Name: 血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶ血管発生の運動論的解析法。Matrigel上で内皮コロニー形成細胞を培養し、位相差顕微鏡によるタイムラプス撮影とKinetic Analysis of Vasculogenesisソフトウェアを用いて、血管ネットワーク形成の動態を定量的に評価します。

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著者認めるルーシー ミラー、リアン ・ ヘルナンデス、博士デビッド ・ ハース、ブルターニュ Yeley (インディアナ大学医学部)、博士カレン ポロック、ジュリー mund-、マシューがリパス、エミリー シムズ (インディアナ大学サイモンがんセンター循環器ビアコア)ECFC サンプルを派生することで優秀なテクニカル サポート。著者はまたジャニス壁 (インディアナ大学医学部) と同様に、学術的な議論のため夫妻 Maureen A. ハリントン、エドワード ・ f ・ Srour、リチャード n. 日、メルヴィン ・ c. ユッダー マティアス A. クラウズ (インディアナ大学医学部) を認める管理をサポートします。すべての画像は、生物顕微鏡、インディアナ大学医学部のインディアナ ・ センターで行われました。この作品は、国立衛生研究所 (R01 HL094725、P30 CA82709 U10 HD063094) とライリー子供財団によって支えられました。さらに、この出版物できた部分的なサポートと国立心臓、肺、血液研究所の国立衛生研究所から賞 # T32 HL007910 の下で。

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著者が明らかに何もありません。

KAV を有効に複数の時間ポイントを持つ大規模なデータセットの評価 従来、体外血管の定量が単一、または少数の時間ポイント測定から成っていた。この静的なアプローチは単に十分なをキャプチャし、動的で複雑なプロセスを定量化です。したがって、この手法は、血管の動的なプロセスに関与する潜在的な分子メカニズムに洞察力を得るためにネットワーク形成の速度論解析の効率を有効に開発されました。効率化と自動化は、生成し、大量の画像データを分析する手法の開発に重要なコンポーネントです。KAV は、時間と時間経過のデータ セットからの生物学的意味のある結論を得るために必要な労働力を削減する画像の数百から成る大規模な画像のスタックを分析に特に開発されました。重要なは、KAV 画像処理を行い小 (100 より小さい画像) の秒の問題でデータ生成画像のスタックとの分より大きい (100 枚以上) 画像のスタックは、その結果、比類のない効率。また、時間と測定パラメーターによってスプレッドシートにデータ組織はグラフィカル表示と統計分析の急速な生成できます。
このアプローチの成功のアプリケーションにおける課題 このアッセイには、画像の取得と解析の両方に改善が含まれますが、いくつかの課題は、実装を成功を妨げる可能性があります。4 主な障害、湿度安定性、めっきから画像取得、ソフトウェアとハードウェアの信頼性、および各実験用に生成された大量のデータの管理のタイミング精度があります。数時間にわたって安定した生きているセルイメージ投射は挑戦することができます。具体的には、適切かつ一貫性のある加湿は、イメージングの部屋に必要です。血管新生のスライドは、行列に基づく血管新生アッセイを並列化に設計したこの試金で使用されます。少量、約 50 μ L に蒸発・凝縮拡張培養条件の重要な考慮事項。この実験の問題に対処するため、湿度を調節するインキュベーターを使用する必要は。ただし、イメージングの商工会議所の過剰な乾燥時間をかけて発生した場合、この規制を強化する必要があります。湿度を増加する最も簡単な方法は商工会議所の水面の面積を増加することがわかった。この目標を達成するために我々 のプロトコルは、次の 3 つの水の源を示唆している: 2 番目の腔症スライドはあふれた水には保育器の温度を測定、周辺井戸のスライドと接液フィルター紙の上に水またはワイプします。逆に、部屋の空気冷却は、スライドの下部スライドと井戸に凝縮してチャンバー内湿度と結露が発生します。この合併症は、セルのメディアや位相コントラストが低下するレンズ効果の希薄化につながります。これらの研究で結露は、スライドの下部に熱風 (39-42 ° C) のアプリケーションを介して最小化されました。
任意のコマ撮りに関する重要な考慮事項は、実験開始とイメージングとの整合性です。イメージングの開始時のタイミングは、ダウン ストリーム イベントの解釈にとって重要です。この試金のタイミング精度を確保するため、初期のめっきと最初の画像の時点の間の時間を厳密に管理する必要があります。実習では、この「死んだ時間」を最小限に抑えることができますしかし、もっと重大それは比較する別日に実験できるように一貫したする必要があります。例えば、このプロトコルでは、約 30 分のデッドタイムを期待します。実験準備、画像検査施設の近さによって、これを促進することができます。
世俗的な詳細のような一見ソフトウェア、ハードウェアの安定性、およびデータ管理の重要なものに思えるかもしれない。ソフトウェアや関連するハードウェア ドライバー、ネットワーク環境と自動化されたソフトウェアは、ソフトウェアの安定性に影響を与えるすべてを更新します。それは価値がある「ドライラン」ボトルネックと画像の取得に問題の潜在的なソースを識別するためにこのプロトコルをテストはたとえば、信頼性の低い生きているセルのセットアップ、ステージ、シャッター、およびカメラの信頼性、および自動化されたオペレーティング システムとソフトウェアの更新に、制度上の情報テクノロジー ・ ポリシーを確認します。
データ管理は、画像の数千に数百を生成する任意のイメージング実験の継続的な問題です。幸いなことに、商用ソフトウェアは、しばしばイメージング実験を開始する前に使用可能な領域をチェックします。しかし、このアッセイには後のキャプチャ画像処理と解析のハード ドライブ スペースの負担を追加でき、干渉イメージング実験、使用可能なスペースが限られている場合も含まれます。さらに、セキュリティと、コンピューターの安定性は保証できません、同じディスクの冗長アレイなどのハードウェア ソリューションとも。したがって、継続的な実験と、堅牢なリモート アーカイブ、例えば機関アーカイブ リソース、コンピューターのハード ドライブ上の領域を確保するためのデータ管理戦略が必要です。
画像の品質を最大化する戦略 KAV のマトリックスの背景から ECFCs を正確に見分ける能力は堅牢なのですが、アッセイの感度、画像の品質に依存します。たとえば、低コントラストの画像には、ソフトウェアが以下の精度 (図 2B) 細胞ネットワークを検出するように設定されます。位相コントラストの品質は、顕微鏡の画像を取得するために使用の設定を含むいくつかの要因によって影響を受ける分析の準備と、ウエル内でメディアのレベルのメンテナンス中のマトリックスとの細胞懸濁液媒体の読み込み全体画像。これらの試金のための位相コントラストを最適化するため、顕微鏡の位相リング アライメントの微調整はコントラストを改善するために行われました。さらに、試料は厳密に等しいと一貫性のあるメディアの読み込みを確認するテスト。マトリックスおよび/または井戸に読み込まれたメディアの量が最適な範囲の上または下の場合、メニスカスは変更された位相コントラストにつながるを形成できます。最後に、井戸の中の液体の少量のため、上述の蒸発・凝縮を最小化によるメディアのレベルを維持するために重要です。全体的にみて、アッセイ条件の最適化は、分析のための高品質コントラストの画像を生成する重要です。
位相コントラストの品質だけでなく他の要因はまたアッセイ結果メディア汚染を含むマトリックス、および粒子の不完全性またはマトリックスまたはメディアの破片を影響します。顕微鏡室で数時間にわたってライブセル イメージングを行うので、汚染はこの試金の危険です。汚染の危険性を減らすためには、マトリックス、細胞懸濁液は無菌フードのスライド上に読み込まれます。また、各サンプルは重複または不測の破片や粒子解析を交絡などによるデータ損失のリスクを最小限に抑えるために実験のため 3 通メッキ通常。
サンプルの不均一性ドライブは、増加のアッセイの感度の必要があります。 不均一性は、観察し、GDM13に公開されている ECFCs の前の研究で報告されています。これらのサンプルの観察細胞機能における多様性の高レベルは、母体の疾患の重症度、病気の期間、血糖値の抑制に使用管理スタイルを含むいくつかの要因に起因すると推測されます。重要なは、この分析方法は、GDM の妊娠からサンプルの機能的多様性による表現の違いを識別可能となった ECFC 動的範囲血管をキャプチャします。全体的にみて、これらの研究で使われるものなど、主な患者のサンプルの使用は、細胞株と比較して大きな変動を導入できます。トランスレーショナル研究機能の変動と複数のプライマリの動物や人間のサンプルを含むより大きい重点を置くとアッセイ感度検出および生物学的意味のある測定および結論の導出のために不可欠です。したがって、KAV はデータの質と量を向上させるようなアプローチの開発より堅牢な観察と結論するアッセイの体外血管発生と血管新生によって生成されます。さらに、これらのデータは次の GDM の胎児被曝を変更された ECFC 血管に貢献する分子メカニズムの将来の調査を促進します。
このアプローチの将来のアプリケーション このメソッドは胎児 ECFC 血管評価の in vitro 、これらの研究に適用されますが、このアプローチの潜在的なアプリケーションはたくさんあります。この手法は、研究血管や血管新生のプロセスに参加する任意のセル人口を容易に実装できます。具体的には、本研究で示した個々 の細胞を研究に使用できますが、また、共培養システムに適用することができます。将来は、三次元 (3 D) モデルを評価するために二次元の in vitroアッセイを超えてこのアプローチの展開に有益ででしょう。3 D または体内モデル用同様に設計されたコマ撮り、マルチパラ メトリック分析アプローチ 2 次元で観測した場合通知 KAV の現在のバージョンは、3 D 画像データを量的に表わすために十分だろうが、体外より生物学的関連の設定での細胞機能はします。

血管内皮前駆細胞の血管、またはde novoの血管の形成を受ける能力開発1の間に胚の血管系を確立することに重要です。また、さらに血管形成と血管新生として知られている既存の血管の成熟はまた開発と生後血流量と体2全体の恒常性を維持するために重要なプロセスです。体内のすべての臓器、血管系廃棄物3の除去、酸素や栄養素の配達のために依存します。血管の形成と修復が不足または過剰のように血管の恒常性が維持されていない場合、血管疾患は4になります。したがって、血管形成と適応がよく検討と臓器の健康の維持に欠かせない多くの病的状態の開発に関与しています。
血管システム開発だけでなく、病気の症状や進行の関与の高められた理解のための試金は、モデル血管発生と血管新生体外と体内5 に開発されています。 ,6,7。血管の形成のモデリング メッキ血管細胞、内皮細胞、基底膜マトリックス細胞組織と血管ネットワーク8,9,10の形成を促進するなどが含まれます。通常、次は一晩培養、細胞解析11,12,13の画像の小さい数で、その結果、単一の時点でネットワークがキャプチャの画像です。したがって、分析アプローチが主を開発し、単一の時間ポイントの評価10,14用に最適化します。ただし、静的解析は単に血管の形成の動的過程をキャプチャで十分ではない、限られた潜在的なメカニズムの洞察を提供します。イメージング周波数の増加可能性があります形成速度を識別するために必要なデータを提供する、非効率的な労働集約的な14アプローチをイメージング マルチ時間まで開発済みの分析のアプリケーションがあります。さらに、市販の分析法の開発、にもかかわらずイメージ毎の支払料金オプションをレンダリングしますこのコストが数千ものイメージに生成された15の速度論のため。したがって、キャプチャし血管の in vitroなどコマ撮りの生細胞顕微鏡検査によって生成される大きな画像セットを分析する能力を定量化する合理的で効率的なアプローチの分野で必要性があります。
これらの制限を克服するために新しいアプローチは単一の時間ポイント イメージング画像で血管のダイナミック ・ アセスメントを有効に取得すべて 15 分16拡大を目的として開発されました。数時間にわたって複数の時間ポイントをキャプチャ、このアプローチは、形成と血管ネットワークの維持に貢献する潜在的なメカニズムに洞察力と同様、血管、プロセスのより詳細な描写を提供します。周波数と画像の品質を向上、に加えては、このアプローチにはオープン ソースのプラグイン17の形で斬新なソフトウェアが組み込まれています。速度論的解析の血管 (KAV)、呼ばれるソフトウェアは、画像処理と解析用マルチ時間ポイント買収から生成される大きな画像セットが組み込まれた合理化されたアプリケーションです。KAV は、白骨化18続いて領域分割による位相コントラスト画像を分析します。ネットワーク構造の 10 個のパラメーターは、KAV により定量化されていますを含む: 枝、閉域ネットワーク、ノード、ネットワーク エリア、ネットワーク構造、トリプル分岐ノード、ノードのクワッド分岐、総支部長、平均支店長およびノード比 (を参照してくださいに分岐図 1の模式図)16。KAV アプローチの適用には、小説、計算された表現型in vitro血管、ノード比支店と呼ばれるにはが含まれています。私たちの最近の仕事は、この比率はネットワーク接続を示すと運動16などのネットワーク形成に関与する他の細胞プロセスと関連付けられるかもしれないことを示した。
胎児内皮細胞コロニー形成細胞 (ECFC) 血管は、これらの研究で評価されたが、血管や血管新生を受ける細胞の種類を評価するこの画像集録および解析方法を容易に適用できます。さらに、このアプローチは、これらの研究に示すように、妊娠糖尿病などの病的状態の様々 な起因変更された血管機能を識別するために使用できます。さらに、このメソッドは、他の関連する生物学的プロセスに重要なネットワークの形成と、分岐を評価するために合わせることができます。したがって、ユニークな生物学的システムにこの手法を適用することの潜在的な影響はまだ未定です。

<table><tbody><tr><td>100 mm組織培養プレート</td><td>フィッシャー</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐管</td><td>フィッシャー</td><td>1495949B</td><td></td></tr><tr><td>血管新生 15ウェルマイクロスライド</td><td>同上</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>フィッシャー(コーニング)</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 ミディアム</td><td>ロンザ</td><td>CC3162</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>PSA 抗筋細胞、抗生物質</td><td>フィッシャー</td><td>MT30004C1</td><td>EGM2培地500 mLボトルあたり5 mLを添加します。</td></tr><tr>HBSS <td>Fisher (Corning)</td><td>MT25052CI</td><td></td>Type 1 Collagen Fisher (Corning)354226 100 mg の液体、濃度範囲 3-4 mg/mL <td>の 0.5% トリプシン/0.53 nM EDTA</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>。20 nM 酢酸 ddH2O で希釈し、最終濃度 0.05 mg/mL で使用します。</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィ</td><td>ッシャーA38-212</td>は、<td>最終濃度20nMの1型コラーゲン溶液に使用されます。</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>Ibidi</td><td>80296</td><td>このスライドは、イメージングチャンバー内の湿度を維持するために蒸留水で満たすことができます。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>フィッシャー(Gibco)</td><td>20012027</td><td>1倍溶液、pH 7.2</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>MEA53100およびMEF55030</td><td>対物レンズステージとの位相コントラストのためのPh1フェーズリングを含む電動TiE</td></tr><tr><td></td><td>Prior Instruments</td><td>ProScan II</td><td>その他のOKOlabおよびNikon Elements AR互換ステージは使用できます</td></tr><tr><td>対物</td>レンズ <td>ニコンインスツルメンツ</td><td>93178</td><td>CFI Plan Fluor DL 10X</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>浜松</td><td>C11440-42U</td><td>ORCA フラッシュ 4.0LT</td></tr><tr><td>ステージブロワー</td><td>精密制御</td><td>N/A</td><td>この商品は販売を終了しました。World Precision Instruments Stage-top Incubatorの Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W)</td></tr> が含まれます<tr><td>。</td><td>OKOLabs</td><td>H301</td><td>BoldLine(2ポジションスライドホルダー、</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Hewlett-Packard</td><td>Z620または同等の</td><td>4コアIntel Xeonプロセッサ、>32 GB RAM、>2 TB RAID 10、nVidia Quadroグラフィックカードを含む&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Elementsソフトウェア</td><td>Nikon Instruments</td><td>AR v 4.20</td><td>ND Acquisitionは、Elementsソフトウェアの設定に使用する多次元セットアップツールです。</td></tr><tr><td>FIJI(ImageJ)ソフトウェア</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>フリー、オープンソースソフトウェア次のURLでオンラインにダウンロード:</td></tr><tr><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads KAVプラグイン</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>フリー、オープンソースソフトウェア次のURLでオンラインでダウンロード:https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td></tr></tbody></table>

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in vitroのダイナ ミックスを定量化します。

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

血管は内皮幹・前駆細胞、 de novo血管の形成を受ける複雑なプロセスです。血管内皮前駆細胞の機能の中央読み出しとなっている血管の定量的評価と両方生体外でそして生体内の血管モデルを改善するため、いくつかの試みをなされました。ただし、標準的な方法はこの非常にダイナミックなプロセスの多くの側面をキャプチャに失敗した静的な測定とスコープで制限されます。したがって、この新しいプロトコルの開発の目的はネットワークの形成と安定化の率を量的に表わすだけでなく、血管の基になる潜在的なメカニズムに洞察力を提供するための in vitro血管の動態を評価するためにだった機能不全。このプロトコルのアプリケーションは、胎児の血管内皮コロニー母体糖尿病細胞 (ECFCs) を形成を使用して示されています。胎児 ECFCs いた生後の臍帯血から派生した、培養、および彼らが受けた血管基底膜マトリックスを含むスライドでメッキします。15 時間以上時間経過の位相差顕微鏡を使用してスライド全体の井戸の画像に買収されました。画像を血管運動解析 (KAV) と呼ばれる解析ソフトウェアを用いた定量的データの導出を行った。KAV のネットワーク構造を含む (9 測定、計算 1) 10 のパラメーターを取得するマルチ時間点位相コントラスト画像のスタックからネットワーク コンポーネントを分析する白骨化に続いて画像セグメンテーションを使用して: ネットワーク、ネットワーク エリアを閉じるノード、枝、総支部長、平均分岐の長さ、トリプル分岐ノード、クワッド分岐ノード、ネットワーク構造、およびノードの比に分岐。このプロトコルを特定のアプリケーションは、糖尿病合併妊娠から得られる ECFCs における血管発生の率を変更しました。ただし、この手法はここで報告範囲を越えて広範な影響を持っています。このアプローチの実装機構評価を強化し、血管と多数の細胞の種類や病気の状態の他の重要な生物学的分岐プロセス リードアウト機能を向上させます。

KAV は、ネットワーク構造の視覚的な表現を生成します。 KAV セル固有の構造を識別するために、ECFCs と位相コントラスト画像のマトリックスの背景のコントラストができます。KAV で識別される ECFC ネットワークは定量化 (図 2A) のソフトウェアによって使用される構造を説明するために絵の骨格とマスクのレンディションとして表されます。重要なは、スケルトンとマスクのレンディションの定性的な評価は KAV 感度と最適閾値設定を決定および解析結果の解釈に便利することができます精度の迅速同定できます。KAV は正確に位相差画像と KAV で生成されたスケルトンとマスク レンディション (図 2の類似性によって示されるように ECFC ネットワークを識別する位相コントラスト画像の質が高いと、十分なコントラストを実現Aとビデオ 1)。
または、高コントラストおよび/またはイメージング グリッド化が発生するなどの工芸品、位相コントラスト画像はありません、ネットワーク検出精度は低下し、成果になるあいまいな (図 2B)。さらに、携帯メディア内の空気の泡の形成も検出精度 (図 2) を隠すことが。ただし、画質に問題は、KAV のソフトウェアに含まれている異なるしきい値選定法の選択によって多くの場合克服できます。たとえば、図 2Bの位相コントラスト画像をしきい値選定法を除いて同一の画像処理設定を使用して行った。スケルトンとマスクのレンディションから大津閾値が位相コントラスト (図 2B) に示す ECFC ネットワークのより正確な検出で起因した明白であります。したがって、画質は、このアッセイで正確で意味のある結果を達成するために重要です。ただし、KAV ユーザー インターフェイスに含まれる異なるしきい値選定法は、入力画像の品質に基づく画像解析の調整を許可します。
微速度顕微鏡観察が子宮内妊娠糖尿病曝露 ECFC 血管の定性的および定量的な違いを識別します。 最近、KAV 分析手法は、胎児 ECFC 関数16子宮内で母体タイプ 2 糖尿病 (2 型糖尿病) に曝露を評価するために適用しました。KAV を使用して、血管の変化の速度は 2 型糖尿病にさらされている胎児の ECFCs で識別されました。しかし、2 型糖尿病だけでなく全体の妊娠、妊娠糖尿病 (GDM)、または妊娠の第 3 学期の一般的耐糖能異常の開発時に発生する、露出も ECFC 関数13を損ないます。したがって、KAV は、GDM 公開 ECFCs ECFC ネットワーク形成の変化速度も表示するかどうか決定に適用されました。フェーズ 1 (0-5 h) とフェーズ 2 (の 5 + h) は時間を使用して評価された経過顕微鏡と相まって KAV 分析 (図 3)。代表的な位相コントラスト画像画像集録 (0.50 h) の開始で取得し、時間コース (5.00 と 10.00 h) を通して描く ECFC ネットワーク形成実験一日 (図 3およびビデオ 1 からテスト 4 つのサンプル).対応するセル読み込み、0.50 時間位相コントラスト画像にみられるように、にもかかわらずネットワーク構造の質的な違いと 5.00 10.00 時間時点で明白であります。合併症を伴わない妊娠 (UC) から ECFCs は、5 時間後メッキ、私たち以前に公開されたデータの16のように複雑で入り組んだネットワークを形成します。逆に、GDM から ECFCs サンプル 1 の (GDM1) フォームが非常に少数のネットワーク相互接続されていない構造です。ただし、このパターンは、GDM の妊娠、サンプル間の不均一性を示すすべて ECFC 試料では反映されません。サンプル GDM2 と GDM3 接続のパターンが UC のサンプルと比較してに変更されて表示されるが、GDM1 と比較して大きいネットワーク形成を表示します。重要なは、KAV ECFC ネットワーク明白な微妙な表現型を識別するためにいくつかの部品を測定します。
ネットワーク構造の骨格とマスクのレンディションを生成に加えて KAV quantitates 個々 のネットワーク構造のノード、トリプル分岐ノード、四分岐ノード、枝、合計数を含む、ネットワーク構造の 10 の指標支店長、平均分岐の長さ、終了ノードの比率、総支店網、ネットワーク エリア16。KAV は、時間のコースのすべてのイメージの値の単一のテーブルに各サンプルのデータをコンパイルします。表 1には、ECFC サンプルで 1 つ 1 つのイメージング研究から代表の生データが含まれています。KAV を用いてネットワーク構造のパラメーターは列にまとめられて、時間をかけて得た時系列画像のデータが行に整理されます。30 分後めっきされて収集によって生成されたすべての 15 分の Raw 値以降の画像が得られた例では、私たちの研究では、画像 1 の KAV をグラフに表示することができます、または16に近づく複雑な統計を使用して更に分析。
1 つの単純なサンプル (UC) と 3 つの GDM のサンプル (図 4) の 3 つの独立した実験からネットワーク構造の平均値を描いた 5 つのグラフが表示されます。これらの実験は、以前と同様に実行で UC サンプル分析 UC サンプル16です。以前は、ECFC 血管体外bi 一過性のフェーズ 1 (0 - 5 h) から成るが、フェーズ 2 (5-10 h)16ことが分かった。このパターンは、閉じられたネットワーク データ (図 4) を描いたグラフで明らかなように現在の研究で一貫してです。UC のサンプルは、GDM のサンプルのすべての 3 つを比較しての閉域ネットワークの大きい数を形成しました。興味深いことに、4 つのサンプルの 3 つは 2.5 と 3 時間の間に発生する閉域ネットワークの最大数に類似した時間が表示されます。ただし、GDM2 サンプル発生 5 時間後めっき最大の閉域ネットワークに到達するために遅かった。そして、UC のサンプルと比較して少ない最大ネットワークを形成 GDM2 サンプル、にもかかわらずネットワークを形成維持された同様に UC のサンプルに時間をかけて。逆に、GDM1 と UC のサンプルと比較して少ないネットワークを形作った GDM3 も時間の経過とともにネットワーク番号の全体的な減少を展示しました。全体的にみて、閉じられたネットワーク番号を描いたグラフから明らかだネットワーク形成の bi, パターンをすべて ECFC サンプルに表示形成率および達成のネットワークの最大の数のサンプルの間で異なるしかし。
ネットワーク地域は、ECFCs によって形成される閉じたネットワーク内で平均領域を表します。したがってより閉じたネットワーク番号、小さいネットワーク エリア。このパターンは、多数の閉域ネットワークの形成、UC のサンプルが 3 つの GDM のサンプル (図 4) と比較して時間をかけて小さいネットワーク領域を持っていたネットワーク領域グラフに反映されます。最大の閉域ネットワークをもっとゆっくりに達した GDM2 展示当初高ネットワーク エリア、15 時間で UC サンプルに最も類似していたしかし地域は時間とこれ以上安定します。時間をかけて、すべてのサンプルの平均ネットワーク エリアはネットワーク解消安定化により増加しました。ただし、GDM1 と GDM3 のようないくつかのサンプル展示はより漸進的な増加を示すその他のサンプルと比較して減少安定性の可能性を示すネットワーク領域のより急速な増加です。
GDM 公開 ECFCs 展示削減ネットワークの安定性 ノードに分岐の比率は KAV によって計算され、我々 の以前の研究で識別される新しい表現型、ネットワーク接続16を示す。現在の研究では、UC サンプルは、時間 (図 4) が維持されたネットワーク接続の高レベルを代表する低比を持っていた。逆に、3 つの GDM サンプル ネットワーク形成のフェーズ 2 で特にノードに分岐の比率が高かったがあった。この観測は、減の接続とネットワーク構造の解消安定化を示しています。
全体的にみて、少数のノードと分岐の実験の経過を維持削減とその他のサンプルと比較して GDM1 が形成されます。GDM2 と GDM3 形成され 5-15 h、特に間、UC の例と比べると枝の大きい数を維持しました。GDM2 GDM3 ネットワークで検出されたノードの数 10-15 h、特に間、UC サンプル内のノードの数に類似していた。枝の大きい数が、ノード数が類似を説明できるノード比増加支店 GDM のサンプルの後の時点で明らか。重要なは、分岐とノード番号の同時変更は別のグラフの解釈が困難にすることができます。ただし、ノード比新規ブランチは、変更された、ネットワーク接続にどのように個々 のグラフの分枝・節数に見つけにくいわずかな変更を含む変更の結果を評価する方法を提供しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg"> 図 1: 回路図 10 パラメーターの定量化による速度論的解析の血管 (KAV) をアウトライン表示します。KAV は、ネットワーク構造の 10 個のパラメーターを quantitates します。すべてのパラメーターは、色分けし、回路図に記載されている数値 (1-10)。枝 (緑、1)、閉じたネットワーク (青、2) の数やノード (赤、3) のネットワーク領域 (オレンジ、4)、ネットワーク構造 (黒、5)、トリプル分岐ノード (黄色、6)、およびクワッド分岐ノード (紫、7) の数の平均、パラメーターだけでなく(9) の合計と平均 (10) 支店長とノード (10) の数と枝数の比率。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg"> 図 2: 血管運動解析 (KAV) quantitates ネットワーク構造。位相コントラストの画像を提供を識別して定量化 KAV によってネットワーク構造の視覚的表現を用いた KAV で識別されるネットワーク構造の骨格とマスクのレンディションを (A)。スケール バー = 500 μ m。 (B) 個々 の画像を一緒にステッチから、低コントラストとグリッド ECFC ネットワークの 10 h 後めっきの代表的な位相差画像をマーク。意味や大津市などの異なるしきい値選定法は、位相コントラスト画像が低コントラストを持っている場合、またはデータが発生した場合、定量精度を向上させるプラグインの KAV で選択できます。平均と大津のしきい値選定法の位相コントラストのスケルトンとマスクのレンディションが表示されます。位相コントラスト画像は、対物レンズ 10 倍を使用してキャプチャされました。スケール バー = 500 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg"> 図 3: 子宮内 GDM 露出変更 ECFC ネットワーク形成します。ECFC ネットワーク形成のイメージは、位相差顕微鏡による 15 時間 15 分間隔でキャプチャされました。UC と GDM の 3 つのサンプルのため (0.5 h) をめっきの時刻に開始 5 時間ずつ代表的な位相コントラスト画像のとおりです。位相コントラスト画像は、対物レンズ 10 倍を使用してキャプチャされました。スケール バー = 500 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg"> 図 4: 子宮内 GDM 展示変更ネットワーク形成過程にさらされて ECFCs です。ECFCs は、合併症を伴わない妊娠 (UC、黒) と 3 回の妊娠が妊娠糖尿病 (GDM 1-3、赤) が複雑にから得られました。位相コントラスト画像は 15 分間隔 15 h 量的に表わされる血管運動解析 (KAV) ソフトウェアを閉じたネットワーク、ネットワーク領域、枝、ノード、およびノードに分岐の比率で捕獲されました。示されているデータは、各サンプルの 3 つの独立した実験の平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差を表しています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg"> ビデオ 1:子宮内 GDM 露出変更 ECFC ネットワーク形成のカイネティクス。ECFC ネットワーク形成のイメージは、位相差顕微鏡による 15 時間 15 分間隔でキャプチャされました。UC と 3 つの GDM サンプル 0.5 h から 15 h 以上の位相コントラスト画像のとおりです。スケール バーを表します 500 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>イメージ</td>
			<td>総支部ネットワーク</td>
			<td>ノード</td>
			<td>トリプル</td>
			<td>4 倍に増加</td>
			<td>枝</td>
			<td>総支部長 *</td>
			<td>Avg 支店長 *</td>
			<td>ノード比支店</td>
			<td>閉域ネットワーク</td>
			<td>ネットワーク地域 * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2.72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1.94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>655</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1.86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="11">* 最も近いミクロンに丸められます * * 最も近いミクロンに丸められます ^2</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:ECFC サンプルで 1 つ 1 つの画像から代表的な raw データ研究します。

ここでは、タイムラプス イメージングのためのプロトコルを提案する、血管を使用して生体外の解析位相コントラスト顕微鏡血管運動解析、オープン ソース ソフトウェアとの結合します。このプロトコルは、多数の種類の細胞や血管の模型実験の条件の vasculogenic の可能性を定量的に評価に適用できます。

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

この実験方法の全体的な目標は、経時的な血管形成の動的プロセスを視覚化し、定量化することです。この方法は、血管形成と血管新生の分野における、血管形成の速度と形成されたネットワーク構造パターンの違いに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、多数の血管形成時点の定量化を可能にし、血管形成プロセスの動力学を評価する機会を提供することです。この方法は、個々の細胞集団または共培養システムの研究のために、血管新生または血管新生のプロセスに影響を与える任意の細胞集団または病理学的状態に適用することができます。実験開始の約1〜2時間前に、Microscope Stage Top Incubatorを37°Cに予熱し、二酸化炭素を5%、湿度を85%に設定しますインキュベーターの湿度リザーバーが空の場合はインキュベーターの湿度リザーバーを満たします。生細胞チャンバーを顕微鏡に置き、次に、空のチャンバースライドを生細胞チャンバー内の2つの空位置のいずれかに配置します。スライドに蒸留水を入れ、二次ブロワーを摂氏39〜42度に設定して、スライドを下から加熱し、結露を最小限に抑えます。生細胞イメージングチャンバー内の適切な温度と湿度を維持することは、実験の成功に不可欠です。実験スライドを追加できるようになるまで、2 番目のスライドを空白として追加します。次に、2 番目のスライドで井戸を囲む貯水池に水を追加して、イメージング実験中の条件を模倣します。実験チャンバースライドに基底膜マトリックスをロードするには、まず20マイクロリットルのピペットに冷たい20マイクロリットルのピペットチップをロードし、ハサミを使用してチップの端から約1cmを切り取ります。ピペットの容量を10マイクロリットルよりわずかに大きい値に設定し、マトリックスをゆっくりと修正したピペットチップに吸引します。すぐにピペットチップを1つのスライドウェルの中央に置き、チップをウェルの底にそっと触れ、プランジャーをゆっくりと押し下げてマトリックスを押し出します。15ウェルすべてにマトリックスを追加した後、蓋をスライドに完全に押し込みます。マトリゲルボリュームを各ウェルに正確かつ一貫してピペッティングすることは、高品質の位相コントラスト画像を得るために重要です。次に、スライドを摂氏37度で30〜60分間、2〜3ミリリットルのPBSで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブキャップの隣に置き、マトリックスの脱水を減らします。マトリックスが固まったら、一晩培養した内皮コロニー形成細胞培養物から上清を取り除き、7ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引し、37°Cで2〜3ミリリットルのトリプシンで細胞を2〜5分間洗浄し、剥離します。次に、解離した細胞を3ミリリットルの内皮増殖培地-2に再懸濁して細胞塊を分解し、得られた細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。すべての内皮コロニー形成細胞サンプルを再懸濁した後、遠心分離により細胞をペレット化し、ペレットを1〜2ミリリットルの新鮮な内皮増殖培地に再懸濁します。各サンプル中の生細胞の数を数え、十分な内皮コロニー形成細胞を新しい1.5ミリリットルチューブに追加して、細胞を中濃度175マイクロリットルあたり10〜4番目の細胞の1.4倍に希釈できるようにします。次に、各マスターミックスを穏やかなピペッティングで混合します。スライドの蓋を取り外し、各マスターミックスの50マイクロリットルをウェルごとにスライドに三重に譲ります。細胞を画像化するには、ブランクスライドを1つの実験スライドに置き換え、スライド上の細胞を囲むリザーバーに水を追加します。各ステージ位置を循環し、最初のウェルの中心が選択されていることを確認します。ウェルに播種された細胞に着目し、ステージのZ位置を設定します。設定が正確なら、ライトを消してイメージング実験を開始します。イメージングが完了したら、Image Captureソフトウェア内で画像スタックファイルをスケーリングしてエクスポートし、画像を分析用にTIFFファイルとして保存します。画像を分析するには、Kinetic Analysis of Vasculogenesisファイルをそのフォルダからソフトウェアウィンドウの下部にある灰色のバーにドラッグしてソフトウェアを開き、[保存]をクリックしてソフトウェアをリストに追加します。[ファイル]と[開く]をクリックして開く画像ファイルを選択するか、画像ファイルをソフトウェア内の灰色のバーにドラッグします。[画像]、[調整]、および[明るさ/コントラスト]をクリックして、[明るさ/コントラスト]ウィンドウを開きます。[明るさ/コントラスト]ウィンドウ内で[リセット]をクリックして、画像を視覚化します。次に、[画像]、[タイプ]、および[8ビット]をクリックして、画像を8ビットに変換します。[ツール] と [関心領域マネージャー] を選択し、適切な形状の選択ツールを使用して新しい関心領域を作成します。[追加] をクリックして [関心領域マネージャー] ウィンドウに関心領域の形状を追加し、[関心領域マネージャー] の [関心領域] ラベルをクリックして画像上の領域を表示します。必要に応じて、関心領域を調整します。領域が配置されたら、「イメージ」、「切り抜き」の順にクリックして、イメージを切り抜きます。次に、[編集] メニューを開き、[外側をクリア] を選択して、スタック内のすべての画像の関心領域の外側の画像データを削除します。次に、[プラグイン] メニューを開き、[Analyze Network] プラグインを選択します。ポップアップ ウィンドウのドロップダウン矢印を使用して [しきい値処理方法] を変更し、[OK] をクリックしてソフトウェア処理を開始します。解析の最後に、データ テーブルと、スケルトンとマスクのレンディションを示す融合画像のスタックが開きます。「ファイル」および「名前を付けて保存」をクリックして、数値をスプレッドシートに転送し、生データ値を含むスプレッドシートを保存します。融合したスケルトンとマスクの画像をクリックし、融合したスケルトンマスクの画像スタックとクロップされた位相差の画像スタックをTIFFファイルとして保存します。次に、[関心領域マネージャー]ウィンドウをクリックし、画像のトリミングに使用する関心領域を選択し、[その他]と[保存]をクリックして、将来の使用のために関心領域を保存します。血管形成の動態解析によって同定された内皮コロニー形成細胞ネットワークは、ソフトウェアが定量化に使用する構造を示すために、スケルトンおよびマスク表現として図表されます。位相コントラスト画像の品質が高く、十分なコントラストが達成された場合、血管形成のキネティック解析は、位相コントラスト画像と血管形成のキネティック解析で生成されたスケルトンおよびマスク表現との間に観察された類似性によって示されるように、内皮コロニー形成細胞ネットワークを正確に特定します。位相差画像に高コントラストがない場合、またはグリッディングなどのイメージングアーチファクトが発生すると、ネットワーク検出の精度が低下し、結果があいまいになります。ただし、ここに示す [平均] や [Otsu] などのさまざまなしきい値処理方法を解析前にソフトウェア ドロップダウン メニューで選択して、画像品質の違いに対応できます。血管形成の動態解析を使用して、妊娠糖尿病に曝露した内皮コロニー形成細胞がネットワーク形成の変化した動態を示すかどうかを判断すると、合併症のない妊娠からの内皮コロニー形成細胞培養と比較して、妊娠糖尿病培養におけるネットワーク構造形成の不均一に変化したことが明らかになります。実際、合併症のない妊娠サンプルは、通常、妊娠糖尿病サンプルと比較して、より多くの閉鎖ネットワークを形成します。しかし、すべての内皮コロニー形成細胞サンプルは、全体的にネットワーク形成の二相性パターンを示していますが、形成速度と達成されるネットワークの最大数はサンプル間で異なります。この手順に続いて、血管形成の動的解析によって生成されたデータ値をグラフ化および分析して、異なるサンプルによって形成されるネットワーク構造が統計的に異なるかどうか、また異なる場合はどの時点で異なるかを判断できます。血管形成のカイネティック解析は、大量の画像を含むタイムラプス実験の効率的な処理を可能にします。一度習得すると、すべてのシステムが適切に機能していれば、画像の取得、後処理、および分析を2日で完了できます。

kinetic-analysis-vasculogenesis-quantifies-dynamics-vasculogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

プロトコルは、マウスにおいて開発された角膜マイクロポケットアッセイを説明しています。...

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

我々は、単離され、十分に特徴付けられた環境で、in vivoで血管新生を分析するためのモデルとして動静脈（AV）ループの生成のための顕微的なアプローチを説明します。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適なエンジニアリングを軸方向に血管および移植組織に適しています。...

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

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誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。...

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Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

学ぶ血管発生の運動論的解析法。Matrigel上で内皮コロニー形成細胞を培養し、位相差顕微鏡によるタイムラプス撮影とKinetic Analysis of Vasculogenesisソフトウェアを用いて、血管ネットワーク形成の動態を定量的に評価します。

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナミックスを定量化します。

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