します。5分間500回gで遠心分離機。優しい吸引で上清を捨て、氷の上にペレットを含むチューブを5分間冷却します。

各チューブに120マイクロリットルの基底膜マトリックスを加え、ゆっくりと上下にピペット処理してペレットを再懸濁します。マトリックス-セル混合物の30-マイクロリットルのシード滴を新しい48ウェルプレートに入れます。マトリックスが固まるまで、プレートを摂氏37度で5~15分間インキュベートします。

各ウェルに伝達媒体を加え、標準組織培養インキュベーターで3〜4日間インキュベートする。3~4日後、10倍の倍率で光顕微鏡で培養を検査し、細胞クラスターをオルガノイド構造に組織化します。各ウェルのトランスダクション媒体を250マイクロリットルのオルガノイド培養ENR培地にそっと交換してください。

プレートをインキュベーターに戻します。この手順は、ENR培地を穏やかな吸引により除去し、基体膜マトリックスを摂動しないように注意して行います。PBSを500マイクロリットルで軽く洗います。

オルガノイドを1ウェルあたり4%パラホルムアルデヒド溶液の1マイクロリットルを加えて固定し、室温で30分間インキュベートします。30分後、パラホルムアルデヒド溶液を吸引して取り除きます。PBSを井戸あたり1マイクロリットル軽く加え、穏やかな吸引でPBSを取り除きます。

このようにして、PBSで2回洗浄する。2回目の洗浄からPBSを取り出し、各サンプルに30%スクロースバッファーの1マイクロリットルを加えます。サンプルを脱水するために摂氏4度で1時間、スクロース中の固定オルガノイドをインキュベートします。

スクロースバッファーを吸引して取り外し、各ウェル内のマトリックス層を覆うのに十分な埋め込み化合物を追加します。室温で5分間インキュベートします。次に、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に10分間、または埋め込み化合物が固体と白になるまで置きます。

室温で凍結埋め込み化合物とプレートを置き、エッジに沿って化合物を最小限に溶かすことができます。メスやへらを使用して、井戸の壁からブロックを分離します。溶融を防ぐために迅速に作業し、鉗子を使用してマトリックス埋め込み化合物ブロックを除去し、それを標本ブロックに入れます。

埋め込み化合物で完全に金型を充填します。断面にブロックを使用する前に、マイナス80°Cで30分間凍結します。このプロトコルは、GFPにリンクされたレンチウイルスベクターを用いた腸オルガノイドを最初に導入することによって最適化された。

GFPは、嚢胞様構造に組織化する初期の段階や、オルガノイドが芽を形成する後の時点を含め、オルガノイド発症の各段階で視覚化された。正常に整流した腸器官は、ホルマリン固定、凍結切除、免疫蛍光イメージングによって分析された。この画像では、核は青色で染色され、緑色は上皮細胞接着分子を示し、細胞の境界を区切ります。

赤は、パネス細胞を識別するためのリソソーム染色を示しています。いったんマスター化すると、オルガノイドのトランスデューシングは約3時間で行い、オルガノイドのクリセクション埋め込みは約2時間半で行うことができます。この手順を試みる際には、地下マトリックス試薬を扱う際に氷上で作業することを忘れないでください。

この手順を完了した後、免疫蛍光分析およびタンパク質またはオルガネラを検出する他の方法を行い、局在または相対的な存在量を評価することができる。この技術は、研究者が正常な生物学や病気の状態を調べる方法を開き、トランスデューセドされたオルガノイドまたは細胞をマウスに移植できる場合はインビボ研究にも利用できます。このビデオを見た後、あなたは、凍結切断のためのオルガノイドを遺伝子操作するために磁気標識ウイルスを使用する方法をよく理解している必要があります。

ウイルスの操作は非常に危険であり、適切な保護具を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。