Name: 写真漂白後のココヤシの蛍光回復により、完全な長期的開発クロマチン緩みの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぼう、zygotic FRAP（zFRAP）を用いて受精卵のクロマチン緩みと胚発生能の関連を解析する方法。eGFP-H2B蛍光タンパク質を用いた非侵襲的な可視化技術により、受精卵を傷つけずに長期発生観察が可能となる。

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批判的なコメントおよびテクニカル サポートを提供するためかな岸田、上村聡明長友さやか和歌山聡岸上をありがとうございます。この仕事; ミズーリ州に国立大学の改革を促進するため文部省、文化、スポーツ、科学技術プログラムによって資金が供給された部分的に会科学 (16 H 02593) の昇進、浅田科学財団および t. w. に武田科学振興財団資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

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<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
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著者が明らかに何もありません。

本研究で明らかになった、zFRAP 解析は完全な長期的開発、このメソッドが分子イベントと胚の発育能の関係を明らかにする非常に有用なツールに重大な損傷を発生しません。それらの細胞の差動電位になる 2 つのセル段階の胚のほどまで ES 細胞の状態のような 2 つのセルにプログラムし直す時にクロマチン緩みは 2 細胞期胚5と対等であるに変わります。したがって、, クロマチンの緩みは萌芽期の進化の潜在性のために重要である可能性が。体細胞核が父方の前核だけでなく、母体の前核、体細胞核移植受精卵で買収クロマチンの欠如は、示唆するいると比較して低いクロマチン緩みを示した卵母細胞の細胞質に転送彼らの貧しい人々 の進化の潜在性に関与します。総称して、zFRAP 分析は、リプログラミング機構のゲノムを解明するために有用であることです。
ZFRAP システムは、開発可能性が高い受精卵を選択することが可能になります。法、に加えて、予備研究で spermatid 注入 (ROSI) をラウンドすることが分かった-受精卵港異常なクロマチン緩みを派生しました。その...

受精後クロマチン構造を動的に変更し、, クロマチン構造は最終的に確立された1,2。この間、父方の前核の支配的なクロマチン蛋白はヒストンにプロタミンから変更されます。結果クロマチンは精子と女性の卵子 (例えば、ヒストン バリアント組成、ヒストン修飾) いくつかの点で非常に異なる。したがって、形成された胚性クロマチンはその後の胚発生に重要であると考えられます。ただし、長期間にわたって, クロマチン構造の詳細を明らかにするための努力にもかかわらず受精卵の質を評価するまたは彼らのクロマチン構造を分析することによって 1 セル段階で完全な長期的開発を予測する方法はなかった設立。
以前の研究では、受精卵が非常に緩んでクロマチン構造3ある発見します。現在、クロマチンの緩みや開放性は、胚性幹 (ES) 細胞4潜在的な細胞の分化の重要な要因であると考えられています。ES 細胞、本質的に同質性を示さないが、むしろ異種;ES 細胞コロニーのいくつかは一過性高い微分の潜在性の 2 つのセル段階の胚の割球に匹敵するを取得します。この過渡期状態のような 2 つのセルに ES でクロマチン緩みセル 2 細胞期胚5と同等であるかに変更をします。したがって、クロマチンの緩みは、重要である細胞微分の潜在性、それは受精のクロマチンを広く開くことが可能とはココヤシの進化の潜在性の評価に有用なようです。
ライブ イメージングは、以来、このメソッドは、後続の開発とも完全な長期的開発6個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。ライブ イメージングの方法のひとつとして、FRAP 解析は、着床前の胚や ES 細胞3,4,5におけるクロマチンの緩みを確認する使用されています。FRAP 解析による胚性クロマチン緩みを完全な長期的開発に悪影響を及ぼすことがなく分析する場合、1 セル段階の胚の質の評価のための貴重なツールがあります。しかし、この実験法によって完全な長期的発達に及ぼす影響を行った。最近では、ココヤシのクロマチンの緩みを評価する FRAP を用いた実験機が開発されました。これは、受精卵のための新しい観測システムは、ので、ココヤシ FRAP (zFRAP) と名付けられました。zFRAP は完全な長期的開発を批判的に影響しなかったし、されている7は別途報告します。本報告ではこの実験法のプロトコルの説明します。

<table><tbody><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1200</td><td>FV1000は、FRAP分析にも使用できます(リファレンス#7)</td></tr><tr><td>サーモプレート</td><td>東海ヒット</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr>倒<tr><td>立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニュピレーター</td><td>成重</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr>ピ<tr><td>エズマイクロマイクロマニピュレーター</td><td>プライムテック</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>35mm培養皿</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35×100mmスタイル、体外受精用</td></tr><tr><td>60mm培養皿</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60×15mmスタイル、胚培養</td></tr><tr><td>用 50mm培養皿</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>50×9mmスタイル、ステージ上での操作用</td></tr><tr><td>50mmガラス底皿</td><td>松波</td><td>D910400</td><td>50mm皿 φ27mm、穴サイズ、FRAP分析用</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>有機性 化学薬品</td><td>625071</td><td>ガラスボトムディッシュのFRAP分析用</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>体外受精および胚培養</td></tr><tr><td>ガラス用キャピラリー</td><td>ドラモンド</td><td>1-000-1000</td><td>マウス受精卵の取り扱い用</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>プライムテック</td><td>B100-75-10-PT</td> mRNAマイクロピペットプーラー<td>のマイクロインジェクション用</td></tr><tr><td></td><td>サッター器具</td><td>P-97 / IVF</td><td>注射または保持ニードルの準備用(外側の直径:80 & micro;m、内径:10&マイクロ;m)&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>&nbsp;成重</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 転写キット</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A) tailing kit</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP solution 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES buffered HTF containing 10% PVP</td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Σ</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>テンプレートプラスミド eGFP-H2B mRNA (reference #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Sample loading Dye&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>in vitro転写mRNAの電気泳動用</td></tr><tr><td>フェノール クロロホルム イサミルアルコール</td><td>ナカライ テスク</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>ナカライ テスク</td><td>&nbsp;08401-65</td><td></td></tr><tr><td>東</td><td>洋紡</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>エタチンメイト</td><td>ワコ</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 オティカルパワーメーター</td><td>日置</td><td>3664</td><td>&nbsp;レーザーパワー用パワーメーター</td></tr><tr><td>Stereomicmicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

写真漂白後のココヤシの蛍光回復により、完全な長期的開発クロマチン緩みの解析

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

ライブ イメージングは、個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。最近では、クロマチンの緩みや開放性多能性胚性幹細胞の細胞分化に関与する示されています。それは以前を比較した報告された胚性幹細胞と受精卵港の全能性との関連を示唆している非常にゆるめられた chromatin の構造。しかし、今までは、それが解決されていないこの非常に緩和/オープン クロマチン構造は萌芽期の進化の潜在性のために重要かどうか。本研究ではこの仮説を調べる蛍光によって分析されたどの受精卵の写真漂白後の回復の重要な損傷なしに開発することが実験的システムが開発されました。重要なは、この実験システムには、共焦点レーザー走査型顕微鏡に加えて魔法瓶プレート ヒーターのみが必要があります。この研究の調査結果は、写真漂白 (FRAP) 解析は, クロマチンの分子のイベントは完全な長期的開発のために重要かどうかを調査する使用ことができます後の蛍光回復をお勧めします。

eGFP H2B と zFRAP 分析
適切に作られるエンコーディング eGFP-H2B、移されたバンドによるポリ (図 2 a) テーリングと見られている、mRNA は、授精 (図 2 b) 後 1-3 h、第 2 極体と受精卵の細胞質に注入されました。8 〜 12 の授精後 h、H2B eGFP の発現を示す 2 前核と受精卵は収集され、zFRAP 分析 (図 2) を受けます。FRAP 解析は漂白とリカバリの手順ので構成されます。あらかじめ漂白の段階で eGFP H2B の信号 (2 D 図-1) が観察できることを断ら漂白、一度信号無視できるレベル (<strong class="...

クロマチンの緩みは卵割球の進化の潜在性に関与することが表示されます。ただし、クロマチンの緩みを胚の発達の可能性を信頼性の高い指標として使用ことができるかどうかは知られていません。ここでは、クロマチン緩み評価受精卵が生じる完全な言葉こと実験的システムが記載されています。

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

この接合性 FRAP または zFRAP の全体的な目標は、接合性クロマチンの緩みと胚発生の可能性との関連を調べることです。この方法は、胚発生など、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、分析された接合子が大きな損傷を受けることなく満期まで成長できることです。この分析の実験条件設定と操作は非常に複雑であるため、zFRAP分析のステップを学ぶのが難しいため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。テキストプロトコルに従ってeGFP-H2B RNAを調製した後、ヌクレアーゼフリーの水を使用して、1マイクロリットルあたり250ナノグラムに希釈します。60mmの皿に、PVP-HTFを2〜3滴、Hepes緩衝CZBを5〜6滴、およびeGFP-H2B mRNAをそれぞれ入れます。次に、鉱油を使用して液滴を覆います。ピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスを引き出します。先端を折った後、マイクロフォージを使用してガラスピペットを約30度に曲げます。マイクロインジェクションの前に、マイクロマニピュレーターのステージ上のプレートヒーターがオフになっていることを確認し、mRNA注入中に接合子が死滅しないようにします。その後、10%PVP-HTFを用いて、注射針の内側を洗浄し、コーティングします。次に、先端からガラスキャピラリーに希釈したeGFP-H2B mRNAを充填します。受精した受精卵を2番目の極性体で収集し、そのうちの20〜25個を顕微鏡ステージのチャンバーに移します。次に、保持ピペットで接合子を保持し、ピエゾドライブで透明帯と細胞質膜を切断します。約10ピコリットルのmRNAを各接合子の細胞質に注入します。インキュベーターの外で受精卵を培養することによる損傷を防ぐため、10分以内に注射を完了してください。マイクロインジェクションの10分後に、受精卵を少なくとも3滴のCZBで洗浄し、FRAP分析まで摂氏38度で培養します。zFRAP分析の1時間前に、共焦点顕微鏡のステージに取り付けられたレーザーとホットプレートをオンにします。温度を摂氏38度に設定します。60mmのガラス底の皿に、6〜10マイクロリットルのHepes緩衝CZB培地をピペットで入れ、鉱物油で覆います。次に、接合子が収集されるまでヒーターで皿を温めます。共焦点顕微鏡で接合子を見つけやすくするには、ディッシュの中央全体に滴を配置することが重要です。授精後8〜12時間で、5〜10個のeGFP-H2B発現接合子を採取し、それらを予め温めたHepes緩衝CZB培地の6〜10マイクロリットルの滴に移します。正確な定量分析を行うには、受精卵をHepes緩衝CZB滴の中心に向けて配置することが重要です。メーカーの指示に従って、漂白とイメージングの条件を設定します。たとえば、[Acquisition Setting] で、スキャン速度をピクセルあたり 4 マイクロ秒に設定し、サイズを 512 に設定します。デジタルズームを5つに増やし、「DyeList」を開いて「eGFP」を選択し、観察時間を1ポイント6秒、画像の数を12に設定します。次に、「刺激設定」パネルを開始し、UseScannerで「メイン」をクリックし、スキャン速度をピクセルあたり10マイクロ秒に設定します。「PreActivation」を3フレームに、アクティベーション時間を5秒に設定。次に、Focus x2 "をクリックし、Stop"刺激設定パネルの下でClip Rectをクリックし、ROIを40 x 40ピクセルに設定します。「Time」と「XY」をクリックし、光パワーメーターを使用してレーザーパワーにアクセスします。レーザーを測定するときは、ライトをオフにしておくことが重要です。レーザーゲージを調整して漂白およびイメージングレーザー出力を設定した後、ツールバーで「ライブ」をクリックし、「ライブプロット」を開始し、対物レンズにオイルを置きます。チャンバーをステージにセットし、ドロップの中の接合子を見つけます。受精卵を見つけたら、フォーカスx2 "をクリックしてROIの位置を決定し、次に「ライブプロット」ウィンドウで、eGFPチャネルの蛍光強度のHVパワーゲージを約2, 000に調整します。zFRAP分析を開始するには、XYをクリックします」FRAP分析後、「シリーズ完了」FRAP分析データを取得し、「名前を付けて保存」をクリックして、ファイルを2Dビューイメージ「優先名前付きファイルとして保存します」。「ROIをコピー」と「ROIを貼り付け」を使用して、それぞれ参照領域と背景に準備します。次に、ROI、REF、およびBGを選択し、2Dビューの「画像ウィンドウ」で「シリーズ分析」をクリックし、「RoFRAPデータを取得」をクリックし、「ライブプロット」ウィンドウで「保存」ボタンをクリックします。テキストプロトコルに従ってデータ計算を実行します。授精後8〜12時間後に、eGFP-H2B"の発現を示す2つの前核を有する受精卵を採取し、zFRAP分析を行った。漂白後、eGFP-H2Bが核質の未漂白領域からROIに流入したため、eGFP-H2Bの蛍光シグナルの強度はわずかに回復しました。回復曲線は、雄の前核が雌の前核よりも早く、より多くの可動画分で回復したことを示しています。これらの画像とグラフに示されているように、zFRAP分析後、CZB培地で洗浄および培養された受精卵は、大きな損傷を受けることなく胚盤胞段階まで発達しました。全期間の発育を分析するために、2細胞期の胚を偽妊娠した母親の卵管に移植しました。この表で報告されているように、zFRAP 分析された胚の出生率は、無傷の胚よりもわずかに、しかし大幅に低かったが、zFRAP コントロールなしの出生率と同じでした。さらに、zFRAP分析された受精卵から得られた仔は、健康で完全に発達しているように見えました。この手順を試行するときは、他の拡張を待つことを忘れないでください。フォーカスドリフトを避けるためのすべての予算の反対。このビデオを見れば、接合子のクロマチンの緩みを分析する方法についてよく理解できるはずです。

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。...

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。...

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

高度に圧縮された有糸分裂クロマチンの脱凝縮の分子メカニズムは明確に定義されていません。HeLa細胞から単離された有糸分裂クロマチンクラスターとXenopus...

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II...

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。...

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぼう、zygotic FRAP（zFRAP）を用いて受精卵のクロマチン緩みと胚発生能の関連を解析する方法。eGFP-H2B蛍光タンパク質を用いた非侵襲的な可視化技術により、受精卵を傷つけずに長期発生観察が可能となる。

写真漂白後のココヤシの蛍光回復により、完全な長期的開発クロマチン緩みの解析

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