大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

この研究では、大腸菌を発現宿主として使用することにより、特定の部位で均一にアセチル化されたタンパク質を生成するための簡単なプロトコルを示します。タンパク質の可逆的なリジンアセチル化は、自然界で最も豊富な翻訳後修飾の1つです。遺伝子の転写、ストレス応答、細胞分化、代謝など、幅広い生物学的プロセスで重要な役割を果たしています。

設計位置で純粋にアセチル化されたタンパク質を生成することは、タンパク質のアセチル化を研究するのに非常に役立ちます。ただし、ほとんどの古典的な方法では困難です。この課題は、遺伝暗号拡張技術によって解決されました。

これは、遺伝子操作されたピロリジルtRNA合成酵素バリアントを利用してtRNA-Pylにアセチルリジンをチャージし、次にホスト翻訳機構を利用してmRNAのUAG終止コドンを抑制し、標的タンパク質の設計位置にアセチルリジンを組み込むように指示します。まず、琥珀色の終止コドンを部位特異的突然変異誘発によって標的遺伝子の対応する位置に導入する必要があります。野生型タンパク質の遺伝子を含むテンプレートプラスミドを増幅し、PCR反応によりプライマーから停止コドン変異を挿入する。

PCR後、増幅した材料をキナーゼ-リガーゼ-Dpn1酵素ミックスに直接室温で1時間加え、環状化とテンプレート除去を行います。25マイクロリットルのチューブに5マイクロリットルの混合物を加え、有能な大腸菌細胞を解凍します。チューブを慎重にフリックして混合し、混合物を氷の上に30分間置きます。

混合物を摂氏42度で30秒間ヒートショックし、さらに5分間氷の上に置きます。混合物に室温のSOC媒体の600マイクロリットルをピペットで分ける。37°Cで60分間振とうしながらインキュベートします。

対応する抗生物質と一緒にプレートに100マイクロリットルを広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。単一コロニーからのプラスミドは、シーケンシングに送られます。第2のステップは、部位特異的なアセチル化タンパク質を発現および精製することです。

プレートから、変異したTAG含有標的遺伝子とアセチルリジン取り込みシステムを含む単一のコロニーをピックアップします。15ミリリットルの新鮮なLB培地に対応する抗生物質を摂氏37度で一晩接種します。15ミリリットルの一晩培養物を抗生物質を含む300ミリリットルの新鮮なLB培地に移し、摂氏37度でインキュベートします。

吸光度が600ナノメートルで5に達したときに、成長培地の最終濃度として5ミリモルのアセチルリジンと20ミリモルのニコチンアミドを添加します。摂氏37度でさらに1時間細胞を増殖させます。次に、タンパク質発現のための誘導剤を添加し、摂氏25度で一晩で細胞を増殖させます。

3, 000 gで15分間遠心分離して細胞を収集します。上清を捨て、細胞ペレットをマイナス80度で保存します。凍結した細胞ペレットを氷上で解凍し、15ミリリットルの溶解緩衝液、5マイクロリットルのβ-メルカプトエタノール、および1マイクロリットルのヌクレアーゼで再懸濁します。

細胞は超音波処理によって破壊されます。粗抽出物を20, 000 gで4度で25分間遠心分離します。上清を45マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過します。

ろ過したサンプルを、1ミリリットルのニッケルNTA樹脂を含むカラムにロードし、20ミリリットルの溶解バッファーで平衡化します。カラムを20ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。標的タンパク質は、2ミリリットルの溶出バッファーで回避されます。

精製したタンパク質をPD-10カラムで2.5ミリリットルのサンプルを加えて脱塩し、3.5ミリリットルの脱塩緩衝液で脱塩したサンプルを回収します。次のステップは、精製されたアセチル化タンパク質を生化学的に特徴付けることです。SDSサンプルバッファーでタンパク質を100度以上で5分間変性させます。

混合物を遠心分離し、SDS-PAGEゲルにロードし、200ボルトで30分間運転します。ゲルを蒸留水で洗い、静かに振ってください。ウェスタンブロッティング用のサンドイッチを作るには、カソードからアノードまで、スポンジ、濾紙、転写バッファー、浸漬したSDS-PAGEゲル、メタノール活性化PVDF膜、別の濾紙、サンドイッチ内の気泡を取り除き、別のスポンジを使用します。

スタックをトランスファータンクに入れます。350ミリアンペアの定電流で45分間運転します。PVDFメンブレンを25ミリリットルのTBSTバッファーで5分間、穏やかに振って洗浄します。

メンブレンを5%BSAとTBSTバッファーで室温で1時間ブロッキングします。希釈したHRP標識アセチルリジン抗体とメンブレンを室温で1時間または4度、穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。メンブレンを20ミリリットルのTBSTバッファーで5分間、穏やかに振とうしながら洗浄します。

この手順を 4 回繰り返します。化学発光基質をメンブレンに1分間塗布します。CCDカメラベースイメージャーで信号をキャプチャします。

同量の溶出画分とタンパク質精製をSDS-PAGEゲルにロードしました。アセチル化タンパク質の収量は野生型タンパク質の約半分であり、これは非常に効率的であり、アセチルリジンと増殖培地を含まない同じ発現株は検出可能な量のタンパク質を産生できず、この特定の位置に標準的なアミノ酸が組み込まれていないため、アセチル化タンパク質の純度が高いことを示しています。ウェスタンブロッティングでは、野生型タンパク質には検出可能なアセチル化がないことが示され、この発現系の非特異的アセチル化のバックグラウンドが低いことが示されましたが、アセチル化タンパク質には明確なバンドがありました。

タンデム質量分析により、アセチル化は、遺伝子内の対応する位置が終止コドンに変異した正しい部位で起こることが確認されました。アセチル化タンパク質の良好な収率と純度を得るためには、高効率と高純度の両方を実現するために、最適化されたアセチルリジン取り込みシステムを使用する必要があります。BL21(DE3)細胞は、純度を高めるために、低バックグラウンドで非特異的なアセチル化に使用する必要があります。

遺伝子取り込みシステムは、真核生物のシステムにおいて、より広範な応用に利用できる可能性があります。