多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、大規模なサンプル調製や高価な機器を必要とせず、さまざまな生体サンプルで使用されるマルチプレックスポイントオブケア診断プラットフォームの使用を実証することです。この方法は、単一の反応チューブ内のさまざまなターゲットの検出など、ポイントオブケア診断の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ループ媒介等温増幅と標的特異的鎖置換プローブを組み合わせることで、3つの異なるウイルスを効率的に検出できます。

この技術の主な利点は、PCRの代わりに等温増幅を使用し、最小限のサンプル調製で済み、さまざまな臨床サンプルに適用できることです。まず、ペーパーパンチを使用してQ-paperシートを3mm×4mmの小さな長方形にカットします。次に、マイクロステッスルを使用して、ジカ熱に感染した可能性のあるネッタイシマカの雌の蚊を各紙に粉砕します。

20マイクロリットルの1モルのアンモニア水溶液を各紙にピペットで固定します。5分後、各紙を20マイクロリットルの50%エタノールで洗い、続いて20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で洗います。BSL-2バイオセーフティキャビネットで約1時間風乾します。

乾燥後、ピンセットを使用して各紙を100マイクロリットルのRT-LAMP反応混合物に完全に浸し、摂氏65〜68度で45分間インキュベートします。ジカウイルスから生じる蛍光を、LED光源とオレンジまたはイエローフィルターを備えた3Dプリント観察ボックスを使用して読み取り、記録します。まず、凍結乾燥RT-LAMP試薬が入った各反応チューブに90マイクロリットルの1.1倍再水和バッファーを加え、振とうして溶解します。

その後、重力の1, 000倍で短時間スピンダウンします。遠心分離後、ウイルスRNAをスパイクした尿サンプル10マイクロリットルを反応チューブに加え、ピペッティングで混合します。蚊をテストする場合は、蚊の死骸を保持する長方形のQペーパーと、尿の代わりに10マイクロリットルの精製水を追加します。

閉じたチューブを摂氏65〜68度にプリセットされたヒートブロックに入れ、30〜45分間インキュベートします。インキュベーション後は、将来のアッセイの汚染を防ぐためにチューブを閉じたままにし、観察ボックスに入れてください。観察ボックスの背面にあるスイッチを入れます。

オレンジフィルターでサンプルを観察し、画像が視野の80%を占める距離に保持された携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。視覚化が完了したら、スイッチをオフにしてください。密封されたチューブは、後で視覚化が必要な場合は、できれば冷蔵して暗闇に保管してください。

シングルプレックスとマルチプレックスの両方のケースで、RT-LAMP製品はアガロースゲル上で実行するとコンカテマーの文字として表示されます。水を含むネガティブコントロールサンプルは、非感染性の雌の蚊から抽出した全核酸をテンプレートとして使用した非特異的ターゲットコントロールを含む、プライマー自体のバンドのみを提供しました。ジカ熱の緑色蛍光は、FAMで標識された5つの主要なNTとしてプローブを使用して観察されます。

薄緑色、黄色の蛍光はチクングニア熱に割り当てられ、プローブはHEXで標識された5プライムNTです。デング熱-1にはオレンジレッドの蛍光が使用され、そのプローブはTAMRAで標識された5プライムNTです。蚊を含む2枚の紙をRT-LAMP混合物に直接沈め、摂氏65度で30分間インキュベートした後、ジカウイルスの存在下で明るい緑色の蛍光が観察されました。

9容量のリハイドレーションバッファーと1容量の尿サンプルを使用すると、30分以内に可視の緑色蛍光を生成することができ、画像は任意の携帯電話カメラでキャプチャできます。この技術の開発後、この技術は、臨床診断の分野の研究者が、尿、血液、唾液、または蚊の死骸から蚊が媒介するウイルスを検出するためのポイントオブケアプラットフォームを探求する道を開きました。このビデオを見れば、等温増幅システム(この場合はランプ)を使用して、さまざまな生体サンプルでジカウイルスやその他のアルボウイルスをマルチプレックスで検出する方法を十分に理解できるはずです。