Name: チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶチップ型デジタルPCRによる希少CDH1転写変種検出法。新鮮凍結胃癌組織を用いて低発現標的を高精度に検出し、従来の定量PCRより優れた感度と再現性を実現する。がん研究における希少転写変種の役割解明に貢献する。

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著者編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。

プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
注: この手順はひと新鮮凍結組織 cDNA 分子の数が少ないを検出するため設計します。以前に検証済みの患者由来の胃腫瘍や正常組織サンプルから、まだ凍結中、ドライアイス、ティッシュ セクションをカットされています。
1. RNA の分離及び精製
<ol><li>
RNA の抽出 メモ: RNA の隔離は特定の製品を使用してフードの下で実行されます (材料の表を参照してください)。しかし、様々 な絶縁キット市販されています。<ol>
<li>均質化 RNA 分離試薬と渦の 1 mL と 1.5 mL チューブに細かく切られた新鮮凍結組織サンプルの 50 〜 100 mg 精力的に 15 s. 加温の-80 ° c 管一晩。</li>
		<li>15 ボルテックスによって管内常温 5 分のミックス サンプルをインキュベート s。</li>
		<li>氷の上の管を保つ、クロロホルム、および 15 は積極的に渦を 200 μ l 添加 s。</li>
		<li>室温 60 s 管、4 ° C で 15 分間、12,000 × g で遠心分離を孵化させなさい</li>
		<li>1.5 mL チューブの水相を転送し、グリコーゲンの 20 μ g を追加します。 注意: 慎重に汚染を減らすために中間期または有機層の転送を避けるために重要です。</li>
		<li>500 μ L のイソプロパノール、ミックス、氷上で 10 分間インキュベートしてチューブを反転を追加します。</li>
		<li>RNA の沈殿物に 4 ° C で 15 分間 12,000 × g でチューブを遠心します。 注: RNA 側と遠心分離後はよく見えない、管の下部にゲル状のペレットになります。</li>
		<li>沈殿物を乱すことがなく上澄みを除去し、ピペッティングで 75% エタノール 1 mL で洗います。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 7,500 x g でチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなく、上清を除去します。</li>
		<li>沈殿物は透明になるまで乾燥し、RNase フリー水の 50 μ L に溶解、ペレットをしましょう。</li>
		<li>-80 ° c 少なくとも一晩定量化する前にサンプルを凍結します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ゲノム DNA と RNA の浄化 注: 列に基づく RNA 精製に続いて DNase 消化手順を汚染 DNA を消化するために低豊富なターゲットの分析にお勧め。<ol>
<li>凍結乾燥の DNase 私 (1,500 Kunitz 台) RNase フリー 550 μ L では水を注射すると、静か、バイアルを反転でミックスを使用して、再構成された原液を因数に分割を溶解します。</li>
		<li>1.5 mL チューブでの転送の RNA の 15 μ g のサンプルの計算された容積、DNase 消化の 10 μ L はマイク在庫ソリューション キット (に記載されている材料の表)、DNase の 2.5 μ L からバッファー、100 μ L に水 RNase フリー室温で 10 分間加温。</li>
		<li>組織換散バッファーの 350 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください)、ピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>ピペッティングで 250 μ L の 100% エタノールとミックスを追加します。</li>
		<li>新しいスピン列および 15、12,000 × g で遠心分離にボリューム全体 (700 μ L) を転送 s。</li>
		<li>新しいコレクションの管にフィルターを転送、列、12,000 × g で遠心する 2 分 80% エタノール 500 μ L を追加します。</li>
		<li>フィルターを乾燥する新しいコレクション チューブとスピン列、12,000 × g で 5 分間遠心するのふたを開けるフィルターを 1.5 mL チューブに転送します。</li>
		<li>[フィルター] 列、12,000 × g で 1 分間遠心に直接 RNase フリー水の 14 μ L を追加します。</li>
		<li>氷のサンプルを保つとベンチトップ分光光度計で 2 μ L のサンプルを使用して定量化に進むか、使用するまで-80 ° C で RNA を保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cDNA 合成
<ol><li>RNA、マスター ミックスの 4 μ、1 μ L の逆転写酵素と RNase フリー水滅菌 PCR チューブで 20 μ L の最終巻の場所 1,000 ng。穏やかに混合し、スピンダウンします。</li>
	<li>サーマルサイクラー、次の条件を適用することで反応混合物を孵化させなさい: 25 ° C、42 ° C、85 ° C で 5 分で 30 分で 5 分</li>
	<li>簡単にチューブを遠心、dPCR 解析に進むか、必要になるまでの-20 ° C で保存します。</li>
</ol>3. デジタル PCR の反作用のセットアップ
<ol><li>
dPCR 反応ミックス及び試料調製方法
	<ol>
<li>マスター ミックスと、少なくとも 20 分間室温でアッセイを解凍します。</li>
		<li>300 の濃度に cDNA サンプルを希釈水の 6 μ L で ng。</li>
		<li>優しく渦マスターはミックスし、11.4 μ L の最終巻のマスター ミックスの 8.7 μ L、 CDH1aカスタム設計されたアッセイ プライマー 0.87 μ ヌクレアーゼ フリー水の 1.83 μ L と生殖不能の管にミックスを準備します。 注: CDH1aカスタム設計された分析入門詳細は、材料表を参照してください。</li>
		<li>希薄化後の cDNA サンプル準備ミックス 11.4 μ に転送、優しく、ミックス、簡潔に遠心分離機します。 注: ボリュームは、ピペッティングからボリュームの損失を補うため 20% 過剰を含まれます。すべてのサンプルとないのテンプレートのコントロール (NTC) のミックスを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チップの準備 注: 最適な結果を得るのためにチップをできるだけ早くロードします。<ol>
<li>チップ ローダーをプラグインし、インジケータ ランプが緑色に点灯するまで待ちます。</li>
		<li>プランジャーを軽く引いて浸漬液シリンジのキャップを削除 1-2 mm とこの手順を容易にするため、チップと交換にそれを解放します。</li>
		<li>新しいチップを取るし、サンプルに関連付ける蓋に書かれたコードのメモを取る。</li>
		<li>その側で慎重に蓋を保持、保護フィルムをはがすし、を正しい向きで粘着性がある顔をしてふたを配置します。</li>
		<li>慎重に内部の部品に触れるように注意して、チップをピックアップし、クランプを開くにはレバーを押すことによって正しい位置にチップ巣積載します。</li>
		<li>ローダーに新しい読み込みブレードを読み込み、優しくしっかりと場所にあることを確認するそれをプッシュします。</li>
		<li>空気の泡をせずに読み込みブレード dPCR 反作用の組合せの 14.5 μ L を転送またはチップ上のボリュームを配布するボタンの読み込み黒どのプレス後、ブレードを偏向します。</li>
		<li>浸漬液の注射器を使用すると、先端の表面に触れないように世話チップ表面に約 20 滴を転送します。 注: エッジ上液をこぼさず全体の表面をカバーするために重要です。</li>
		<li>チップと接触し、15 の押しふたをするローダーのアームを回転させる s。</li>
		<li>チップをリリースし、その位置に腕を返すふたのボタンを押します。</li>
		<li>45 ° の角度で組み立てられたチップを保持して慎重に充填ポートを通して注射器と浸漬液を分注、気泡がないかどうかを確認する少しのチップを回転させるし、滅菌ワイプで任意の余分な水分を削除します。</li>
		<li>少なくとも 5 充填ポート上アウェイ チップふた押しの上にラベルが優しく剥離でチップの場合はシール s。</li>
		<li>熱 cycler でロードする準備ができるまで、暗闇の中でチップを格納します。 注: 準備のチップは、2 時間以内使用する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR 反応
	<ol>
<li>蓋を開き、1 つのブロックを使用した場合でも、両方のブロックにアダプターをインストールします。</li>
		<li>サンプル ブロックを正しい位置にチップを置きます。 注: 入力ポートはチップのウィンドウを乱すことがなく上部に浮動する空気の泡を許可する高い位置でサーマルサイクラーの前面に向かって指向になりません。空のチップを使用して、2 つのブロックをバランスします。</li>
		<li>チップを完全にカバーするサンプル ブロックにサーマル パッドを置きます。</li>
		<li>ふたを閉じるし、次の条件を適用する実行、PCR を開始: 10 分; 96 ° c を保持60 ° C 2 分の 98 ° C の 30 のサイクル 45 s;2 分の 60 ° C に保持します。4 ° C で保持します。熱 cycler の電源を切り、少なくとも 10 分間室温でチップを解凍します。 注: 1 時間以内チップ解析を実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チップ解析
	<ol>
<li>計測器のふたを開けてとサーマル パッドを削除し、アダプターからチップを削除します。 注: は、分析まで暗い、きれいな場所でチップを保存します。</li>
		<li>イソプロパノールと滅菌ワイプ チップ表面をきれいにします。 注: 各チップがリークまたは潜在的な問題を調べます。</li>
		<li>データを保存する検出器システムに USB を挿入します。</li>
		<li>検出器システムのチップ トレイを開きロードの正しい位置にチップ フェイス アップ トレイを閉じてください。</li>
		<li>30 を待つ処理 s チップを削除し、次のいずれかを挿入します。</li>
		<li>分析処理のすべてのチップを完了し、ファイルを転送するコンピューターに USB を挿入するを待ちます。 注: 分析の所要時間は約 3 分/チップに 2 です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データの解析と解釈
<ol><li>すべての下流解析の実施に必要なクラウド ベースのソフトウェア プラットフォームに接続します。</li>
	<li>プロジェクトを作成し、目的のチップのすべてのデータ ファイルをインポートします。</li>
	<li>サンプル名を入力してください。染料と「チップの定義」タブで使用される測定を選択します。</li>
	<li>「レビュー データ」タブで、チェック方法徹底的サンプル チップに読み込まれ、どのように多くのデータ ポイントが評価可能な可視化チップが許容できるかどうかを決定します。 注: は、評価可能なデータ ポイントを未満 13,000 チップを拒否します。</li>
	<li>画面の右側にある選択されたチップの散布に移動します。すべてのチップにフルオレセイン amidite (FAM) レポーター色素信号 (y 軸) のための 6,000 のしきい値を適用します。 注: を設定するしきい値は使用法に基づいて異なる場合があります。</li>
	<li>散布の相対的な場所を選択することにより偽陽性の結果を防ぐために怪しげな肯定的な信号をプロット「未定義」でを押すとなげなわツールを使用して削除います。残りのすべての肯定的なスポットは、まれなターゲット分析の cDNA コピーの存在を示します。</li>
</ol>

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</ol>

この作業のための利益相反報告なし。

dPCR は、DNA 分子測定10、11,12,13マイクロ Rna、RNA 転写産物5の定量化のためのこの技術は適応時間にもともと開発されました 14,15。このプロトコルでは、新鮮凍結組織サンプルから派生したまれな転写産物の検出機能を搭載するアプリケーションのリストを拡張した.その目的にではなく大量の cDNA の利用 (300 ng)。この金額は最大 dPCR で使用することができますが、私たちのすべてのサンプルを比較する標準化された条件の設定のために十分だった。6,000 で蛍光信号の閾値を設定し、チップとスキャッター プロット上の肯定的な増幅信号の位置を気に、正常に胃腫瘍組織サンプルでこの...

CDH1遺伝子は、E-カドヘリン、細胞接着、生存、増殖、および移行1の規制による正常胃上皮の維持に関与する重要な要因のエンコードします。有害な生殖の結果として E-カドヘリン蛋白質の損失またはCDH1の身体の変化は、GC2,3の開発に関連付けられています。2 遺伝子のイントロンから生じる非正規議事録では、胃癌4、5の役割を果たすこともという仮説を立てた。特に、このようなコピーは、 CDH1a、GC セルラインで表現が示されているにはない通常胃4から。最近 GC 組織サンプル チップ ベースの dPCR5を使用して GC 患者からCDH1aを検出しました。 dPCR は、初めて、 CDH1a遺伝子転写腸 GC と正常組織でのプレゼンスの評価に使用されました。
遺伝子の発現を決定する金本位法は、リアルタイム定量 PCR (qPCR) です。ただし、結果のデータは、変数をすることができます時々、質の悪い、特に、サンプルでターゲットのレベルが低い。この変動は、ポリメラーゼ活性およびプライマーアニー リングを阻害する非特異的増幅と競争力のある側の反応6につながる、汚染物質によって引き起こされることができます。
DPCR の基本的な生化学的原則が qPCR のそれらに類似している dPCR がゲノム DNA (gDNA) の非常に精密な測定を可能にするいくつかの利点を示しています/相補的 dna (cDNA)。確かに、dPCR は、それぞれはよくゼロまたは単一のターゲット分子を含む何千もの井戸にサンプルの校正分割に依存するエンドポイント反応です。増幅はターゲットのコピーを含んでいる井戸でのみ発生し、蛍光信号によって示されます。元のサンプルのターゲット分子の絶対数は、二項分布のポアソン統計7を使用して合計パーティションに正の比を決定することによって計算できます。
また、dPCR 技術標準曲線を実行する必要があると、それゆえ、関連付けられたバイアスと変動、ターゲット8,9; の直接定量を可能にします。汚染物質とその耐力阻害剤10; による効率とは関係なくより正確で再現性のある結果を出すそれより敏感な qPCR より特定と珍しいターゲットを検出するための信頼性の高い方法は。最後に、背景の分子が付いている競争を減らす複数の反応に、試料の分割と増幅を可能と gDNA/cDNA6 の単一の分子の検出を促進するターゲット検出限界を向上させる.検出とチップを使った dPCR による核酸の定量化はますますコピー数多型に適用されている、DNA の定量化の断片、および突然変異分析11,12,13、与えられた、精度と低材料は入力メソッドの要件です。さらに、dPCR は最近両方マイクロ Rna 遺伝子と14成績証明書5,15の解析に統合されています。

<table><tbody><tr><td>TRIazol 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>グリ</td>コーゲン 15596018 <td></td></tr><tr><td>20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute クリーンアップキット</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D デジタル PCR マスターミックス v2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT カスタムデザインアッセイ</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR 最適化アッセイ濃度: 900 nM (F),&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp;Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Dual Flat Block Sample Module</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio デュアルフラットブロック用3Dチルトベース GeneAmp PCRシステム 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>フラットブロックサーマルサイクラー用QuantStudio 3DデジタルPCRチップアダプターキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3DデジタルPCRチップローダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>電源コード付きQuantStudio 3DデジタルPCR装置</td><td></td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

チップを使ったデジタル pcr による新鮮凍結胃癌組織内cdh1まれなトラン スクリプト変種の検出

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

それは存在しないに対しいくつかの胃癌 (GC) セルの行で表されるに発見されましたCDH1a、 CDH1遺伝子の非正規コピー正常な胃粘膜に。最近では、GC 患者から得られた新鮮凍結腫瘍組織のCDH1a転写バリアントを検出しました。デジタル PCR (dPCR) のチップを使ったアプローチがここに提示してこの変形組織サンプルでの発現を調べた。dPCR は核酸の正確、堅牢で、高感度測定の可能性を提供しています、さまざまな分野で多くのアプリケーションの活用がますます。dPCR は珍しいターゲットを検出さらに、dPCR は、校正器、標準曲線を必要とせず核酸の絶対かつ正確な定量化のための可能性を提供しています。実際には、パーティション分割反応阻害剤耐性と増幅効率を向上させる背景からターゲットを富ませます。このような特徴は、dPCR CDH1aまれなトラン スクリプトの検出のための最適なツールを作る。

ここに示す手順を使用して、我々 は胃新鮮凍結組織でまれな転写バリアントCDH1aの式のチェック。DPCR による解析を行った 21 ペア正常と癌組織サンプルその 11 追加腫瘍サンプル。CDH1aは、正常組織サンプルは、このまれなトラン スクリプト5の存在を示さなかったに対し 15 のうち 32 (47%) の腫瘍の検出でした。非均一荷重チップはあたかも我々 の分析に未満 13,000 のデータ ポイントを持つチップが、拒絶されました。図 1チップは評価 (図 1 a) と非評価 (図 1 bC) の両方のサンプルを表示します。後者の場合、複数の気泡 (図 1 b)、1 つの大きなバブル (<strong class="...

原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR 法について説明します。

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

この方法の全体的な目標は、チップベースのデジタルPCRによって新鮮凍結組織中のまれな転写産物変異を検出することです。この方法は、発がんに関与する可能性のあるまれな転写産物変異の検出など、がん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、存在量が少ないターゲットを検出できるため、ゴールドスタンダードの定量PCRと比較して精度と再現性が向上することです。この方法は、ヒトの新鮮凍結組織における少数のcDNA分子の検出に関する洞察を提供することができますが、他の種類の生物学的サンプルにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、チップを準備し、分析のパラメーターを定義するスキルを習得する必要があるため、苦労します。まず、マスターミックスとアッセイを室温で少なくとも20分間解凍します。次に、0.5ミリリットルのチューブに6マイクロリットルのcDNAサンプルをロードします。また、テンプレートなしのコントロールチューブを作成します。次に、マスターミックスを穏やかにボルテックスし、反応ごとに8.7マイクロリットルを滅菌チューブに分注します。次に、各反応について、0.87マイクロリットルのカスタムアッセイプライマーを添加し、1.83マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。組み合わせを穏やかに混合し、11.4マイクロリットルをcDNAを含む各チューブに移し、テンプレートなしコントロールに移します。次に、チューブを穏やかに混合し、パルス遠心分離を使用してチューブの内容物をプールします。最適な結果を得るには、できるだけ早くチップをロードしてください。チップローダを差し込み、インジケータライトが緑色に変わるまで待ちます。次に、プランジャーを1〜2ミリメートルにゆっくりと引っ張って液浸液シリンジを準備し、キャップを外して先端を追加します。次に、新しいチップの蓋に書かれているコードをメモします。次に、フタをしっかりと横に持ち、保護フィルムをはがし、粘着面を上にしてフタの巣に置きます。次に、レバーを押し下げてclを開きますamp、チップを慎重にチップネストにロードします。次に、新しいローディングブレードをローダーに入れます。軽く押して、しっかりと固定されていることを確認します。次に、14.5マイクロリットルの反応混合物をローディングブレードに移します。気泡を出したり、ブレードをたわませたりしないでください。次に、黒いロードボタンを押して、ボリュームをチップに分配します。ローディングブレードが所定の位置にあることを確認することが重要です。次に、ブレードを充填している間は、気泡の発生を避けるために、ピペットを2番目のストップまで押し下げないでください。また、刃先で刃をたわませないでください。シリンジを使用して、約20滴の浸漬液をチップ表面に移します。先端で表面に触れないように注意し、表面があふれないように完全に覆ってください。次に、ローダーアームを回転させて蓋をチップに接触させ、15秒間押し下げます。次に、蓋ボタンを押してチップを解放し、ローダーアームを静止位置に戻します。次に、クランプを開き、組み立てたチップを45度の角度で保持して、シリンジを介して充填ポートを介して浸漬液を慎重に分配します。次に、チップを少し回転させて気泡を取り除き、滅菌ワイプで余分な液体を取り除きます。チップの境界に液浸液をこぼさないでください。その場合は、密封する前に余分なものを慎重に取り除いてください。最後に、蓋のラベルをそっと剥がし、充填口を少なくとも5秒間塞いでチップケースを密封します。さて、チップは2時間以内に使用し、それまでは暗闇に保管してください。反応を設定するには、1つのブロックを使用する場合でも、蓋を開けて両方のブロックにアダプターを取り付けます。次に、サンプルブロックにチップを置き、その充填ポートをサーマルサイクラーの前面に向けて、ポートをわずかに持ち上げます。空のチップを使用して、2つのブロックのバランスを取ります。次に、サーマルパッドをセットアップの上に置き、チップを完全に覆います。その後、サイクルをプログラムし、蓋を閉めて反応を開始します。反応が終わったら、サーマルサイクラーの電源を切り、サーマルパッドを取り外してからチップを取り外します。チップを暗所で少なくとも10分間室温まで解凍し、1時間以内に分析します。チップ表面をイソプロパノールで洗浄し、漏れやその他の問題がないか検査します。データを保存するには、USBメモリスティックを検出器システムに挿入し、データを保存できます。次に、検出器システムのチップトレイを開き、チップを上向きにロードします。トレイを閉じ、データが処理されるまで 30 秒待ちます。次に、チップを取り外し、次のチップに対してこのプロセスを繰り返します。次に、USBスティックを検出器からコンピューターに移動し、ファイルを転送します。クラウドベースのソフトウェアを開き、プロジェクトを作成して、目的のチップのすべてのデータファイルをインポートします。次に、[Define Chips]タブで、使用する色素とアッセイを選択します。チップが許容されるかどうかを判断するには、[Review Data] タブでチップを視覚化します。サンプルが十分にロードされた場合、少なくとも13, 000ポイントが使用可能であるべきです。次に、選択したチップの散布図を見ます。そこで、アッセイタイプによって定義された閾値を適用します。フルオレセインアミダイトレポーター色素シグナルには、6, 000のしきい値を使用します。次に、誤検知を引き起こす可能性のある疑わしい信号をすべて削除します。なげなわツールを使用して散布図上の疑わしいスポットを選択し、[未確定]オプションを選択します。残りのすべての陽性スポットは、分析された希少なターゲットのcDNAコピーの存在を示しています。ここで紹介した手順を用いて、まれな転写産物多様体CDH1aが胃の新鮮凍結組織に発現しているかどうかを確認しました。チップに複数のバブル、単一の大きなバブル、または13, 000未満のデータポイントがある場合、それは分析から除外されました。FAMチャネルの選択されたしきい値6, 000を超える正の信号は、テンプレートなしコントロールに存在しませんでした。黄色の点は増幅がないことを示します。細かいチップ分析により、低品質のデータポイントがフィルタリングされ、あいまいな結果のリスクが排除されました。増幅を示す青色の信号が見つかったとき、それがチップの境界または気泡の周りにある場合、信号は省略されました。同様に、誤検出のリスクをさらに防ぐために、選択したFAMしきい値を超えるシグナルとプロットの右端にあるシグナルは非特異的である可能性が高く、これもフィルタリングされました。21組の正常組織サンプルとがん組織サンプル、および11の追加腫瘍サンプルを分析しました。全体として、まれな転写産物CDH1aは、32の腫瘍のうち15で検出可能であった。対照的に、21の対照組織サンプルのいずれも、このまれな転写産物の存在を示しませんでした。このビデオを見れば、チップベースのデジタルPCRによって新鮮凍結組織中の希少な転写産物変異を検出する方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すると、適切に実行されれば、サンプルの数にもよりますが、6〜8時間で完了します。この手順を試行する際は、サンプルをブレードに正確にロードすることを忘れないようにすることが重要です。その開発後、この技術は、分子診断の分野の研究者ががん患者のまれな配列変異を探索する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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