5 Bromouridine ラベルと免役沈降法を用いた RNA 合成の検討

この実験の全体的な目標は、ブロモウリジン標識と免疫沈降によってRNA合成の変化を測定することです。この方法は、RNAレベルの変化がRNA合成の変化によって引き起こされたかどうかを測定することにより、RNA代謝の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、任意の種類の細胞培養に使用でき、使用される材料に簡単にアクセスできることです。

プロトコールを開始するには、10センチメートルのペトリ皿に10〜6番目のHEK293T細胞を10ミリリットルの増殖培地で3.5倍10〜6回播種し、48時間後の抽出時に合計40マイクログラムを超えるRNAを得る。播種後、細胞を摂氏37度、CO2.48 5%に維持し、8ミリリットルの成長培地を吸引し、細胞の乾燥を防ぐために2ミリリットルを残します。2ミリモルのブロモウリジンと処理を成長培地に加え、細胞から残りの2ミリリットルを取り除き、増殖培地を含む8ミリリットルのブロモウリジンを再適用します。.

次に、細胞を1時間インキュベートします。インキュベーション後、5ミリリットルのハンク緩衝液で細胞を洗浄し、2ミリリットルの0.05%トリプシンで5分間細胞をトリプシン化します。8ミリリットルの増殖培地を加えて反応を停止し、細胞を15ミリリットルのチューブに移し、細胞を1,000倍gで2分間回転させます。

次に、上清を除去し、RNA単離キットを使用して細胞ペレットから全RNAを抽出し、RNaseフリー水でRNAを溶出します。この手法は非常に感度が高いため、高品質のRNAを扱うことが重要です。したがって、RNA抽出は重要なステップですが、今日のRNA抽出キットでも簡単に実行できます。

調査するサンプルの数と、ピペッティングおよび旋回混合中の損失を考慮して1つの追加サンプルに対して、1つのバッチでビーズを調製します。抗マウスIgG磁気ビーズを渦巻き混合により完全に再懸濁し、RNaseフリーの1.5ミリリットルチューブにサンプルあたり20マイクロリットルのビーズを取り出します。1.5ミリリットルのチューブを磁気スタンドに20秒間置き、ビーズが側面に集まります。

上清を取り除き、マグネティックスタンドからチューブを取り出し、ピペッティングによりビーズを1倍ブロモウリジン-IP緩衝液の40マイクロリットルに再懸濁します。卓上遠心分離機でチューブを2秒間回転させ、磁気スタンドに戻し、上清を取り除きます。次に、ヘパリンを使用してビーズへの非特異的結合をブロックします。

1 1 回ブロモウリジン-IP と 1 ミリグラムのヘパリン緩衝液 1 ミリグラムにビーズを再懸濁し、チューブを 30 分間回転させます。その後、ビーズを1回洗います。ブロモウリジン-IP緩衝液1倍1ミリリットルにビーズを再懸濁し、抗α-ブロモデオキシウリジン抗体のサンプルあたり1.25マイクログラムを添加します。

ビーズを回転させながら1時間インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを3回洗浄します。洗浄したビーズを、ブロモウリジン-IP緩衝液1回に1ミリモルブロモウリジンを添加したサンプルあたり50マイクロリットルに再懸濁し、ビーズを30分間回転させます。

回転後、ビーズを3回洗浄し、ブロモウリジン-IP緩衝液1回のサンプルあたり50マイクロリットルにビーズを再懸濁します。紫外可視分光光度法を使用してRNA抽出物中のRNA濃度を測定し、各サンプルから40マイクログラムのRNAをRNaseフリー水で総容量200マイクロリットルに希釈します。RNAを摂氏80度で2分間変性させた後、卓上遠心分離機でサンプルを短時間回転させます。

紡糸後、200マイクロリットルのブロモウリジン-IPとBSA、RNase阻害剤を2倍加えます。次に、再懸濁して調製したビーズを50マイクロリットルずつ各サンプルに加え、サンプルを1時間回転させます。インキュベーション後、ビーズを4回洗浄します。

ビーズを200マイクロリットルの溶出バッファーに再懸濁してRNAを溶出し、200マイクロリットルのpH 6.6フェノールを迅速に添加して、サンプルから非RNA分子を除去します。サンプルを渦巻いて混合し、卓上遠心分離機で25, 000倍gで3分間回転させます。次に、上相をできるだけ多く、約190マイクロリットル吸引し、200マイクロリットルのpH6.6フェノールクロロホルムを入れたチューブに移します。

サンプル間で同じ量を吸引するようにしてください。サンプルを回転させ、回転させます。スピン後、水上相、約180マイクロリットルを吸引してクロロホルム抽出を行い、200マイクロリットルのクロロホルムが入ったチューブに移します。

サンプルを回転させてから回転させます。水上相(約170マイクロリットル)を吸引し、それを3モルpH6酢酸ナトリウムの17マイクロリットルを含むチューブに移して、水溶液からRNAを中和して沈殿させます。次に、2マイクロリットルのグリコーゲンを追加すると、RNAとともに沈殿し、ペレットがより見えるようになります。

500マイクロリットルの96%エタノールを加えて、塩イオンとRNAとの間の結合を増やし、チューブを数回反転させて混合します。チューブを摂氏マイナス20度で一晩、またはドライアイスで15分間放置します。冷やしたサンプルを回転させ、ペレットを乱さずに上清を捨て、185マイクロリットルの75%エタノールでペレットを洗浄して残留塩分を除去します。

次に、サンプルを摂氏4度で25,000倍gで5分間回転させます。ペレットを乱さずに上清を完全に捨て、蓋を開けた状態でペレットを5〜10分間乾燥させます。ペレットの邪魔にならないように、チューブの側面に塗布した10マイクロリットルのRNaseフリー水にペレットを再懸濁します。.

AsPC-1細胞をブロモウリジンで0時間、1時間、2時間、4.5時間処理した後、トータルRNA抽出とブロモウリジン-IPで処理しました。GAS5とGAPDHはブロモウリジン-IP RNAで測定され、バックグラウンドと比較して9倍および44倍の変化に達するには、1時間の標識で十分であることが示されました。2ミリモルのブロモウリジン治療は、1時間またはより長い4時間の治療HEK293Tいずれにおいても、細胞の形態学的変化を誘発しなかった。

PLK-2阻害は、インプットとブロモウリジン-IPの両方でα-シヌクレインmRNAの増加を引き起こし、定常状態RNAの増加はRNAの合成の増加によって引き起こされることを示唆しています。このビデオを見れば、新たに合成されたRNAをブロモウリジンで標識する方法と、その後のブロモウリジンと標識RNAの免疫沈降を行う方法について十分に理解できるはずです。