マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

この手順の全体的な目標は、マラリア原虫に感染した赤血球によって放出される細胞外小胞の機能を調査することです。この方法は、寄生虫が寄生虫と宿主のコミュニケーションをどのように制御するかなど、マラリア分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、インドテロット細胞による小胞RNAの調節機能の研究下にあるインドテロト細胞による小胞アービタージの可視化です。

手順を実演するのは、Mya Alondez、Smartin Bagu、Bayo Babatunde、すべて私の研究室の大学院生です。マイクロ遠心チューブに、100マイクログラムの細胞外小胞と1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。次に、細胞外小胞を最大速度20, 000倍gで7分間遠心分離してペレットを形成します。

遠心分離が終了したら、ペレットを乱さずに上清を捨てます。次に、細胞外小胞ペレットを100マイクロリットルのジルメートに溶解 C.To、数回ピペットで完全に混合できるようにします。次に、新しいマイクロ遠心チューブに、100マイクロリットルのジルマントCに4マイクロリットルのPKH67エタノール染料溶液を加えます。

染色プロセスの直前に、40マイクロモルの2XPKH67色素溶液を調製します。次に、100マイクロリットルの2つの細胞外小胞懸濁液を等量のPKH67エタノール色素溶液とすばやく組み合わせます。次に、混合物を10回ピペットで動かして、適切に混合されるようにします。

完全に混合した後、細胞外小胞とPKH67エタノール色素溶液を光から5分間離してインキュベートします。インキュベーションの過程で、混合物を3〜4回ボルテックスし続けます。染色反応を止めるには、混合物に200マイクロリットルの血清を加え、余分な色素が結合するまで1分間インキュベートします。

次に、細胞外小胞をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。洗浄後、サンプルを20, 000倍gで5分間遠心分離します。次に、細胞外小胞ペレットを100マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、マイクロリットルあたり1マイクログラムの最終濃度を達成します。

1ミリリットルの完全内皮細胞増殖培地中の内皮細胞をポリエリテンコーティングされたカバースリップに移します。細胞がカバースリップ上で単層を成長させるのを待ちます。単層が形成されたら、培地を慎重に取り出し、1ミリリットルの新鮮な培地を加えて細胞を2回洗浄します。

次に、50 μgのPKH67染色細胞外小胞をカバースリップに加え、4時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引します。結合していない細胞外小胞をすべて除去するには、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。

カバースリップの染色操作には、セルの紛失やカバースリップの破損を防ぐために、細かいトングを使用して細心の注意を払う必要があります。洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水にパラホルムアルデヒド溶液を3%使用して、細胞を15分間固定します。再度、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に0.1%トリタン×100の0.1マイクロリットルを250マイクロリットル加えて細胞を透過化し、室温で5分間インキュベー

次に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄し、400マイクロリットルのブロッキング緩衝液を細胞に加えます。その後、細胞を室温で30分間インキュベートし、非特異的結合を防ぎます。ブロッキング後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を一度洗浄します。

次に、5マイクロリットルのファロイデンストック溶液を200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で1パーセントウシ血清アルブミンで希釈し、各カバースリップの染色溶液を調製します。次に、カバースリップに200マイクロリットルの染色液を加え、室温で20分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。

次に、200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に引っ掛けられた3342の1ミリリットルあたり2マイクログラムの最終濃度を使用して、DNAを30秒間対比染色します。染色後、400マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加えて、カバースリップを2回洗浄します。次に、鉗子を使用してカバースリップを慎重に持ち上げ、スライドガラス上の色あせ防止封入剤の滴の上に反転させます。

ティッシュを使用して余分な媒体をそっと取り除き、マニキュアで周囲を密封します。また、細胞の漂白を避けるために、顕微鏡検査中に細胞を色素に過度にさらさないように細心の注意を払う必要があります。0.4マイクロモルの注ぎ口サイズの24ウェル組織培養インサートで、内皮細胞を播種します。

次に、細胞を培養物中で5日間、邪魔されずに増殖させて、分化した単層を形成します。2日おきに媒体を変え続けてください。単層が形成されたら、上部チャンバーの細胞外小胞1ミリリットルに50マイクログラムを播種します。

次に、ロトミンデキストラン1ミリリットルあたり20ミリグラムをトップウェルに加え、5%の二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。40マイクロリットルの培地から蛍光性ミッションを測定することにより、蛍光デキストランのウェル底への移動を監視します。次に、励起波長を544ナノメートルに、発光波長を590ナノメートルにプログラムして、マルチラベルマイクロプレートリーダーに取り付けます。

血球計算盤を使用して細胞の数をカウントします。次に、内皮細胞を完全内皮培養培地に再懸濁し、100マイクロリットルの内皮細胞増殖培地中の96ウェルプレートで細胞を播種します。ミリリットルあたり0.1〜10マイクログラムの濃度を達成するには、抗生物質を含む培地を100マイクロリットル追加します。

2日おきに、光学顕微鏡で20倍の対物レンズを用いて細胞の生存率をモニターします。さらに10〜14日間細胞の培養を続け、細胞の増殖に応じて2〜3日ごとに抗生物質を含む培地を交換します。次に、各ウェルに10マイクロリットルのMTS試薬を加え、試薬を混合します。

96ウェルプレートを摂氏37度で4時間インキュベートします。4時間後、シェーカーでプレートを短時間攪拌します。次に、処理した細胞と未処理の細胞の吸収剤を、490ナノメートルのプレートリーダーで読み取ります。

レンチウイルス形質導入の1日前に、内皮細胞を1ミリリットルの完全培地に播種します。細胞がレンチウイルス形質導入の50〜80%のコンフルエントに達するまで待ちますチューブを開く前に、レンチウイルス懸濁液を200倍gで30秒間回転させて、こぼれないようにします。次に、臭化ヘキシジメトリンを細胞に加えて、最終濃度が8マイクログラム/ミリリットルに調整され、プレートを静かに渦巻かせます。

レンチウイルスを細胞に加え、再びプレートを30秒間穏やかに渦巻いて、適切に混合されるようにします。レンチウイルス形質導入の効率を高めるには、細胞-ウイルス混合物を300倍gで室温で45分間遠心分離します。次に、細胞-ウイルス混合物を摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、ウイルス粒子を含む培地を廃棄し、あらかじめ温めた新鮮な完全な培地と交換します。2日目に、ピューロマイシンの選択を開始します。完全な培地をピューロマイシン含有培地と交換します。

ピューロマイシンを選択した後、細胞を回収します。製造元の指示に従って、RNA単離キットを使用して細胞からRNAを単離します。逆転写キットを使用して、選択したマイクロRNAで相補的なDNAを単離します。

次に、定量的PCR反応を設定します。内皮細胞による細胞外小胞の内在化をモニターするために、PKH67標識緑色小胞を共焦点顕微鏡を用いて分析した。このアッセイでは、ファルジンとフックスト33342(染色がそれぞれ赤とヌクライズブルーで作用する)を使用して、内皮細胞内の小胞の転座を追跡します。

得られた共焦点画像は、4時間後に内皮細胞による小胞の取り込みが準備ができていることを示しています。次に、内皮細胞の透過性を研究するために、ロダミンbイソチオシオナーデエクストランの単層拡散能力を分析しました。このアッセイは、内皮細胞を1ミリリットルあたり50マイクログラムおよび100マイクログラムの細胞外小胞とインキュベートすると、2時間後に内皮単層の透過性が増加することを示しています。

プロットでは、x軸は細胞外小胞の濃度を表し、y軸は590ナノメートルで読み取られた内皮透過性の倍数変化を表しています。次に、ピューロマイシン処理による内皮細胞の感度を決定するために、死滅曲線をプロットしました。死滅曲線は、ピューロマイシン1ミリリットルあたり0.15マイクログラム未満ですべての細胞を殺すのに十分であることを示しています。

また、内皮細胞から単離されたmicro−RNA451aの発現レベルを決定するために、リアルタイム定量PCRを行った。棒グラフは、ハウスキーパー遺伝子U6に対するmicro-RNA451a転写産物の有意な過剰発現を示しています。その開発後、この技術は、感染症の分野の研究者が、遺伝物質の移動を介した宿主の相互作用と細胞通信におけるEvの役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、レシピエント細胞によるEVの取り込みを可視化する方法や、内皮細胞の制御における低分子を含むRNAの機能を調べる方法について十分に理解できるはずです。

マラリア原虫や人間の血液を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋、白衣の着用、滅菌フードの下での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。