多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム
March 13th, 2018
現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスを検出する診断機能を多重化します。ターゲット固有の鎖移動できるプローブと等温増幅を使用して検出し、高い感度と特異性を持つこれらのウイルスを区別する診断を示します。
この手順の全体的な目標は、大規模なサンプル調製や高価な機器を必要とせず、さまざまな生体サンプルで使用されるマルチプレックスポイントオブケア診断プラットフォームの使用を実証することです。この方法は、単一の反応チューブ内のさまざまなターゲットの検出など、ポイントオブケア診断の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ループ媒介等温増幅と標的特異的鎖置換プローブを組み合わせることで、3つの異なるウイルスを効率的に検出できます。
この技術の主な利点は、PCRの代わりに等温増幅を使用し、最小限のサンプル調製で済み、さまざまな臨床サンプルに適用できることです。まず、ペーパーパンチを使用してQ-paperシートを3mm×4mmの小さな長方形にカットします。次に、マイクロステッスルを使用して、ジカ熱に感染した可能性のあるネッタイシマカの雌の蚊を各紙に粉砕します。
20マイクロリットルの1モルのアンモニア水溶液を各紙にピペットで固定します。5分後、各紙を20マイクロリットルの50%エタノールで洗い、続いて20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で洗います。BSL-2バイオセーフティキャビネットで約1時間風乾します。
乾燥後、ピンセットを使用して各紙を100マイクロリットルのRT-LAMP反応混合物に完全に浸し、摂氏65〜68度で45分間インキュベートします。ジカウイルスから生じる蛍光を、LED光源とオレンジまたはイエローフィルターを備えた3Dプリント観察ボックスを使用して読み取り、記録します。まず、凍結乾燥RT-LAMP試薬が入った各反応チューブに90マイクロリットルの1.1倍再水和バッファーを加え、振とうして溶解します。
その後、重力の1, 000倍で短時間スピンダウンします。遠心分離後、ウイルスRNAをスパイクした尿サンプル10マイクロリットルを反応チューブに加え、ピペッティングで混合します。蚊をテストする場合は、蚊の死骸を保持する長方形のQペーパーと、尿の代わりに10マイクロリットルの精製水を追加します。
閉じたチューブを摂氏65〜68度にプリセットされたヒートブロックに入れ、30〜45分間インキュベートします。インキュベーション後は、将来のアッセイの汚染を防ぐためにチューブを閉じたままにし、観察ボックスに入れてください。観察ボックスの背面にあるスイッチを入れます。
オレンジフィルターでサンプルを観察し、画像が視野の80%を占める距離に保持された携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。視覚化が完了したら、スイッチをオフにしてください。密封されたチューブは、後で視覚化が必要な場合は、できれば冷蔵して暗闇に保管してください。
シングルプレックスとマルチプレックスの両方のケースで、RT-LAMP製品はアガロースゲル上で実行するとコンカテマーの文字として表示されます。水を含むネガティブコントロールサンプルは、非感染性の雌の蚊から抽出した全核酸をテンプレートとして使用した非特異的ターゲットコントロールを含む、プライマー自体のバンドのみを提供しました。ジカ熱の緑色蛍光は、FAMで標識された5つの主要なNTとしてプローブを使用して観察されます。
薄緑色、黄色の蛍光はチクングニア熱に割り当てられ、プローブはHEXで標識された5プライムNTです。デング熱-1にはオレンジレッドの蛍光が使用され、そのプローブはTAMRAで標識された5プライムNTです。蚊を含む2枚の紙をRT-LAMP混合物に直接沈め、摂氏65度で30分間インキュベートした後、ジカウイルスの存在下で明るい緑色の蛍光が観察されました。
9容量のリハイドレーションバッファーと1容量の尿サンプルを使用すると、30分以内に可視の緑色蛍光を生成することができ、画像は任意の携帯電話カメラでキャプチャできます。この技術の開発後、この技術は、臨床診断の分野の研究者が、尿、血液、唾液、または蚊の死骸から蚊が媒介するウイルスを検出するためのポイントオブケアプラットフォームを探求する道を開きました。このビデオを見れば、等温増幅システム(この場合はランプ)を使用して、さまざまな生体サンプルでジカウイルスやその他のアルボウイルスをマルチプレックスで検出する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、ジカ、チクングニア、デング熱ウイルスの検出のための多重ポイントオブケア診断プラットフォームを実証しています。この方法は、ターゲット特異的なストランド置換プローブを用いた等温増幅を利用し、最小限のサンプル調製で効率的な検出を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 診断
- ウイルス学
- ポイントオブケア検査
背景
- ジカ、チクングニア、デング熱の現在の診断は複雑で高価です。
- 低リソース環境に適したより簡単な方法が必要です。
- この研究は、新しい診断アプローチを提示することでこれらの課題に対処します。
- 等温増幅は従来のPCR方法に比べて利点があります。
研究の目的
- 最小限のサンプル調製を必要とする診断法を開発すること。
- 単一の反応で複数のウイルスの検出を可能にすること。
- リソースが限られた環境での診断の利用可能性を向上させること。
使用された方法
- ループ介在等温増幅（LAMP）技術。
- ウイルス分化のためのターゲット特異的なストランド置換プローブ。
- アエジプチ・エジプティ蚊の粉砕を含む生物学的サンプルの使用。
- Q-paperシートを使用した簡単なサンプル調製。
主要な結果
- この方法はジカ、チクングニア、デング熱ウイルスを成功裏に検出します。
- 診断において高い感度と特異性が達成されました。
- 最小限のサンプル調製が重要な利点であることが確認されました。
- この技術は様々な臨床サンプルに適用できます。
結論
- この診断プラットフォームはポイントオブケア検査のための有望なツールです。
- これは現在の多重診断の限界に対処します。
- 将来の応用は多様な環境でのウイルス検出を強化する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid discrimination of Zika, dengue, and chikungunya viruses is critical for guiding patient treatment and managing outbreak epidemiology. This multiplexed isothermal amplification platform enables point-of-care detection in clinical and environmental samples with minimal instrumentation and sample preparation. It supports timely decision-making in resource-limited settings where traditional RT-PCR is impractical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antiviral targets by confirming viral presence in complex biological matrices.
- Operational Value: Reduces dependency on centralized labs, accelerating hypothesis testing in discovery workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible format for screening antiviral compounds across multiple arbovirus targets.
- Operational Value: Uses lyophilized reagents and ambient storage, supporting assay scalability and deployment in decentralized labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal monitoring of viral load in preclinical models using urine, serum, or tissue samples.
- Operational Value: Eliminates RNA extraction steps, reducing variability and increasing throughput in efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by enabling rapid, multiplexed viral detection that informs target engagement and mechanism-of-action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening by confirming viral presence in cell culture or animal models.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts compatible with hit confirmation and dose-response profiling.
- Analytics: Generates multiplexed, three-color output enabling parallel assessment of antiviral efficacy against Zika, chikungunya, and dengue.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by allowing consistent viral quantification across sample types.
- Enterprise Reuse: Lyophilized format and minimal training requirements support reuse across geographic sites and project teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antiviral screening by reducing false negatives from inadequate sample processing.
- Operational Value: Enables decentralized testing with minimal infrastructure, lowering operational burden on core laboratories.
- Strategic Value: Supports faster go/no-go decisions in antiviral programs by providing timely target modulation data.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization of candidates through reliable, cross-virus efficacy profiling.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with isothermal amplification principles and fluorescence detection.
- Needs a heat block or incubator maintaining 65–68°C and a handheld observation device with orange filter.
- Demands standardized sample handling to ensure consistency across urine, serum, and mosquito matrices.
- Must account for environmental stability of lyophilized reagents during field deployment.
- Limited to endpoint detection; not suitable for real-time kinetic monitoring without modified instrumentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
RT-LAMP for Detection of Zika-infected Mosquitoes Using Q-paper Technology
2:23
Testing Lyophilized RT-LAMP Reagents on Urine Samples Containing Zika
4:05
Results: Singleplex and Multiplex RT-LAMP for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue 1
5:40
Conclusion
