血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

この実験方法の全体的な目標は、経時的な血管形成の動的プロセスを視覚化し、定量化することです。この方法は、血管形成と血管新生の分野における、血管形成の速度と形成されたネットワーク構造パターンの違いに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、多数の血管形成時点の定量化を可能にし、血管形成プロセスの動力学を評価する機会を提供することです。

この方法は、個々の細胞集団または共培養システムの研究のために、血管新生または血管新生のプロセスに影響を与える任意の細胞集団または病理学的状態に適用することができます。実験開始の約1〜2時間前に、Microscope Stage Top Incubatorを37°Cに予熱し、二酸化炭素を5%、湿度を85%に設定しますインキュベーターの湿度リザーバーが空の場合はインキュベーターの湿度リザーバーを満たします。生細胞チャンバーを顕微鏡に置き、次に、空のチャンバースライドを生細胞チャンバー内の2つの空位置のいずれかに配置します。

スライドに蒸留水を入れ、二次ブロワーを摂氏39〜42度に設定して、スライドを下から加熱し、結露を最小限に抑えます。生細胞イメージングチャンバー内の適切な温度と湿度を維持することは、実験の成功に不可欠です。実験スライドを追加できるようになるまで、2 番目のスライドを空白として追加します。

次に、2 番目のスライドで井戸を囲む貯水池に水を追加して、イメージング実験中の条件を模倣します。実験チャンバースライドに基底膜マトリックスをロードするには、まず20マイクロリットルのピペットに冷たい20マイクロリットルのピペットチップをロードし、ハサミを使用してチップの端から約1cmを切り取ります。ピペットの容量を10マイクロリットルよりわずかに大きい値に設定し、マトリックスをゆっくりと修正したピペットチップに吸引します。

すぐにピペットチップを1つのスライドウェルの中央に置き、チップをウェルの底にそっと触れ、プランジャーをゆっくりと押し下げてマトリックスを押し出します。15ウェルすべてにマトリックスを追加した後、蓋をスライドに完全に押し込みます。マトリゲルボリュームを各ウェルに正確かつ一貫してピペッティングすることは、高品質の位相コントラスト画像を得るために重要です。

次に、スライドを摂氏37度で30〜60分間、2〜3ミリリットルのPBSで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブキャップの隣に置き、マトリックスの脱水を減らします。マトリックスが固まったら、一晩培養した内皮コロニー形成細胞培養物から上清を取り除き、7ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引し、37°Cで2〜3ミリリットルのトリプシンで細胞を2〜5分間洗浄し、剥離します。

次に、解離した細胞を3ミリリットルの内皮増殖培地-2に再懸濁して細胞塊を分解し、得られた細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。すべての内皮コロニー形成細胞サンプルを再懸濁した後、遠心分離により細胞をペレット化し、ペレットを1〜2ミリリットルの新鮮な内皮増殖培地に再懸濁します。各サンプル中の生細胞の数を数え、十分な内皮コロニー形成細胞を新しい1.5ミリリットルチューブに追加して、細胞を中濃度175マイクロリットルあたり10〜4番目の細胞の1.4倍に希釈できるようにします。

次に、各マスターミックスを穏やかなピペッティングで混合します。スライドの蓋を取り外し、各マスターミックスの50マイクロリットルをウェルごとにスライドに三重に譲ります。細胞を画像化するには、ブランクスライドを1つの実験スライドに置き換え、スライド上の細胞を囲むリザーバーに水を追加します。

各ステージ位置を循環し、最初のウェルの中心が選択されていることを確認します。ウェルに播種された細胞に着目し、ステージのZ位置を設定します。設定が正確なら、ライトを消してイメージング実験を開始します。

イメージングが完了したら、Image Captureソフトウェア内で画像スタックファイルをスケーリングしてエクスポートし、画像を分析用にTIFFファイルとして保存します。画像を分析するには、Kinetic Analysis of Vasculogenesisファイルをそのフォルダからソフトウェアウィンドウの下部にある灰色のバーにドラッグしてソフトウェアを開き、[保存]をクリックしてソフトウェアをリストに追加します。[ファイル]と[開く]をクリックして開く画像ファイルを選択するか、画像ファイルをソフトウェア内の灰色のバーにドラッグします。

[画像]、[調整]、および[明るさ/コントラスト]をクリックして、[明るさ/コントラスト]ウィンドウを開きます。[明るさ/コントラスト]ウィンドウ内で[リセット]をクリックして、画像を視覚化します。次に、[画像]、[タイプ]、および[8ビット]をクリックして、画像を8ビットに変換します。

[ツール] と [関心領域マネージャー] を選択し、適切な形状の選択ツールを使用して新しい関心領域を作成します。[追加] をクリックして [関心領域マネージャー] ウィンドウに関心領域の形状を追加し、[関心領域マネージャー] の [関心領域] ラベルをクリックして画像上の領域を表示します。必要に応じて、関心領域を調整します。

領域が配置されたら、「イメージ」、「切り抜き」の順にクリックして、イメージを切り抜きます。次に、[編集] メニューを開き、[外側をクリア] を選択して、スタック内のすべての画像の関心領域の外側の画像データを削除します。次に、[プラグイン] メニューを開き、[Analyze Network] プラグインを選択します。

ポップアップ ウィンドウのドロップダウン矢印を使用して [しきい値処理方法] を変更し、[OK] をクリックしてソフトウェア処理を開始します。解析の最後に、データ テーブルと、スケルトンとマスクのレンディションを示す融合画像のスタックが開きます。「ファイル」および「名前を付けて保存」をクリックして、数値をスプレッドシートに転送し、生データ値を含むスプレッドシートを保存します。

融合したスケルトンとマスクの画像をクリックし、融合したスケルトンマスクの画像スタックとクロップされた位相差の画像スタックをTIFFファイルとして保存します。次に、[関心領域マネージャー]ウィンドウをクリックし、画像のトリミングに使用する関心領域を選択し、[その他]と[保存]をクリックして、将来の使用のために関心領域を保存します。血管形成の動態解析によって同定された内皮コロニー形成細胞ネットワークは、ソフトウェアが定量化に使用する構造を示すために、スケルトンおよびマスク表現として図表されます。

位相コントラスト画像の品質が高く、十分なコントラストが達成された場合、血管形成のキネティック解析は、位相コントラスト画像と血管形成のキネティック解析で生成されたスケルトンおよびマスク表現との間に観察された類似性によって示されるように、内皮コロニー形成細胞ネットワークを正確に特定します。位相差画像に高コントラストがない場合、またはグリッディングなどのイメージングアーチファクトが発生すると、ネットワーク検出の精度が低下し、結果があいまいになります。ただし、ここに示す [平均] や [Otsu] などのさまざまなしきい値処理方法を解析前にソフトウェア ドロップダウン メニューで選択して、画像品質の違いに対応できます。

血管形成の動態解析を使用して、妊娠糖尿病に曝露した内皮コロニー形成細胞がネットワーク形成の変化した動態を示すかどうかを判断すると、合併症のない妊娠からの内皮コロニー形成細胞培養と比較して、妊娠糖尿病培養におけるネットワーク構造形成の不均一に変化したことが明らかになります。実際、合併症のない妊娠サンプルは、通常、妊娠糖尿病サンプルと比較して、より多くの閉鎖ネットワークを形成します。しかし、すべての内皮コロニー形成細胞サンプルは、全体的にネットワーク形成の二相性パターンを示していますが、形成速度と達成されるネットワークの最大数はサンプル間で異なります。

この手順に続いて、血管形成の動的解析によって生成されたデータ値をグラフ化および分析して、異なるサンプルによって形成されるネットワーク構造が統計的に異なるかどうか、また異なる場合はどの時点で異なるかを判断できます。血管形成のカイネティック解析は、大量の画像を含むタイムラプス実験の効率的な処理を可能にします。一度習得すると、すべてのシステムが適切に機能していれば、画像の取得、後処理、および分析を2日で完了できます。