テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネルを用いたショウジョウバエのシナプス接続を調べる

この技術の全体的な目標は、テトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルを使用して、ショウジョウバエの単シナプス結合を電気生理学的に特定することです。この手法の主な利点は、簡単で、シナプスの化学的性質を明らかにすることができることです。また、ボリュームトランスミッションやバルクトランスミッションの研究にも適しています。

一般的に、この方法に新しくなったビデオでは、解剖の難しさのために苦労します。しかし、この手法を理解するだけで、ロジックをマウスなどの他のモデルシステムに簡単に移行できます。録音には、7メガオーム付近の抵抗に対応するパッチピペットを用意してください。

また、pH 7.3以下の外部記録生理食塩水を、95%の酸素と5%の二酸化炭素を含むカルボゲンで連続的に曝気します。被験者には、csChrimsonを発現するハエストックを用意し、0.2ミリモルの全トランスレチナールを含む食物に繁殖します。録音には、生後1〜3日の大人を選択してください。

それらをガラスシンチレーションバイアルに入れ、氷冷条件に1分間さらして固定します。次に、解剖スコープと粗い鉗子の光レベルを下げて、麻酔をかけたフライをカスタムメイドの記録チャンバーにロードします。ワックスまたはUV硬化型エポキシで囲むことにより、フライをチャンバーに固定します。

胸部の約半分にホイルを当てて背側を上にして配置します。優れた準備を得るための鍵は、フライが圧迫されたり落ちたりしないように、ホイルに穴を開けてちょうどいいサイズにすることです。両側から光ファイバーライトで準備を照らし、できるだけ暗く保ちます。

次に、4〜6滴の記録生理食塩水で調製物を覆います。次に、解剖用のタングステンワイヤーまたはフィラメントを研ぎます。硝酸カリウム飽和溶液に約20ボルトのAC電流を流し、ワイヤーの先端を溶液に非常にすばやく繰り返し浸します。

20回浸すと先端が鋭くなります。次に、鋭利なワイヤーを使用してキューティクルを取り除き、続いて気管と脂肪体を露出させることで脳を露出させるのに十分な視認性が得られるようにライトを調整します。アンテナローブにアクセスするには、曲がったタングステンワイヤーを使用して、アンテナをホイルシールドの下にそっと押し込みます。

次に、鋭利な鉗子を使用して、関心のある領域を覆っているグリア被覆をそっと引き裂きます。次に、調製物を電気生理学装置に移して記録します。リグで、カルボゲンで泡立たせた記録生理食塩水で調製物の灌流をすぐに開始します。

顕微鏡ステージの上に置かれた重力供給生理食塩水リザーバーを使用します。廃生理食塩水を収集するには、真空ラインと2リットルのフラスコを使用します。次に、パッチピペットに4マイクロリットルの内部記録溶液をロードし、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けます。

次に、アンプのオフセットをゼロにし、テストパルスを供給するようにアンプを設定します。次に、脳の鮮明なビューを得るために、IR斜め照明を調整します。次に、ピペットに陽圧をかけながら、ピペットでセルに近づきます。

細胞に接触したら、正圧を放してピペットをメンブレンに密封します。次に、メンブレンの保持電位をマイナス60ミリボルトに設定します。そして、ピペットは細胞膜とギガオームシールを形成する必要があります。

保持電流は、サブピコアンペアの低レベルまで低下する必要があります。一定のギガオームシールを得るには、陽圧を保ち、組織にぶつかったり細胞に近づいたりしないようにして、ピペットを清潔に保つようにしてください。続行するには、マイナス50からマイナス60ミリボルトのテストパルスを供給するようにアンプを設定します。

テストパルスは、パッチピペットの充電に必要な電流を表す大きな静電容量式過渡電流を明らかにします。容量性の過渡性を除去するには、容量容量補償ノブを調整します amplifier。次に、負圧の短いパルスを印加して細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を取得します。

容量性過渡性の大幅な増加は、成功を示します。保持電流のわずかな増加も観察されるべきです。次に、アンプを電流クランプモードに設定します。

そして、セルの電位をマイナス50からマイナス60ミリボルトの間に調整します。準備として、技術者のプロトコルに示されているようにデータ収集システムを構成します。このシステムには、準備の下に配置された高出力の赤色LEDが必要であり、0.238ミリワット/平方ミリメートルでフライを照らすように配置されています。

次に、シナプス前ニューロンを光遺伝学的に活性化し、csChrimson発現でパルス赤色光を使用します。他の方法も使用できます。テトロドトキシンを適用する前に、40ミリ秒の光パルスに応答してシナプス結合が見える必要があります。

応答がないということは、接続の可能性が低いことを意味します。保持電位は、それに応じて、興奮性または抑制性の結合を強調するように調整されてもよい。接続が確認されたら、生理食塩水で再循環するための生理食塩水の豊富さを設定します。

お風呂の生理食塩水レベルが安定するようにポンプをセットします。次に、1マイクロモルの最終濃度を得るために、十分なテトロドトキシンをシステムに加えます。これにより、パッチが適用されたニューロンのスパイク活動が停止するはずです。

そうでない場合は、システムにテトロドトキシンを追加します。次に、赤色光の短いパルスを印加して、単シナプス結合である可能性が高いものを活性化します。次に、再循環生理食塩水に薬理学的アンタゴニストを添加して、シナプス結合の化学的性質をテストします。

感受性ナトリウムチャネルノッチバックにおけるテトロドトキシンのトランスジェニック発現は、ニューロンの興奮性を救い、大きなプラトー電位をもたらします。触角葉の介在ニューロンは臭いに反応します。しかし、興奮性シナプス後電流は体細胞では容易に解決されません。

では、反応は嗅覚受容体ニューロンの入力から直接生じるのでしょうか?tERPを使用すると、嗅覚受容体ニューロンが局所介在ニューロンと直接接続していることが明らかになりました。触角葉のセロトニン作動性ニューロンの刺激は、局所介在ニューロンの興奮と阻害の混合をもたらします。

広範な5HT受容体拮抗薬であるメチセルギドの適用は、緩慢な過分極をブロックしたが、脱分極には効果がなかったが、メカミラミンは急速な脱分極をブロックした。これは、刺激がコリン作用があることを示唆しています。tERPsは、GABAまたは神経調節剤のいずれかで発生するシナプス外容積伝達を解決するために使用されました。

一例では、テトロドトキシンの適用は、局所介在ニューロンにおける抑制性シグナルを抑制しなかった。この阻害は、セロトニン拮抗薬であるメチセルギドを用いてブロックされ、特定のセロトニン作動性ニューロンからの直接的なシグナルを示唆しています。このビデオを見れば、ショウジョウバエのニューロンから全細胞の記録を取得し、tERPを使用してその伝導性を評価する方法について十分に理解できるはずです。

この手順を試みるときは、忍耐強く、難しい解剖を繰り返し練習することを覚えておくことが重要です。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば約1時間で習得できます。この手順に続いて、化学シナプスの性質などの追加の質問に答えるために、薬理学などの他の方法を実行できます。

テトロドトキシンの使用は非常に危険である可能性があるため、これらの手順を実行するときは、手袋を着用したり少量で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。