シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

この手順の全体的な目標は、成体マウスに心筋内アデノウイルス注射することにより、in vivoで心臓特異的な遺伝子操作を達成することです。この方法は、分子メカニズム、整列性心臓損傷、および遺伝子治療の有効性に関する心臓血管研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、換気がないこと、マウスが手術から迅速に回復すること、再現性があり、実行が容易であることです。

それでは、始めましょう。処置の日に、精製したアデノウイルスベクター溶液をマイナス80°Cから温め、氷上に保存します。アデノウイルスが解凍したら、フェイスマスク、滅菌ガウン、滅菌手袋を着用します。

そして、アデノウイルスチューブに75%エタノールをスプレーします。ウイルスを滅菌層流フードに移し、50マイクロリットルのウイルス溶液を50マイクロリットルの滅菌済みハミルトンシリンジに吸引します。30ゲージの針をシリンジに取り付けます。

シリンジを直立位置に回します。針の先端に溶液の滴が見えるまで、プランジャーを静かに押し下げて、針の先端をウイルスで満たします。次に、さらに30マイクロリットルのアデノウイルス溶液をシリンジに慎重に吸引し、シリンジを氷の上に置きます。

アデノウイルスをマウスの心臓に注射するには、つま先をつまむことに反応しないことで適切な鎮静レベルを確認し、動物の目に軟膏を塗布します。動物の胸の上部と腹部を剃ります。市販の脱毛クリームを露出した皮膚に塗ります。

1分後に濡れたガーゼを使用して、クリームと残りの髪の毛を取り除きます。3つのヨウ素クロルヘキシジンベースの消毒スクラブを使用して、胸の左下を滅菌します。次に、手術部位に穴を開けた手術用ドレープで動物を覆い、新しい滅菌手袋を着用します。

次に、滅菌技術と器具を使用して、剣状突起から腋窩まで0.5センチメートルの皮膚切開を行い、鉗子とマイクロモスキート止血器を使用して、大胸筋と小胸筋を鈍く解剖します。大胸筋と小胸筋を引っ込めて、肋間腔を露出させます。そして、マイクロモスキート止血剤を使用して、4番目の肋間腔を貫通して開きます。

利き手でない方の人差し指で胸壁の右側をそっと押して、心臓を切開部に向かって動かします。次に、同じ手の人差し指と親指で外部化された心臓を慎重に固定し、利き手を使用して、左心室の腹側、背側、および側壁のそれぞれの心筋に10マイクロリットルのアデノウイルス溶液を注入します。最後の注射後、直ちに心臓を胸腔内腔に戻します。

そして、胸壁を切開部位に向かってそっと押して、胸腔内腔から手動で空気を排出します。5 ottシルク縫合糸で皮膚を横長のマットレスパターンで閉じ、マウスを摂氏37度のヒートパッドに置き、完全に回復するまで監視します。次に、使用済みのハミルトンシリンジと30ゲージの針を高温高圧滅菌器で滅菌し、滅菌した針を適切な鋭利物容器に廃棄します。

ルシフェラーゼを封入したアデノウイルスの心筋内注射から5日後、in vivoイメージングでは、特に心臓におけるルシフェラーゼの強力な過剰発現が示され、ウェスタンブロット分析で確認でき、非標的臓器形質導入がないことが示唆されています。ウェスタンブロット解析では、ビタミンD受容体の発現が有意に増加することも示されています。そして、ビタミンD受容体をコードするアデノウイルスを注射したマウスの左心室。

RNAビタミンD受容体を標的とする短いヘアピンをコードするアデノウイルスを注射した動物では、受容体の発現が低下しています。対照的に、ビタミンD受容体の発現は、どちらの左心室注射動物の右心室でも有意に変化しません。この方法を習得すると、適切に実行すれば、2分以内に完了することができます。

この手順に続いて、心筋梗塞における特定の細胞療法の有効性など、追加の疑問に答えるために、心臓細胞注射などの他の方法を行うことができる。