慢性的な痛みの治療に遺伝子組換えタンパク質の開発

これらの手順の全体的な目標は、抗炎症性サイトカインIL4とIL10の融合タンパク質を産生し、その品質を制御し、慢性炎症性疼痛のモデルを反映してその機能活性と鎮痛特性を評価することです。この詳細な方法は、新規生物製剤の開発と、その品質と機能性のテストに役立ちます。これらの技術の利点は、十分な量の組換え融合タンパク質を作製できるため、in vivoでの鎮痛特性の評価が可能になることです。

新たに開発された融合タンパク質の治療可能性を評価するには、十分に特性評価されたバッチを用意し、さまざまな行動試験を使用することが重要です。これらの方法の意味するところは、慢性疼痛に対して非常に必要とされている新しい治療法への洞察を提供するだけでなく、他の炎症性疾患に対する可能性も広げるということです。一般に、これらの方法に不慣れな科学者は、さまざまな分野の専門知識が必要なため、ここに示されているすべての手順を実行できるようにするのに苦労します。

テキストプロトコルに従って500ミリリットルの三角フラスコで100ミリリットルのHEK293F細胞を継代培養した後、各細胞フラスコに6.6ミリリットルのDNAトランスフェクション試薬混合物を添加します。細胞を摂氏37度、CO2 8%、湿度95%で、125 rpmで回転するオービタルシェーカーで3日間培養します。次に、分泌されたIL4-10融合タンパク質を含む培養上清を回収します。

タンパク質精製を行うには、100ミリリットルの10倍濃縮細胞培養上清を、あらかじめ調製したIL4結合セファロースビーズカラムに1分間1ミリリットルの流速で通します。50ミリリットルのPBSを使用してカラムを洗浄します。次に、12.5ミリリットルの0.1モルグリシン緩衝液を適用して、結合したIL4-10融合タンパク質を1分あたり1ミリリットルの流速で2.5ミリリットルの画分に溶出します。

次に、350マイクロリットルの1モルトリス緩衝液(pH 9)を各画分に加え、pHを7にします。乾燥直径16mm、分子量カットオフ3.5Kの透析チューブを使用して、中和された画分を2リットルのPBSに対して一晩透析します。次に、細孔径0.45μmの使い捨てフィルターを使用して、透析画分をろ過滅菌します。

滅菌済みのIL4-10融合タンパク質溶液を分注し、マイナス80°Cで保存します。溶出したIL4-10融合タンパク質の純度を評価するには、まず12%SDS-PAGEゲル上でサンプルを泳動し、そのゲルをクマシーブルーで染色します。次に、1ミリグラムあたり1ミリグラムのタンパク質を40マイクロリットルをカラムにロードすることにより、高圧サイズ排除クロマトグラフィーを実行します。

精製されたIL4-10融合タンパク質の各バッチの濃度は、製造元のプロトコルに従ってIL10 ELISAおよびBCAタンパク質アッセイキットを使用して測定します。RPMI培地を使用して、精製されたIL4-10融合タンパク質の3倍連続希釈を、1ミリリットルあたり5〜1,215ナノグラムの濃度範囲で調製します。48ウェルプレートのウェルに、50マイクロリットルのIL4-10融合タンパク質、75マイクロリットルのRPMI培地、25マイクロリットルのLPS、および100マイクロリットルのヒト血液を追加します。

プレートを摂氏37度、CO2 8%、湿度95%で18時間インキュベートします。次に、メーカーのプロトコルに従ってTNF-α ELISAを使用して、培養上清中のTNF-αの濃度を評価します。調製したカラギーナンまたはCFA溶液を、注射前に少なくとも15分間、室温で30ゲージの針を備えた注射器に保持します。.

次に、麻酔されていないマウスの後足の親指に、針を約0.5センチメートル挿入し、かかとに向け、20マイクロリットルの化合物を注入します。フォン・フレイテストを使用して痛みの測定を行うには、動物を金網のスタンドのアクリルケージに入れ、マウスが少なくとも15分間順応するのを待ちます。0.02〜4グラムの範囲のフォンフレイフィラメントを足の表面に対して垂直に十分な力で塗布し、皮膚に対してわずかに曲げるのに十分な力で塗布し、約3秒間保持します。

各髪の毛に反応して前足の離脱閾値を測定し、適用された髪の毛から足が離れる動きを正の離脱反応と見なします。動物を事前に温めたガラスプレートの上のケージに入れ、測定の前にマウスが少なくとも15分間順応するのを待ちます。ハーグリーブス装置を使用して、集束した可視光線で動物の足を加熱することにより、熱回収潜伏時間を決定します。

動的体重負荷試験の前に、各動物の体重を測定します。マウスの動きを記録するカメラを支えるカバーに組み立てられた床計装の動的体重負荷システムに動物を置きます。動物が0.5〜1分間順応するのを待ってから、マウスの動きを5分間記録します。

次に、各ビデオの分析を実行し、ソフトウェアが指定した時間枠で各手足がソフトウェアによって正しく認識されていることを確認します。注射可能な化合物を、27ゲージの針に接続されたきれいな25マイクロリットルガラスのハミルトンシリンジに埋め戻します。マウスをテーブルの上に置き、その頭を装置のノーズコーンに配置し、1分あたり2リットルの酸素流量で1.5〜2%イソフルランでマウスの鎮静を維持します。

マウスが適切に麻酔されていることを確認するために、足をつまんで反応しないことを確認します。マウスの背骨を肋骨の後方でしっかりと保持します。針をL5とL6の腰椎の間に垂直に配置し、皮膚を通して椎間腔に慎重に挿入します。

テールフリックが発生したことを確認して、正しいターゲティングを確認します。片足のフリックのみが観察される場合は、針が正しく配置されていない可能性があります。次に、5マイクロリットルの化合物をゆっくりと注入し、数秒待ってから、針をゆっくりと引っ込めます。

ここでは、アフィニティークロマトグラフィー画分を含むSDS-PAGEゲルの代表的な写真を示します。IL4-10融合タンパク質の2つの異なるグリコフォームに対応する溶出画分では、35キロダルトンと37キロダルトンの2つのバンドが観察されます。この図は、2つの異なるIL4-10融合タンパク質バッチの全血アッセイにおける力価アッセイの結果を示しています。

LPS誘導性TNF-α放出の用量依存的な阻害が観察され、2つのIL4-10融合タンパク質バッチに対して同等の生理活性が示されました。これらの実験では、2%カラギーナンの足底内注射により持続的な炎症性疼痛が誘発されました。導入後6日目に、マウスにIL4-10融合タンパク質を髄腔内に注射しました。

IL4-10は、機械的痛覚過敏と熱痛覚過敏の両方を有意に解消し、注射後24時間で最大の効果に達しました。ここでは、20マイクロリットルのCFAの足底内注射によって炎症性疼痛が誘発されました。各足の体重負荷は、動的体重負荷装置を使用して測定されました。

これらの結果は、足底内CFA注射が患部の足の体重負荷を減少させたことを示しています。足底内CFA注射の7日後、IL4-10融合タンパク質の髄腔内注射を行いました。2日後、罹患した足の体重負荷の減少は、ビヒクル注射マウスと比較して減衰しました。

これらの手順を習得すると、培養細胞1リットルあたり3ミリグラムの融合タンパク質を得ることができます。融合タンパク質の将来のGMP生産に適した発現系を選択することを心に留めておくとよいでしょう。この新しい融合タンパク質の鎮痛効果を調べるために、神経損傷や化学療法による神経障害など、他の慢性疼痛モデルを用いることができる。

このビデオでは、さまざまな行動テストが示されていますが、他の痛みのテストでは、条件付けられた場所の好みも実行できることが示唆されています。髄腔内注射には十分な訓練を受けた人員が必要であり、注入量はかなり限られていることを忘れないでください。このビデオを見れば、融合タンパク質の作製方法と、さまざまな疼痛モデルでのin vivoでのその有効性試験方法について十分に理解できるはずです。