Name: 多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ多重等温増幅法によるジカ、チクングニア、デングウイルスの同時検出。LAMP技術と標的特異的プローブを用い、最小限のサンプル前処理で高感度・高特異性のポイントオブケア診断を実現する方法です。

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仕事は、FDOH 7ZK15、NIAID 1R21AI128188-01 によって部分的に支えられました。この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症、一部生物医学研究プログラムのフロリダ保健省によって部分で支えられました。内容は著者の責任と NIH やフロリダ保健省の公式見解を必ずしも表さない。動的コンビナトリアル化学 LLC は彼らのサポートおよびこのプロジェクトへの貢献を認めています。
1 デング熱ウイルス (ひずみボル KW010) は親切でフロリダ部の健康局の研究所を提供します。ジカとチクングニア ウイルスのアジア家系は、疾病管理・予防センターに提供された優雅。チクングニア ウイルスのインド洋系統親切ロバート ・ テッシュ (新興ウイルスやテキサス大学医学部ガルベストン、テキサス州からのアルボ ウイルス世界参照センター) から UF FMEL に提供されました。感染症研究の支援、s. ベラミー、B. ・ イーストモンド、s. オルティス、+ ベレス、k. ウィギンス、r. ZimLer と克ザーベルに感謝します。我々 はまた、Q 紙を提供するため m. s. キムを感謝します。

注: 蚊が直接この研究で使用される唯一の動物です。血液感染した蚊を飼料に使用している鶏を管理する手順は、フロリダ大学機関動物のケアと使用 Committee.Virus 伝搬による IACUC プロトコル #201507682 として承認され、蚊の感染症研究ベロ ビーチにフロリダ医療昆虫研究室の BSL 3 施設で実施され、フロリダ州 RT ランプ実験 FfAME とフロリダ州アラチュアの Firebird 生体分子科学 LLC によって共有 BSL 2 研究室で行った
1 プローブを移動させるプライマーとストランドのデザイン
<ol><li>ブロード研究所データベース23; からデング熱 1 ウイルス シーケンスを抽出します。ジカとチクングンヤ NIAID ウイルス病原体データベースと解析リソース24からのシーケンス。<ol>
<li>多重配列アライメント (MSAs) シーケンス ソフトウェア筋 v3.8.3125を使用して興味を作成します。使用には、ターゲットの保存領域内のランプのプライマー セットを検索し、関連のない、または意図しないターゲット、ターゲットのサブタイプの違いなどを避けるために MSAs が生成されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>説明オンライン (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) としてランプのプライマーの設計規則に従うし、ウイルス発散26をカバーするプライマーの混合基地の使用を許可します。プライマー セットの交差を避けるためには、NCBI RNA ウイルス データベース NCBI BLAST27を使用して生成されたランプ プライマーを比較します。同様 NCBI BLAST を使用して多重アッセイで dimerize とプライマーを除去するために各セットを比較します。</li>
	<li>画面の任意のウイルスのゲノム シーケンスと蚊ゲノム配列に対して鎖置換プローブの二本鎖部分。5' - フルオレセイン amidite (FAM)、16 進数の染料と、ジカ、チクングニア、デング熱 1 5 carboxytetramethylrhodamine (耽羅) 染料標的結合プローブの端をそれぞれ変更します。<ol>
<li>プライマー尿の肯定的な制御にはが含まれます。人間のミトコンドリア DNA を対象とするランプ プライマーを設計します。5' 末端にテトの鎖置換プローブをラベルします。それぞれを部分的に補足蛍光ラベル クェンチャー プローブ プローブ (例えば、アイオワ州ブラック FQ) を癒す 3' 末端 (表 1) のラベルの付いた。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ウイルス分離および感染蚊のサンプル
<ol><li>ジカ (プエルトリコ株)、チクングニア ウイルス (ラ レユニオンや英領バージン諸島ひずみ) とデング ウイルス血清型 1 (キーウェストひずみ) の使用を分離します。プラクの試金28または定量的 RT-PCR 法29を使用してウイルスの抗体価を決定します。市販の RNA 抽出キットを使用してウイルスの Rna を抽出します。 注:表 2本研究で使用される各ウイルス分離株のウイルス抗体価を表します。</li>
	<li>ジカとチクングンヤ ウイルス20ネッタイシマカ Ae。女性の感染について詳細なプロトコルのヤレンらによって出版される記事に従ってください。ジカ ウイルスに感染した蚊サンプルのウイルス価は表 2を参照してください。</li>
</ol>3. RT ランプ不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼと相まって
<ol><li>
10 × プライマー ミックスの準備。
	<ol>
<li>各プライマーの 100 μ M 原液を準備し、(手順 1 を参照) をプローブ ヌクレアーゼ フリー水を追加することによって。よく渦と使用するまで-20 ° C でストア。</li>
		<li>10 X プライマー ミックス各ジカ、デング熱 1、またはミトコンドリア DNA ターゲット ミックス 16 μ 16 μ L BIP、FIP の F3、B3、LF、LB、LB 蛍光の 3 μ L の 2 μ L の 5 μ L の 2 μ L の 2 μ L 標識プローブ、プローブ クェンチャーの 4 μ L、と 100 μ L のボリュームの合計を与えるためにヌクレアーゼ フリー水を 50 μ l 添加します。</li>
		<li>チクングニア、10 X プライマー ミックス ミックス FIP、16 μ L BIP、F3、B3、lb 膜、LF の 2 μ L の 5 μ L の 2 μ L の 2 μ L の 16 μ L の LF 蛍光の 3 μ L ラベル プローブ、クェンチャー プローブの 4 μ L、100 μ L のボリュームの合計を与えるためにヌクレアーゼ フリー水を 50 μ l 添加します。 メモ: 最終的な蛍光プローブと 400 の使用 300 nM 上記プローブ濃度クェンチャー プローブの nM。また、使用 80 nM の蛍光に分類されたプローブと 200 nM のリアルタイム解析、クェンチャー プローブの。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プライマー ミックス X 10 の 5 μ L を追加 (3-プレックス、プライマー ミックス X ごとの 10 の 5 μ L を追加)、等温増幅バッファー X 10 の 5 μ L (1 X バッファー組成: 20 mM トリス塩酸バッファー pH 8.8, 50 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1 %1 mM DTT、トゥイーン 20)、dNTP の混合物 (dATP、dCTP dGTP ・ 10 mM; dTTP の dUTP 5 mM) の 7 μ L、DNA ポリメラーゼ、逆転写酵素、遺伝子組換えリボヌクレアーゼ阻害剤の 80 台、不耐熱 UDG、vi の様々 な量の 1-2 μ L の 2 台の 15 単位 16 単位Rna、ral と 0.25 mL PCR に 50 μ L まで容量をもたらす水チューブ (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>ウイルス RNA 量を水に置き換えることによりこの段階で陰性対照試金が含まれます。65-68 ° C、1 時間に 45 分間のサンプルをインキュベートし、臭化エチジウム (0.4 μ G/ml) を含む 1 X TBE バッファーに 2.5% の agarose のゲルの各サンプルの 5 μ L を実行して、分析します。25 を使用して bp またはゲル上のマーカーとして 50 bp DNA の梯子。 注: 非ターゲットの特定のテンプレートの追加はオプションです。</li>
	<li>病原性 RNA の存在を検出するために変化する温度 (68 ° C への 65 ° C) またはマグネシウムで動作する各 RT ランプ プライマー セットを設計して以来、温度やマグネシウム濃度を変化させることにより各プライマー セットと、いいえテンプレート コントロールをテストします。濃度 (6 から 10 ミリメートル最後)。室温で実験を準備します。</li>
</ol>4. RT ランプ ウイルス RNA スパイク尿を使用して
<ol><li>全反応量 50 μ L の尿 (0%、10%、20%、50%) の最終濃度を変動で RT ランプ プライマーをテストします。10% の最終的な尿濃度 5 μ L の尿にウイルス RNA の 1 μ L を追加します。最終的な尿濃度が 20%、尿の 10 μ L にウイルス RNA の 1 μ L を追加します。最終的な尿中濃度が 50%、尿を 25 μ l 添加するウイルス RNA の 1 μ L を追加します。</li>
	<li>リアルタイム尿の 10% で RT ランプの監視、リアルタイム PCR 装置を使用 (材料の表を参照してください) 異なる蛍光フィルターを使用します。<ol>
<li>FAM ラベル amplicons からジカの蛍光信号を読み取る、483 から 533 に至るまでフィルターを使用して nm;チクングニアの HEX 標識 amplicons、568 523 に至るフィルターを使用 nm;デング熱 1 の耽羅ラベル amplicons、558 から 610 に至るまでフィルターを使用 nm;ミトコンドリア DNA のテト ラベル amplicons、568 523 に至るフィルターを使用し、nm。 注: FAM は、495 の励起と放射のマキシマ nm、520 nm、それぞれ。16 進数は 538 の励起と放射のマキシマ nm と 555 nm、それぞれ。耽羅は 559 の励起と放射のマキシマ nm と 583 nm、それぞれ。テトは 522 の励起と放射のマキシマ nm と 539 nm、それぞれ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用 96年ウェルのプレート シール透明なプラスチック シートでプレート 60-90 分の 65-68 ° C でサンプルをインキュベートし、すべての 30 の蛍光を記録 s 光のサーマルサイクラーを使用しています。当初 80 nM の蛍光に分類されたプローブとテスト、300 nM の蛍光に分類されたプローブを使用します。<ol>
<li>直列に追加することによって各ターゲットの検出限界希釈 10% の最終的な尿濃度におけるウイルス Rna を決定します。 注: は、最適な温度、マグネシウムの集中、蛍光に分類されたプローブの濃度、反応時間を決定するのにリアルタイム RT ランプを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>目でストランド移動プローブによって生成された蛍光を視覚化する 470 で励起光サーマルサイクラーから青色 LED 光源を使用して、nm (青色光源内蔵のゲルの電気泳動ボックスが動作、材料の表を参照)、画像を記録し、暗闇の中で常温携帯電話カメラ。 注: 使用 300 nM の蛍光に分類されたプローブ、青色 LED を使って目ですべての 3 つの色の可視化が必要な場合。</li>
</ol>5. Q 紙技術を使用してジカ感染蚊の検出の RT ランプ
<ol><li>わずかな変更30以前に発行されたメソッドによると第四アンモニウム変更フィルター紙 (Q 紙) を準備します。<ol>
<li>50 ml の NaOH 水溶液で、活性化のため 15 分の 1.8% の 3.5 cm の直径を持つセルロースろ紙円 (材料の表を参照) の 1 g を浸します。</li>
		<li>真空濾過により活性紙サークルを収集し、沈ま 40 mL (2, 3-エポキシプロピル) トリメチル アンモニウム塩化物 (0.28 g) の水溶液に一晩室温で。 注: は、ろ紙は 0.28 1 (2, 3-エポキシプロピル) トリメチル アンモニウム塩化物の質量の比を保持します。</li>
		<li>真空濾過により結果として得られるカチオン性の紙を収集し、50 ml の 1% 酢酸の中和します。</li>
		<li>エタノールで 3 回紙を洗うし、一定の気流のあるフードの下で風乾します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>紙パンチやはさみを使用して小さな長方形 (3 mm × 4 mm) に Q 紙シートをカットします。マイクロ乳棒で各用紙にジカ潜在的感染Ae。 ネッタイシマカのメスの蚊をつぶします。</li>
	<li>1 M アンモニア溶液 (pH ≒ 12) の各用紙の 20 μ L を追加し、5 分待ちます。50% エタノールの 20 μ L で一度各紙、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L で一度洗います。BSL 2 バイオ セーフティ キャビネット約 1 時間用の用紙を風乾します。 注: この時点で、サンプル保存できます-20 ° C で使用するまで一晩。</li>
	<li>ピンセットを使用して、RT ランプ反応混合物の 100 μ L の各用紙を配置し、45 分のソリューションで紙が完全に水没してください 65-68 ° C でインキュベートそれを浮動しない必要があります。読み、青色 LED 光源を用いたジカ ・ オレンジ色または黄色のフィルターから生じる蛍光を記録します。</li>
</ol>6. 反応体積の 100 μ L 用 RT ランプ試薬の凍結乾燥
<ol><li>セクション 3.1 によると 10 X ランプ プライマーの混合物を準備し、dNTP 混合セクション 3.2 によると dUTP を準備します。使用するまでプライマーの混合物および-20 ° C で dNTPs を格納します。</li>
	<li>10 ml、グリセリンを 1 M トリス-HCl pH 7.5、1 M KCl、0.5 M の EDTA、10% の 100 μ L の 2 μ L の 500 μ L の 100 μ L を混合することによって削除する酵素透析バッファーのトリトン X-100 の 0.1 M の DTT の μ L、ヌクレアーゼ フリー水 9.198 mL の 100。4 ° C で透析バッファーを格納します。 注: を使用し、4 ° C で保存する前にすべての緩衝試薬溶液 (0.2 ミクロン フィルター) をフィルター処理することを確認します。<ol>
<li>10 kDa カットオフ制限で限外ろ過膜を使用 (材料の表を参照してください)。透析バッファーの場所 350 μ L、4 μ L の DNA ポリメラーゼの 32 単位、逆転写酵素の 30 台の 2 μ L、限外ろ過膜および 14,000 x g で 4 ° C で 5 分間遠心に RNase 阻害剤の 80 単位の 2 μ L</li>
		<li>限外ろ過膜および別 5 分空コレクション チューブ (14,000 x g) 遠心分離機に透析バッファーの別の 350 μ L を追加し、この手順を繰り返します (14,000 x g) を 3 分間遠心します。</li>
		<li>溶出、膜を反転し、新しいコレクション チューブに配置します。1,000 x g で 2 分間測定溶出ボリュームでスピンします。場合 8 μ L、透析バッファーを追加して 8 μ L にボリュームをもたらすより少ない。4 ° C で溶出を格納し、すぐに次のステップに進みます。 メモ: このプロトコルは、単管の凍結乾燥が同じの限外ろ過膜を使用して、一度に少なくとも 10 の反応管を準備し、透析バッファーの同じ量を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>場合 10 X ランプ プライマーの 10 μ L を混合 singleplex (3-プレックス、プライマー ミックス × 各 10 の 10 μ L を追加)、自由水 (3 プレックスのヌクレアーゼの 66 μ L 不耐熱 UDG の 2 単位の 2 μ L、8 μ L 透析酵素ミックスの dNTP の混合物の 14 μ L、46 μ L を使用して) 0.5 mL 遠心チューブの蓋を開いたまま。代わりに、蒸気をエスケープするを許可するように針で穴を開けて別の蓋を追加します。</li>
	<li>すぐに-80 ° C 2 時間で管を凍結し、凍結チャンバー内に光からの保護用アルミ箔 4 h カバー用チューブを凍乾します。試薬を乾燥すると、パンクチャド蓋を削除、元のふたを閉じるし、暗闇の中で 4 ° C で凍結乾燥試薬とチューブを格納します。 注: 試薬でく凍結乾燥一晩、必要に応じて。</li>
</ol>7 RT ランプ試薬尿とジカを含む蚊サンプルを凍結乾燥テスト
<ol><li>キットから次の項目を使用 (材料の表を参照してください) ジカの: 3 D プリントされた観察ボックス オレンジ フィルター (ロングパス フィルター、カット上 ~ 540 nm)、ボックスを観察するため 2 つの AAA 電池 ZV のジカ検出ラベル反応管を凍結乾燥し、1.1 X 復元バッファー 1.5 mL スクリュー トップ チューブします。</li>
	<li>DNA ポリメラーゼと一緒に来る等温増幅バッファー X 10 の 5.5 mL を混合することによって水分補給バッファー X 1.1 の 50 mL を準備 (材料の表を参照)、100 mm MgSO43.3 mL、110 の 0.5 M の DTT、μ とヌクレアーゼ フリー水 41.09 mL。よく、1.5 mL スクリュー トップ チューブにこのソリューションの因数の 1 mL を混合し、使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
	<li>1.1 X 復元バッファーの 90 μ L を各反作用の管を (0.5 mL) に追加します。液体が管内凍結乾燥試薬 (ディゾルブ (1,000 x g) は振動によって、簡単に混合にスピンダウン) の下部を塗りつぶしますを確認します。(詳細についてはセクション 4.1 参照) 反応管にウイルス RNA とスパイクの尿サンプルの 10 μ L を追加します。<ol>
<li>蚊をテストした場合は、四角形を追加 Q 紙の蚊の死骸 (5.2 と 5.3 で説明したセクションの手順で準備) として、一緒に 10 μ L を保持している尿の代わりに水を浄化します。 注: また、尿ではなく唾液や血清サンプルの 10 μ L を追加します。場合は、サンプル抽出した DNA や RNA、水分を補給された混合物に 2-5 μ L のサンプルを追加とヌクレアーゼ フリー水最終サンプル ボリュームの 10 μ L を。</li>
	</ol>
</li>
	<li>反応チューブの蓋を閉じる。熱ブロック/バス (またはインキュベーター) それらは 65-68 ° C で事前設定場所30-45 分、1 時間以上インキュベートします。インキュベーション後、チューブを熱から削除します。将来の試金の汚染を防ぐためには、これらの管は閉じたままことを確認します。</li>
	<li>観察ボックスに反応管を配置します。温度は、周囲温度 (できれば 25 ° C) に分類されます。観察のボックスの背面にスイッチを入れます。オレンジ色のフィルターを通してサンプルを観察し、距離のイメージいっぱいの視野の 80% にどこで開催されている携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。 注: より良い可視化は、低照度環境で実現されます。</li>
	<li>可視化が完了した後は、スイッチを切ります。後の可視化が必要な場合、冷蔵が好ましいと、暗闇の中で密封された管を格納します。</li>
</ol>

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著者とその機関のいくつかはこの試金に関連する知的財産を所有します。

ジカ、チクングニア、デング熱などの蚊媒介ウイルスは、低コストのポイント ・ オブ ・ ケア検出選択肢蚊サーベイランスのためだけでなく、患者の診断のための必要性公衆衛生と最近ジカ発生ハイライトを脅かします。等温増幅法は、PCR ベースのシステムを手頃な価格の代替として開発されました。特に、RT ランプ ベースのプラットフォームは、幅広い病原体の検出に適用されています。ただし、等温プラットフォームの使用は、単一のターゲット検出に主に制限されています。報告方法はここで特に便利であることが証明されて適度な温度 (65-68 ° C) の範囲で実行される単一の反作用の混合物の 3 つの異なるターゲットの同時検出を許可する変更された RT-ランプを使用してのでより高い温度ジカと他のウイルス非感染性30,3560 ° C をレンダリングします。
さらに、ここで表示されるデータは、RT ランプは様々 な体液15に存在する物質を抑制でき...

蚊媒介性ウイルス感染症、デング熱、チクングニア、ジカ ウイルスなどは上昇と需要の即時管理戦略では。デング熱とチクングニア ウイルスがすでにジカは西半球に1で広がって熱帯地域の多くで流行。ジカ、デング熱のようなフラビ家族のメンバーである、1 つのアジアと 2 つのアフリカの遺伝的系統2アフリカ原産。ジカ ウイルスの同定は 1947 年にさかのぼる、にもかかわらず人間のジカ感染散発的な太平洋とアメリカ大陸に出現する前に、の半世紀のために残った。2007 年、ミクロネシアのヤップ島に発生した熱ジカの最初の報告された発生は続いてフランス領ポリネシア、2013、2014アメリカの最初の主要な発生は、2015 年にブラジルで発生しました。
ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスは、主にネッタイシマカとヒトスジシマカによって送信されます。しかしジカ母-胎児の相互作用、性的接触を介して、授乳3,4,5を介して可能性が広がっている、追加下流ヒト-ヒト感染の可能性があります。ジカ熱は、最初唯一の軽度の病気を引き起こすと考えられていた。しかし、それは後で大人のギランバレー症候群、新生児、および最後の月への年を可能性があります慢性の筋骨格系疾患の小頭症に関連付けられています。ジカの感染症の症状は他のウイルスの蚊拡散6に似ているので、ジカの病気の診断に挑戦することができます。これらのウイルスの一般的な共同感染は、鑑別診断もより挑戦的な7,8を作る。したがって、コントロールと予防措置を開始し、患者のケア9を管理する、リアルタイムで疫学を理解するからジカと他のウイルス核酸の迅速かつ信頼性の高い検出が必要です。
これらのウイルスの現在の診断テストには、血清学的検査、ウイルス分離、ウイルス シーケンシング、および逆転写 PCR (RT-PCR) が含まれます。標準的な血清学的手法がしばしば不十分な感度に苦しんで、結果以前他の発現によって感染している患者での交差反応性によって複雑になることができます。
したがって、核酸テストを検出し、これらのウイルスを区別する最も信頼性の高い方法になります。ジカと他蚊媒介ウイルスの検出が通常、RT-PCR 法やリアルタイム RT-PCR 体液、血清、尿、唾液、精液、母乳、脳液10,11などの様々 なを使用して実行されます。彼らは以下の PCR 阻害、高ウイルス量、長期間とコレクションと12,13を処理の簡易化のためのウイルスの存在を示すので、尿および唾液のサンプルは、血液より一般に優先されます。RT-PCR ベースの診断テストは、ただし、広範なサンプル準備のステップと少ないポイント ・ オブ ・ ケアなどに最適、高価な熱サイクリング機器を構成します。
逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は、その高い感度と特異性14のための強力な RT-PCR の代替として登場した、生物の阻害物質のための許容のサンプル15、大幅削減分析複雑さとコスト、低い資源の環境に適している単一の温度の操作。RT ランプ、クラシックで実装されている、6 種類のプライマー RNA ターゲット内で 8 つの異なる領域にバインドで構成されます。60 ° C 〜 70 ° C の一定温度で実行して強い鎖置換活性と逆転写酵素と DNA ポリメラーゼを使用しています。
RT ランプの初期段階では、前方と後方内部プライマー (FIP と BIP、図 1 a) 外側前方と後方のプライマー (F3 と B3) と一緒にはダンベル構造、ランプの指数関数的増幅の種子構造を形成します。増幅はループ前方と後方のプライマー (LF と LB)、ダンベルの単一の孤立した地域にバインドするように設計は、促進、複数の繰り返しのあるコンカテマーの形成の結果ループ16。クラシック ランプに基づいて濁度の試金または DNA 間の染料をインターカ レートによる読み出しは多重化のいくつかのレベルが、ジカのポイント ・ オブ ・ ケア検出希望17,18,19完全に適しています。オフのターゲット増幅による偽陽性を生成する傾向があると多重は簡単に得これらのシステムでないです。
これらの問題を管理するには、は、文学は、古典的な RT ランプ アーキテクチャ20,21,22に「鎖置換プローブ」の形で追加コンポーネントを追加します。各プローブにはシーケンス固有の二重鎖領域と一本鎖プライミング領域。一本鎖領域にプローブが付いている 5'-fluorophore と 3' 末端クェンチャーで相補的プローブを変更します。ターゲットがない場合は、近くに fluorophore とクエンチャをもたらす相補的プローブ ストランドの交配による蛍光は認められなかった。ターゲットの存在下で蛍光プローブの一本鎖部分はターゲットの補数にバインドし、変位ポリメラーゼ鎖によっては拡張されます。逆のプライマーによってさらにポリメラーゼ伸張蛍光(図 1 b)の排出量をできるように、その相補的な蛍光に分類されたストランドからクェンチャー鎖の分離を原因します。この設計では、誤検知信号の可能性を減らすこと、ダンベル形成後信号が生成されます。
鎖置換プローブの二重鎖の部分は、任意のシーケンスをすることができ、多重化が適用されると、同じシーケンスが使用異なる fluorophore クェンチャーのペア。このアーキテクチャやウイルスに汚染された尿、血清、蚊にサンプル紙に踏み付け直接試験サンプル準備なしに導入されました。30-45 分以内で生成された人間の目に目に見える三色の蛍光進み、信号が青色 LED とオレンジ色のフィルターを使用して、3 D プリントされた観測ボックスによって想像されたもの。RT ランプ試薬を凍結乾燥、冷凍を必要としないリソース設定を下げるキットの展開が有効になっています。

<table><tbody><tr><td>SafeBlue イルミネーター/電気泳動システム、MBE-150-PLUS</td><td>メジャーサイエンス</td><td>MBE-150</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>G:BOX F3</td><td>ゲルイメージング</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II, 96-well</td><td>Roche Applied Science</td><td>05 015 278 001</td><td>Real-time PCR</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>透析用UFC501096ウルトラフィルトトン膜</td></tr><tr><td>エッペンドルフ5417C遠心分離機</td><td>マーシャルサイエンティフィック</td><td>EP-5417C</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>Myblock ミニドライバス</td><td>ベンチマーク サイエンティフィック</td><td>BSH200</td>ドライバ<td>ス</td></tr><tr><td>フリーゾーンプラス 6リットルカスケードコンソール フリーズドライシステム</td><td>Labconco</td><td>7934020</td><td>凍結乾燥機</td></tr><tr><td>すべてのプライアとプローブ</td><td>IDT</td><td>カスタム</td><td>RT-LAMPプライマーとプローブ</td></tr><tr><td>dNTPセット</td><td>Bioline</td><td>BIO-39049</td><td></td></tr><tr><td>デオキシウリジン三リン酸(dUTP)</td><td>Promega</td><td>U1191</td><td></td></tr><tr><td>Bst&nbsp;2.0ウォームスタート&nbsp;DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0538L</td><td>酵素</td></tr><tr><td>WarmStart RTx逆転写酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0380L</td><td>酵素</td></tr><tr><td>RNase阻害剤、マウス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0314L</td><td>酵素</td></tr><tr><td>南極熱不安定性UDG</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0372L</td><td>酵素</td></tr><tr><td>50bp DNAステップラダー</td><td>プロメガ</td><td>G4521</td><td>マーカー</td></tr><tr><td>LightCycler 480 マルチウェルプレート 96、白</td><td>Roche Applied Science</td><td>4729692001</td><td>リアルタイム RT-LAMP 分析</td></tr></tbody></table>

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

ジカ、デング熱、チクングニヤ ウイルスは、同様の患者の症状を病気の原因、蚊によって送信されます。しかし、異なる下流患者 - 伝送ポテンシャルがある、非常に異なる患者さんの治療を必要とします。したがって、最近のジカの発生は急速に患者でこれらのウイルスを区別するツールの開発が急務し、閉じ込められた蚊は、正しい患者の治療を選択し理解し、リアルタイムで彼らの疫学を管理します。
残念ながら、それらの受信 2016年の緊急電話を含む現在の診断テスト承認を使用、ファーストトラックの状態、計測を必要とする逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) によるウイルス RNA 訓練、ユーザーを検出し、かなりサンプル準備。したがって、彼らは時間を必要とする「承認」参照研究所に送られなければなりません。確かに、2016 年 8 月に (CDC) 疾病対策センターを求めていた妊娠中の女性いた蚊に噛まれ、感染しているかどうか、学習する前に受け入れの 2 〜 4 週間を待たなければジカを示す発疹を開発しました。我々 は非常にテスト サイト、いくつかのリソースと訓練を受けたが、必ずしも認可されなかった者にすることができる必要があります。
このビデオは、多くのサンプルの準備もすべて分析 (環境調査) の押しつぶされた蚊の死体 (患者) のための血清または尿の使用、これらの仕様を満たしていることを示します。蚊の死骸は、第四級アンモニウム (Q 紙) アンモニア処理順を管理するグループ石綿を運ぶ紙にキャプチャされます。これら直接 RNA 分離せずに入れているアッセイ チューブ冷凍のチェーンを必要としない凍結乾燥試薬を含みます。逆のトランスクリプション ループ lamp 法ターゲット固有蛍光タグ移動できるプローブとの変更されたフォームは、3 色の蛍光信号として 30 分内の読み出しを生成します。これはオレンジ色のフィルターを持つハンドヘルド、バッテリ駆動のデバイスで可視化します。シール チューブ不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) dUTP 増幅混合物の存在下での使用と前方の汚染は防がれます。

当初、各 RT ランプ プライマー (表 1)に対応するウイルス RNA 基板ネガティブ コントロールの性能はゲル電気泳動によって評価しました。RT ランプのプライマーは、チクングニア ジカとデング熱 1 ターゲット NS5 領域 (RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ) と nsP2 領域 (非構造タンパク質 P2) に設計されました。テンプレートはアフリカミドリザル腎臓 (ベロ) の細胞で培養ウイルス株から抽出した総 RNA でした。チクングニア感染女性から抽出された総核酸 (DNA ・ RNA) 1 つのケースでAe。 ネッタイシマカ (表 2)。
図 2 aは、RT ランプいくつかの代表的な結果はこれらのサンプルを実行を示します。両方の singleplex と多重化 (3-plexed) の場合、R...

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスを検出する診断機能を多重化します。ターゲット固有の鎖移動できるプローブと等温増幅を使用して検出し、高い感度と特異性を持つこれらのウイルスを区別する診断を示します。

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

この手順の全体的な目標は、大規模なサンプル調製や高価な機器を必要とせず、さまざまな生体サンプルで使用されるマルチプレックスポイントオブケア診断プラットフォームの使用を実証することです。この方法は、単一の反応チューブ内のさまざまなターゲットの検出など、ポイントオブケア診断の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ループ媒介等温増幅と標的特異的鎖置換プローブを組み合わせることで、3つの異なるウイルスを効率的に検出できます。この技術の主な利点は、PCRの代わりに等温増幅を使用し、最小限のサンプル調製で済み、さまざまな臨床サンプルに適用できることです。まず、ペーパーパンチを使用してQ-paperシートを3mm×4mmの小さな長方形にカットします。次に、マイクロステッスルを使用して、ジカ熱に感染した可能性のあるネッタイシマカの雌の蚊を各紙に粉砕します。20マイクロリットルの1モルのアンモニア水溶液を各紙にピペットで固定します。5分後、各紙を20マイクロリットルの50%エタノールで洗い、続いて20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で洗います。BSL-2バイオセーフティキャビネットで約1時間風乾します。乾燥後、ピンセットを使用して各紙を100マイクロリットルのRT-LAMP反応混合物に完全に浸し、摂氏65〜68度で45分間インキュベートします。ジカウイルスから生じる蛍光を、LED光源とオレンジまたはイエローフィルターを備えた3Dプリント観察ボックスを使用して読み取り、記録します。まず、凍結乾燥RT-LAMP試薬が入った各反応チューブに90マイクロリットルの1.1倍再水和バッファーを加え、振とうして溶解します。その後、重力の1, 000倍で短時間スピンダウンします。遠心分離後、ウイルスRNAをスパイクした尿サンプル10マイクロリットルを反応チューブに加え、ピペッティングで混合します。蚊をテストする場合は、蚊の死骸を保持する長方形のQペーパーと、尿の代わりに10マイクロリットルの精製水を追加します。閉じたチューブを摂氏65〜68度にプリセットされたヒートブロックに入れ、30〜45分間インキュベートします。インキュベーション後は、将来のアッセイの汚染を防ぐためにチューブを閉じたままにし、観察ボックスに入れてください。観察ボックスの背面にあるスイッチを入れます。オレンジフィルターでサンプルを観察し、画像が視野の80%を占める距離に保持された携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。視覚化が完了したら、スイッチをオフにしてください。密封されたチューブは、後で視覚化が必要な場合は、できれば冷蔵して暗闇に保管してください。シングルプレックスとマルチプレックスの両方のケースで、RT-LAMP製品はアガロースゲル上で実行するとコンカテマーの文字として表示されます。水を含むネガティブコントロールサンプルは、非感染性の雌の蚊から抽出した全核酸をテンプレートとして使用した非特異的ターゲットコントロールを含む、プライマー自体のバンドのみを提供しました。ジカ熱の緑色蛍光は、FAMで標識された5つの主要なNTとしてプローブを使用して観察されます。薄緑色、黄色の蛍光はチクングニア熱に割り当てられ、プローブはHEXで標識された5プライムNTです。デング熱-1にはオレンジレッドの蛍光が使用され、そのプローブはTAMRAで標識された5プライムNTです。蚊を含む2枚の紙をRT-LAMP混合物に直接沈め、摂氏65度で30分間インキュベートした後、ジカウイルスの存在下で明るい緑色の蛍光が観察されました。9容量のリハイドレーションバッファーと1容量の尿サンプルを使用すると、30分以内に可視の緑色蛍光を生成することができ、画像は任意の携帯電話カメラでキャプチャできます。この技術の開発後、この技術は、臨床診断の分野の研究者が、尿、血液、唾液、または蚊の死骸から蚊が媒介するウイルスを検出するためのポイントオブケアプラットフォームを探求する道を開きました。このビデオを見れば、等温増幅システム(この場合はランプ)を使用して、さまざまな生体サンプルでジカウイルスやその他のアルボウイルスをマルチプレックスで検出する方法を十分に理解できるはずです。

multiplexed-isothermal-amplification-based-diagnostic-platform-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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