Name: 光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 学ぶ非天然アミノ酸を哺乳類細胞に効率的に導入する方法。GPCRの光架橋マッピングと生細胞でのバイオオルソゴナル標識技術を用いて、タンパク質間相互作用と受容体動態を解析する革新的アプローチです。

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この作品は CO822/2-1 (Emmy Noether プログラム) と CO822/3-1 陽性の補助金の下で、ドイツ研究振興協会 (DFG) によって設立されました。

著者を宣言する競合があります。

プロトコルでは、直交ペアの ncAAs の哺乳類細胞で発現したタンパク質混入の効率を評価するためにシンプルで信頼性の高いアッセイについて説明します。FACS に基づいて広く使用されているアッセイを尊重しこの方法の主な利点は同時準備と多数のサンプルの測定を可能にしては簡単に普通のソフトウェアを使用して分析データを提供します。哺乳類細胞における直交ペアを分析する媒体スループット方法の可用性は、新しい直交ペアの開発及び既存の向上にとって非常に重要です。確かに、哺乳類システムの大規模なランダムなライブラリと死者/生きている選択の生成を介して直交ペアの進化を実行不可能します。アッセイは、比較的短い時間内で実験的努力を投資することによって小さなサイズのスクリーニング ライブラリ (メンバー数百) をことができます。この試金によって合理的に設計された tRNA セットを上映、ピロリシン システム30の効率を大幅に高める新しい Trna を生成でした。古典的な組み合わせ EGFP/mCherry は、EGFP が混入効率性と内部統制として mCherry の記者として機能するという蛍光の読み出しに使用され...

タンパク質化学プローブの遺伝的定款は、構造および動的な生細胞のネイティブ コンテキストに直接蛋白質機能の調査を促進する強力な手法です。今日では、非正規のアミノ酸 (ncAAs) 装備されて最も異なる化学グループの何百もの生合成1,2,3,4site-specifically タンパク質に組み込むことが。それらの間の 1 つを見つける写真されております5、写真ケージ6,7,8,9写真切替可能なアミノ酸10,などの感光性 ncAAs11, アミノ酸ベアリング緊張したアルケンとアルキン触媒無料 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 ,17, ダンシル18クマリン9,19, とプロダン20,21 fluorophores が付いて、運ぶアミノ酸およびアミノ酸として他の生物物理学的プローブを装備ポスト翻訳の修正1,2,3,4,22,23,24,25とも。
NcAA の遺伝のエンコーディングは、専用アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS)、同種サプレッサー tRNA、通常リボソーム合成の際に黄色停止コドンに対応 ncAA を取り入れたペアで有効です。ncAARS/tRNA のペアは、ホストの有機体すなわち内因性のペアしないクロストークで直交になるように設計されています。技術は、原核生物と真核生物のホストと哺乳類に簡単に該当するセルの両方確立しました。哺乳類細胞における定款の ncAA のペアは 3 つの主要な直交システムに基づいています: B. 中等度好熱27 (Ec からチロシン琥珀サプレッサーによるエシェリヒア属大腸菌の26から TyrRS を組み合わせたチロシル システムTyrRS/Bst山芋ペア)、エシェリヒア属大腸菌ロイシル システム (EcLeuRS/tRNAルーCUAペア)6,18,28および古細菌由来ピロリジル システム (PylRS/tRNAPylペア)3、tRNApyl ブランドがあるという自然な琥珀色の抑制。一般に、各 ncAA は特殊な ncAARS によって認識されます。NcAA の構造に応じて、ncAARS は、いくつかの合成は、複数の ncAA を受け入れることができますがの TyrRS LeuRS や PylRS、進化を介して取得されます。
直交のペアは、単にプラスミッドのベクトルを使用して、セルにインポートされます。最も一般的かつ効率的なプラスミドは bicistronic であり、合成酵素と直交ペア29を形成する tRNA の両方をエンコードします。変更用に指定されたサイトで琥珀のコドンを軸受興味の蛋白質のための第 2 プラスミド エンコーディングは cotransfected です。NcAA は細胞成長培地に単に追加されます。ただし、異なる専門のグループはしばしば同じ ncAA の体用もプラスミドの構造のさまざまなバリエーションを使用します。ベクトル合成酵素の種類、コドン使用合成酵素遺伝子、プロモーターの使い方、tRNA と tRNA 式カセット数のバリアントの遺伝子配列で構造が異なります。さらに、異なる ncAAs の取り込み効率は、異なるシンテターゼ、品質、tRNA および他の要因の30の異なる触媒効率のため大幅に変更できます。したがって、それは手で直交ペア、全体的な蛋白質の表現を向上させるいくつかの最適化のステップを実行して、目的のアプリケーションに最も適したシステムを選択する両方の効率を評価する高速で信頼性の高いメソッドを持つことが重要得られます。
直交ペア29 (図 1) の効率を評価するためのシンプルで堅牢な蛍光ベースのアッセイを設けています。アッセイ、細胞が一緒にレポーターの bicistronic プラスミド寛容な位置 (EGFPタグ) 黄色停止コドンを軸受緑色蛍光タンパク質の両方をエンコードの直交ペアのプラスミッドのエンコーディングで cotransfected とmCherry 遺伝子。全体セル lysates の赤と緑の蛍光プレート リーダー、96 ウェル プレートでの独立したチャンネルで読み取られます。赤い蛍光性の強度は、測定サンプルとトランスフェクション効率のサイズの直接推定値を与えるに対し、緑の蛍光性の強度は直接琥珀色の抑制の効率と相関します。蛍光に基づいて同様の試金に関してアシスト セル (FACS) を並べ替え読み上げる31,32アッセイは、詳細セル全体の人口でタンパク質発現の包括的な評価を与える通常の実験条件の代表的な容易なデータ取得と標準ソフトウェアによる処理を提供しています。全体的に、アッセイの主な利点は、サンプル数が多いために、媒体は並行して分析できます。この試金を使用して、Pyl 直交系30の効率を向上させるサプレッサー Trna の合理的に設計されたライブラリを上映しました。この作品は、この分析を実行し、光橋 ncAA p アジドフェニル-L-フェニルアラニン (ウェット) 定款の直交ペアの最適化との比較など、応用事例を示す実験的プロトコルをについて説明します種類のアミノ酸 (図 2) の取り込み効率。
最後の年に ncAA のツールは非常に強力な構造を調査する実証されているし、G タンパク質の機能的な側面結合受容体 (Gpcr)33,34,35,36,37,38. ヒトでは、Gpcr 膜受容体 (800 人) の大家族を形成し、治療薬の主なターゲットを表しています。Gpcr の直接構造解析まだやりがいや補完的な生化学的手法が非常に彼らの調査のため必要があります。我々 が GPCR にサーフェスをマップし、リガンド結合ポケット34を発見光橋 ncAAs の使用の先駆者します。シュワンツの混入のための最適なシステムを使用して、我々 は体系的に生きている哺乳類セルに直接 GPCR の全体細胞ドメイン全体シュワンツを設立しました。UV 照射、シュワンツは近隣の分子が共有結合キャプチャ ナイトレンと反応性の高い種を形成します。リガンドをシステムに追加すると、シュワンツは受容体の位置に近づくバインドされたリガンドを明らかにするための近接プローブとして機能します。このように、神経ペプチド ホルモン私 (Ucn1) クラス B GPCR 副腎皮質刺激ホルモン-放出-因子受容体のタイプ 1 (CRF1R)33 Urocortin のバインディング モード初披露。最近、アゴニスト及びアンタゴニストの同じ受容体38の異なるバインドのパターンを開示しました。同様のアプローチは、orthosteric と他のペプチドや他の Gpcr の39,の40,41,の42の小分子リガンドのアロステリック結合部位を明らかにする他のユーザーによって適用されています。本稿では、光橋 GPCR 表面のマッピングの研究室において実験的プロトコルについて説明します。メソッドは、比較的高速な簡単なと標準生化学演習で適用されるように特別な装置を必要としません。重要なは、立体構造データが不足しており、リガンド結合部位を特定するだけでなく、またファーストクリーニング完全に変更された受容器からの情報を既存の in vitroデータを補完する貴重なツールを提供するアプローチ、生細胞の生理学的な環境。
新規の ncAAs 側鎖化学グループ超高速触媒無料 bioorthogonal 化学に適した軸受の最近の開発は蛋白質に超解像イメージングの最後の世代の蛍光物質をインストールする可能性を開いたライブで直接細胞の2,43を実行します。このようなケミカル アンカーは、緊張した cyclooctyne SCOK14BCNK12,17ビシクロ [6.1.0] nonyne と TCO のトランス cyclooctenes * K13,15,17他の ncAAs の間でノルボルネン16,17,44またはシクロプロペン45,46基をかくまっています。かさばる ncAAs bioorthogonal 化学 PylRSAFとして通常示される PylRS の変形によって組み込まれている (突然変異を示す Y271A、 M. barkeriの PylRS の Y349F)、その他アドホック進化 ncAARSs17よると同様,44. bioorthogonal アンカーがいくつ分43,48ラベリング高利回りを与える逆電子需要ディールス ・ アルダー付加環化反応による tetrazine 試薬47と反応します。ただし、直交の ncAA 設立システムの全体的な効率が低いため Gpcr のラベルにこの強力なアプローチの応用にチャレンジしております。私たちの強化された Pyl のシステムを使用して、我々 は最近 Gpcr と超高速 GPCR は、生きている哺乳類セル30の表面上のラベルにこのようなアミノ酸の高収率定款を実証しました。ラベル付けされた受容体の通り彼らは生理学的アゴニストの受容体を活性化時に内面のまだ機能している。Bioorthogonal 定款の実験的プロトコルが Gpcr に固定し、ラベリング手順をここで説明します。小さな明るい fluorophores が付いている Gpcr で装備は、高度な顕微鏡技術を介して生きているセルの GPCR の構造ダイナミクスの研究に向けた最初の基本的なステップです。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td><td>カール・ロス</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>カール・ロス</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-アジドフェニルアラニン (アジ)</td><td>バケム</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>ブロムフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>カール・ロス</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>カルボベンジルオキシ-L-リジン (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>シクロオクチン-L-リジン (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>カール・ロス</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>化学発光試薬 (ECL)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l&nbsp; p-クマル酸 DMSO 中 ; 30&nbsp;% H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000年&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>ルミノール</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td>カール<td>ロス</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>カールロス</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>カール<td>ロス</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>p-クマル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine 臭化水素酸塩</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜 Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk Powder&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>カール・ロス</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>テトラジン-Cy3</td><td>イエナ・バイオサイエンス</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>カール・ロス</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>トランス-シクロオクテン-L-リジン (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2.5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>ドイツ語コレクションMicroorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305 HEK293T</td><td></td></tr><tr><td>cells</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 x 8 Watt tubes</td></tr><tr><td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td><td>E2AziRSの腐植遺伝子は、ヒト</td><td>U6プロモーターによって駆動されるサプレッサーtRNA Bst-Yamの4つのタンデムコピーと、PGKプロモーターによって駆動されるAzi-tRNA合成酵素(EAziRS)の強化された変異体のヒト化遺伝子の1つのコピーを含む</td>Geneart(Life Technologies)<td></td>プラスミドによって合成されました</tr><tr><td>POI-TAG変異型プラスミド</td><td></td><td></td><td>CMVプロモーターによって駆動されるPOIをコードするプラスミドで、C末端がFLAGタグに融合し、所望の位置にTAGコドンを有する&nbsp;</td></tr><tr><td>crf1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>pcDNA3.1のMCSにクローニング</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td>のMCSにクロー<td>ニング Genart(Life Technologies</td><td></td>)が合成した<td>pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2抗体複合体</td>のMCSにクローニング&nbsp;<td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A8592&nbsp;</td><td>モノクローナル、マウスクローンM2で産生</td></tr><tr><td>Goat-anti-rabbit-HRP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit-anti-CRF antibody</td><td>home-made</td><td>PBL #rC69</td><td>polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Rabbit-anti-Ucn1 antibody</td><td>home-made</td><td>PBL #5779</td><td>polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78(1999年)</td></tr></tbody></table>

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における bioorthogonal 化学の gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

遺伝的非正規アミノ酸 (ncAAs) 黄色停止コドン抑制を介して定款は、生細胞に直接人工プローブと反応性タンパク質をインストールするのには強力な手法です。各 ncAA はホストの有機体にインポートされる専用直交サプレッサー tRNA/アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS) ペアが組み込まれます。異なる ncAAs の取り込み効率大幅異なるできいくつかのケースで満足できます。直交ペアは AARS または tRNA のいずれかを操作することによって改善できます。ただし、tRNA や AARS の大規模なライブラリと死者/生きている選択方法を使用しての進化には哺乳類細胞で、可能ではありません。ここでは、哺乳類細胞における直交ペアの効率を評価するための簡易で堅牢な蛍光ベースの分析が表示されます。アッセイは、AAR/tRNA バリエーションそれなりの努力と合理的な時間内の数百数十をスクリーニングできます。ピロリシン直交系の効率を大幅に向上させる新しい Trna を生成するこのアッセイの使用説明は、ncAAs の G タンパク質の研究への応用とともに結合受容体 (Gpcr)、ncAA のオブジェクト挑戦しています。突然変異誘発。最初に、体系的に組み込むことで受容体の細胞外表面部分を通して光橋 ncAA、そのまま受容体の異なる配位子の結合部位は生細胞に直接マップされます。第二に、GPCR に最後の世代の ncAAs を組み込むこと、超高速触媒無料受容体の蛍光色素をラベル付けを発揮、bioorthogonal ひずみ昇格逆ディールス ・ アルダー付加環化反応 (SPIEDAC) 生きている細胞を悪用します。NcAAs できます一般に適用するには、そのサイズに個別に蛋白質をメソッドが関心を持つアプリケーションの数です。また、ncAA 定款は特別な装置を必要としないし、標準生化学研究所で簡単に実行されます。

蛍光アッセイの概要は、図 1に描かれています。アッセイは、3 つのアプリケーションで採用されています。まず初めに、Pyl 直交ペアで Lys(Boc) の定款の tRNA の亜種の数は除かれます。Lys(Boc) は、アミノ酸立体 Pyl のようです。Pyl は市販、Lys(Boc)、PylRS の標準的な基板として使用されます。選別された Trna を tRNA に基づくpyl ブランド。それぞれの tRNA のバリエーションは、単一拠点またはループや tRNA 安定性と真核生物の翻訳機械との互換性を改善するために設計された茎で塩基の変異を負いません。TRNA の設計のすべての詳細については、私たちの最近の仕事の30のとおりです。典型的な結果は、図 2 aで説明: 異なる Trna を与える別の抑制効率測定蛍光量明確に反映されています。値再現性の高い生物学的トリプリケートの小さな誤差...

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) を研究への応用を説明します。

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

このプロトコルの全体的な目標は、哺乳類細胞における非標準アミノ酸の取り込み率を高め、タンパク質間相互作用表面のマッピングや表面受容体の生体直交標識など、生細胞環境での生物学的問題に取り組むことです。アンバーコドン抑制を使用すると、さまざまな非標準アミノ酸がさまざまな効率で取り込まれます。私たちは、哺乳類細胞における非標準アミノ酸の取り込み速度を短時間で容易に比較するために、蛍光アッセイを確立しました。当社のGPCR表面に光架橋性非標準アミノ酸を体系的に取り込むことで、リガンド結合部位のマッピングが可能になり、生命細胞から直接摂取受容体の貴重な情報を得ることができます。生体直交化学に前世代の非標準アミノ酸を組み込むことで、生哺乳類細胞のハイエンドイメージングアプリケーション向けに、小さくて明るい蛍光色素によるGPCRの部位特異的で超高速の触媒フリー標識を実現します。まず、2つの6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルの完全な増殖培地に600,000HEK 293細胞を播種します。サンプル数と同じ数のウェルを準備し、野生型EGFPおよび模擬トランスフェクションサンプル用の2つの追加ウェルをそれぞれ調製します。トランスフェクションの1時間前に、調製したばかりの非標準アミノ酸ストック溶液を適切な量ですべてのウェルに加え、最終アミノ酸濃度が0.25〜0.5ミリモルになるようにします。細胞をトランスフェクションするには、1 マイクログラムのプラスミド DNA と、試験対象のシンテターゼ t-RNA ペアのコードを、1 マイクログラムのレポータープラスミド DNA とマイクロ遠心チューブで混合します。別々のチューブで、EGFP野生型リファレンスと模擬トランスフェクションを使用して、同一のトランスフェクションを調製します。次に、DNAを含む各チューブに100マイクロリットルの乳酸緩衝生理食塩水を追加します。短時間混合した後、PEIと乳酸緩衝生理食塩水1マイクロリットルあたり1マイクログラムの6マイクロリットルを各チューブに加えます。すぐにボルテックスし、室温で10〜15分間インキュベートします。各ウェルから400マイクロリットルの細胞培地をDNA PEI混合物に移し、pHを中和します。次に、DNA混合物を細胞に滴下します。トランスフェクションの48時間後に培地を吸引し、2ミリリットルの予熱PBSで細胞を1回すすいで細胞を回収します。0.5ミリモルEDTAを添加した800マイクロリットルのPBSを加え、摂氏37度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、ピペッティングで上下させて細胞を剥離し、懸濁します。次に、細胞懸濁液を、5ミリモルの塩化マグネシウムを添加した200マイクロリットルのPBSを含む微量遠心チューブに移します。サンプルを重力の800倍で2分間遠心

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Chemistry

化学

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡イメージングシステムを採用することにより、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）効率のピクセルレベルのマップは、ホモオリゴマー複合体を形成するために仮定膜受容体を発現する細胞に対して得られる。効率マップをFRETから、我々が検討されてオリゴマー複合体に関する化学量論的情報を推定することができます。...

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。...

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。...

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。...

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。...

遺伝暗号拡張を用いた細菌分泌タンパク質の超解像イメージング

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組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

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光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

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