タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

この方法は、ハンブルク超高速イメージングセンターが調査しているように、核形成の時点、結晶成長のメカニズム、ナノ/マイクロ結晶の調製方法など、タンパク質結晶化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、サンプルの進化をリアルタイムで監視し、さまざまな結晶化段階での溶液中の粒子の半径方向分布などの貴重な情報を取得できることです。この方法は、タンパク質の微小結晶化の洞察を提供することができますが、古典的な結晶構造解析に使用されるタンパク質や、中性子回折に使用される大きなタンパク質結晶の成長にも使用できます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、独自の結晶化装置の動作原理を示すため、重要です。まず、2ミクロンの滅菌シリンジフィルターを使用して、16ミリリットルの1.2モル酒石酸ナトリウム溶液と16ミリリットルの蒸留水をろ過します。沈殿剤と水のボトルに5ミリリットルのろ過溶液を入れます。

次に、ボトルを実験チャンバーのポンプホルダーに取り付けます。ソフトウェアウィンドウで、温度を摂氏20度、相対湿度を20、溶媒として水を使用して実験パラメータを設定します。実験チャンバーの正面ドアを開け、カバースリップキャリアを取り外します。

清潔でシリコン処理されたカバースリップをキャリアに置き、デバイスに戻します。環境条件を確保するために、実験室を閉じてください。テキストプロトコルにあるメインポンプの特性を使用して、Pump Zeroのスイッチを入れ、水流を作成します。

指定された調整ネジを手動で操作して、カバースリップの中心に位置を向けて、水流を調整します。ポンプ 0 をオフにしてから、ポンプ 1 のスイッチをオンにして、前と同じように液体の流れを作成します。ポンプ1のストリーム位置をポンプゼロに固定された位置に調整します。

ポンプ1のスイッチを切った後、使用済みのカバースリップを新しい清潔なカバースリップと交換して、結晶化実験に使用してください。ソフトウェアパッケージを使用して新しい実験ファイルを作成します。実験ファイルに、Thaumatococcus daniellii由来のタンパク質をThaumatinとして入力します。タンパク質濃度は14ミリグラム/ミリリットル、沈殿剤は酒石酸ナトリウム、沈殿剤濃度は1.2モルです。

新しい実験ファイルをロードしてこの情報をアクティブにした後、Pump Zeroを使用して小さな水滴を追加し、タンパク質液滴上の位置をマークします。タラボタンを押して、ミクロバランスをゼロにします。実験チャンバーの上蓋を開け、ウォーターランドマークに8マイクロリットルのThaumatin溶液をピペットで移します。

新しいThaumatinドロップを登録するには、まず「New Drop」をクリックして、実験ファイルから初期条件を属性付けします。次に、 定数」 ボタンをクリックして、液滴からの水の自然な蒸発を補正します。CCDカメラを使用して、Pump Zeroがタンパク質ドロップを狙っているかどうかを確認します。

水流が水滴の外側を狙っている場合は、ポンプゼロの位置を再調整します。DLSレーザーのスイッチを入れ、調整ネジを手動で使用してレーザービームをタンパク質ドロップに配置します。測定時間を 60 秒、2 回の測定間の待機時間を 10 秒、測定回数を 300 として DLS パラメータを入力します。

[スタート]ボタンをクリックして、DLS測定を開始します。DLSグラフィック表現の1つを選択して、サンプルの品質を確認します。テキストプロトコルに示されているように、スケジュール表に蒸発ステップの条件を入力します。

次に、「Automation」ボタンをクリックしてサンプル蒸発ステップをアクティブにします。サンプルの蒸発ステップが終了したら、「停止」ボタンをクリックします。定数ボタンをアクティブにして、液滴の重量を一定に保ちます。

この機能により、自然サンプルの蒸発の不測の事態を補い、さらなる行動が取られるまで濃度変化が起こらないようにします。次に、テキストプロトコルに記載されているように、スケジュール表に沈殿物添加ステップの条件を入力します。Precipitant Additionステップをアクティブにするには、[Automation]ボタンをクリックします。

結晶化液滴の経時的な進化を追跡するには、CCDカメラを使用してThaumatin結晶の外観を確認します。DLSグラフィック表現を使用して粒子サイズ分布を確認します。また、表示ウィンドウを使用して、重量と実験パラメータの進化を確認します。

このウィンドウに表示されるすべての情報は、結晶化中の分銅変化に基づいてリアルタイムで計算および表示され、超高感度天びんによってオンラインで記録されます。きれいなスタンダードテラサキプレートに3ミリリットルのパラフィンオイルを加えてコーティングします。パラフィンオイルをプレートウェルに分散させるには、プレートをさまざまな角度でゆっくりと動かして、オイルが72ウェルすべてを覆うようにします。

プレートに浮かんでいるオイルを注ぎ出して、余分なパラフィンオイルを取り除きます。「停止」ボタンをクリックして、結晶化実験を終了します。結晶化液滴を含むサンプルキャリアを慎重に取り出します。

ピペットを使用して、結晶化液滴の2マイクロリットルのアロコートをテラサキプレートのウェルに入れます。油下プレートの結晶化滴を回収することにより、顕微鏡やテラサキプレートと連携する他のダイオリスト技術を使用して、サンプルの結晶成長の安定性を定期的にチェックできます。ここに示されているのは、単量体タンパク質から原子核、ナノ結晶、および微結晶の形成までの全結晶化プロセスにおけるタンパク質滴の粒子サイズの成長を示す半径プロット分布です。

ここで、プロットは、タンパク質液滴の重量に対する経時的な進化を、計算されたタンパク質濃度と沈殿物濃度とともに表しています。ここに示されているのは、実験終了時のThaumatin微結晶の記録写真です。液滴は、タンパク質溶液に飽和した非常に豊富な量の小さな微結晶を示しています。

このテクニックをマスターすると、適切に行えば1時間30分で完了します。この手順を試行する際には、マイクロドージングシステムのDLSレーザーをタンパク質液滴に調整することが重要です。このビデオを見れば、タンパク質サンプルの結晶化を成功させるために、この結晶化装置を簡単に取り扱う方法を十分に理解できるはずです。

この方法は、結晶化液滴に直接結合するin situ動的光散乱により可能になります。これにより、半径分布のすべての変化を監視できるため、結晶化またはタンパク質沈殿のいずれかに特定の分布パターンを特定できます。この手順に続いて、クライオ電子顕微鏡法や電子回折などの他の方法を適用して、追加の質問に答え、溶液中のサブマイクロメートルサイズの粒子の結晶状態を確認できます。

この手法の意味するところは、DLSマップが結晶成長前の溶液中の粒子の2倍サイズの分布の明確なパターンを示しているため、核生成の2段階理論にまで及びます。