Name: 細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ キイロショウジョウバエ幼虫の血球抽出法。病原体侵入の可視化と3Dモデル再構成により、昆虫の免疫応答メカニズムを詳細に解析できます。共焦点顕微鏡を用いた細胞感染研究の標準プロトコルです。

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MCherry 表現コクシエラ ラベンダーの株を提供するため博士ロバート ・ Heinzen に感謝しております。博士ルイス ・ テイシェイラにありがとうはえの在庫を提供する無脊椎動物虹色ウイルス 6 およびブルーミントン ストック センターを提供します。このプロジェクトは、NIH グラント R00 AI106963 (A.G.G.) に、ワシントン州立大学によって一部で賄われていた。

1 感染前のヴィヴォ。
<ol><li>媒体および装置<ol>
<li>生殖不能の条件の下で新鮮なショウジョウバエ血球分離培地 (DHIM) 75% シュナイダーのショウジョウバエを含む準備中] 25% で胎仔ウシ血清 (FBS)、フィルター殺菌それ。</li>
		<li>顕微鏡下で 10 cm × 10 cm パラフィン フィルムの 2 〜 3 個をレイヤーします。</li>
		<li>ガラス毛細管を準備します。キャピラリーの引き手のヒーターを最大の 55% に設定します。キャピラリー チューブを約 10 μ m の鋭いポイントに引き出します。</li>
		<li>バックフィル鉱油と毛細血管。</li>
		<li>Nanoinjector (図 1A) に充填キャピラリー チューブを組み立てるし、先端から鉗子 (図 1B) を破壊して融合キャピラリー チューブの先端を開きます。先端の外径は、血球の簡単取り込みのため 100 μ m をする必要があります。</li>
		<li>キャピラリー チューブの先端からできるだけ多くのオイルを取り出し DHIM と入力します。アップ撮影の体液と油の境界線の容易な視覚化のため油と DHIM の気泡が含まれます (図 1B')。</li>
	</ol>
</li>
	<li>体液抽出<ol>
<li>ピックアップ 3rd令ショウジョウバエ幼虫内部から食品の壁が優しく鉗子を使用バイアルし、100 μ m ストレーナー (図 1C) にそれらを置きます。3rdの幼虫は、大人の女性が肥沃な卵を次の 3-6 日を発見されています。 注: これらの実験使用遺伝子型、w1118;P {w+ mC= Hml GAL4.Δ} 2、P {w+ mC= UA 2xEGFP} AH2、のでこれらの動物からの血液細胞表現強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 顕微鏡による細胞の同定を支援します。</li>
		<li>幼虫を 5 mL の滅菌水を注ぐし、余分な水分を除去する 5 s. 位ワイプ タスク上にストレーナー ストレーナーを振る (図 1C')。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに幼虫を移します。それらの 5 の CO2ガス麻酔 s (図 1D)。</li>
		<li>背側 (図 2A) に直面するいると、実体顕微鏡下でパラフィン フィルム上に幼虫を配置します。</li>
		<li>場所幼虫の後方のボディに軽くガラスキャピラリの場所でそれを保持し、後部のキューティクルを破壊は、良い先の尖った鉗子 (図 2B) を使用して開きます。</li>
		<li>パラフィン膜 (図 2C) に流れる体液を許可します。</li>
		<li>パラフィン フィルム上で一度に 20 50 幼虫から血液を含む体液のプールを作る。</li>
		<li>Nanoinjector (図 2D) に毛細管ガラスを使用してプールの体液を取る。 注: 体液の約 10-20 μ L 必要があります。</li>
		<li>DHIM (図 2E) 500 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに体液を取り出します。</li>
		<li>1.2.4 の手順を繰り返します) - 1.2.9) 幼虫の各バッチの。</li>
	</ol>
</li>
	<li>血液細胞の数をカウントします。<ol>
<li>死んだ細胞を染色する 0.6 mL 遠心チューブに 0.4% トリパン ブルー溶液 5 μ L をピペットします。優しく DHIM と血球、ピペットを使用して 1.5 mL チューブを混在させる DHIM 0.6 mL 遠心チューブに血液細胞を含むの 5 μ L を転送、軽く混ぜます。</li>
		<li>トリパン ブルー: 血球の 1:1 混合物からの細胞の 10 μ L をピペットの検定に。</li>
		<li>ライブ血液細胞がないトリパン ブルーと、hemocytomter の 4 コーナー フィールドの各青染色、計算式を使用しての 1 ミリリットルあたり血液の濃度の数をカウントします。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> X; の 1 ミリリットルあたりのライブ血液の濃度は、a、b、c、および d は、検定でフィールドの各 4 (トリパン ブルー色素排除によって決定される) として生きているセルの数を数えます。細胞カウントの合計数の 2 で除算は、トリパン ブルー色素の細胞の 1:1 希釈によるものです。トリパン ブルー染色細胞は死んでいると見なされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
前のヴィヴォ感染症<ol>
<li>各実験に必要な縦長と生物学的に基づいたセルのシード処理する井戸の数をレプリケートを決定します。5.0 × 104血球が感染 RNA および蛋白質の浄化のために望ましい。</li>
		<li>DHIM で次の数式を使用して感染を希釈する病原体在庫量を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> 感染症 (MOI) の多様性は、ウイルスの数又は細菌セルあたり希望します。 注: 使用 MOI は個々 の実験、試金の実行に依存します。ここで、10 のゲノム同等 (GE)/ c.burnetii、リステリア菌の 10 CFU/セルまたは IIV6 の 1 の TCID50/cell のセルを使用しました。</li>
		<li>24 ウェル プレートの各ウェルに DHIM 適量をチューブでウイルスや細菌のボリュームに追加することによって病原体の媒体の 500 μ L を準備します。</li>
		<li>12 mm 丸いカバー ガラス (厚さ号 1) 24 ウェル プレートのウェルにします。</li>
		<li>24 ウェル プレートのウェルに、血球を含む DHIM を分割します。</li>
		<li>よく血球に病原体の媒体の 500 μ L を追加します。</li>
		<li>5 分間 1,000 x g でプレートを遠心します。</li>
		<li>28 ° C で 1 時間のプレートを孵化させなさい15 分毎優しく後ろからプレートをフロント、し 5 の右に左に傾け手で s。</li>
		<li>H の後 1 侵略/添付ファイル手順 1.4.8 の)、優しくピペットの病原体中を洗い新鮮な DHIM と血球と新鮮な DHIM の 500 μ L でそれを補充します。</li>
		<li>感染した血球を目的の時間にインキュベートします。これらの実験により, c.burnetii- または IIV6 に感染した血液細胞が 24 h とリステリアインキュベート-感染した血液細胞は、1、2、または 4 時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2体内感染。
<ol><li>感染症<ol>
<li>暖かい室温 15 分板のショウジョウバエフルーツ ジュース寒天プレートは以前作られていますは、20をについて説明します。<ol>
<li>寒天の 30 g を加える水のオートクレーブ 700 mL 40 分のためのそれ。</li>
			<li>10 mL の無水エタノールにメチルパラベンの 0.5 g を溶解します。</li>
			<li>フルーツ ジュース濃縮液 300 mL に、メチル パラベン ソリューションを追加します。</li>
			<li>すぐにオートクレーブ寒天液に濃縮ジュースをミックスし、5 mL を 10 × 35 mm シャーレに分注します。</li>
			<li>プレートは、15 分間冷却後 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>準備手順 1.2.1 3rd齢幼虫) - 1.2.3)。</li>
		<li>寒天酵母ペーストを配置します。(図 3A) の乾燥を避けるために幼虫を移行できます寒天プレートに細かいカットを作る。パラフィン フィルム (図 3B C) を使用して鉗子をかざして 0.001 mm 先の尖ったタングステン針を組み立てます。</li>
		<li>高価 mCherry の 50 μ L をピペット表現する-c.burnetii (5.95 × 109 GE/mL) パラフィンにステレオの顕微鏡の下で映画し、細菌のプールに幼虫を配置。</li>
		<li>細菌のプールに幼虫を配置します。タングステン針 (図 3D) で幼虫を刺します。寒天プレート (図 3E) 上に幼虫を転送します。</li>
		<li>寒天プレート上に残りの病原体媒質を転送し、パラフィン フィルム プレートをシールします。</li>
		<li>希望の時間は感染後 (図 3F) までプレートに湿った空気中の幼虫を維持します。実験の結果, c.burnetii-感染した幼虫は 24 h のプレートに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>体液抽出と血球のめっき<ol>
<li>準備中および次のステップ 1.1 装置)。</li>
		<li>12 mm 丸いカバー ガラス (厚さ号 1) 24 ウェル プレートのウェルにします。井戸に DHIM の 500 μ L をピペットします。</li>
		<li>体液から抽出手順 1.2.4 感染幼虫) - 1.2.8)。</li>
		<li>さて次に体液を取り出すステップ 2.2.2)。</li>
		<li>2.2.3 を繰り返す) と 2.2.4) 幼虫の複数のバッチの。</li>
		<li>5 分間 1,000 x g でプレートを遠心します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 可視化
<ol><li>固定および汚損<ol>
<li>井戸の丸いカバー ガラスで解決する血球を可能にした後軽く各ウェルからメディアを削除します。</li>
		<li>優しく落ち着いた血球の各ウェルに 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 200 μ L を追加します。室温で 20 分間血球を孵化させなさい。</li>
		<li>削除 4 %pfa と軽く 200 μ L の PBS の 0.1% を含むを追加トリトン X-100 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を各ウェル。血球室温で 10 分間、インキュベートします。</li>
		<li>PBS を削除し、優しく 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を各ウェルの 200 μ L を追加します。血球室温で暗闇の中で 10 分間、インキュベートします。</li>
		<li>DAPI のソリューションを削除し、優しく PBS を各ウェルに追加します。室温で 5 分間血球を孵化させなさい。</li>
		<li>ガラス顕微鏡スライドに antifade 取り付け中の 10 μ L をドロップします。</li>
		<li>各ウェルから PBS を除去した後細かい指摘の鉗子を用いた 24 ウェル プレートからカバー ガラスを削除します。スライド ガラスの antifade マウント媒体にカバーガラスを下向き血球とそっと置きます。</li>
		<li>暗い一晩でそれを置くことによって乾燥するスライドを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>共焦点レーザー顕微鏡<ol>
<li>DAPI、EGFP、および mCherry の 3 つのカラー イメージングの共焦点顕微鏡を構成します。次の設定を使用: DAPI の励起 (ex) 405 nm、発光 (em) 415 480 nm;488 ex EGFP nm、em 493 564 nm;587 ex mCherry nm、em 597-700 nm。</li>
		<li>顕微鏡と 63 X を使用してサンプルを中心にサンプルを配置/1.4 開口数 (NA) の目的。イメージングのためのビューのフィールドで必要な血球を探します。</li>
		<li>サンプルの適切な露出を得るためにレーザー パワーと検出器ゲインを調整します。露出レベルはサンプル全体の厚さに適したように複数の z 平面を確認してください。</li>
		<li>全血球の z 軸の上下の位置を見つけます。Z 区分のための開始および終了位置としてこれらの位置を設定します。</li>
		<li>画像、血球を含む領域をスキャン ズームを使用のみです。3 X のズーム倍率が使われます。</li>
		<li>X − y 平面で 1024 x 1024 ピクセルなど適切な解像度で画像のシリーズと z 軸 0.3 μ m 間隔を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3次元モデルの再構成 注: オープン ソース ソフトウェアは、3次元モデルの再構成のための以下の機能の多くを実行する存在します。<ol>
<li>Z 断面画像系ファイルを 3次元モデルの再構成のための共焦点顕微鏡に関連するソフトウェアにインポートします。</li>
		<li>核染色 DAPI と血球を表現する、EGFP でc.burnetiiを表現する mCherry の共局在を示すセルを選択します。1 つのセルだけを格納する一連のイメージをトリミングします。</li>
		<li>ソフトウェアの事前包装されたアルゴリズムを使用して 3 D モデルを再構築 3 D ビューアーのオプションを選択します。ブレンド、表面、および混合のオプションの間での 3 D 表現の目的のタイプを選択します。この方法では血球, 核, とc.burnetiiはサーフェス モデルを使用して示されています。</li>
		<li>マウスのボタンを押し、画面の周りにカーソルをドラッグして様々 な視聴位置から 3 D 再構築されたセルを確認します。セル方向と、イメージを最適化するためにモデル化された光源の位置を調整します。不透明度、最小値と最大しきい値、鏡面、アンビエント、Shineness、およびガンマの他のオプションは、イメージを最適化するために存在します。</li>
		<li>血球の内部の内容を視覚化するクリッピングし、断面のコマンドを使用してモデルを断面を取る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 遺伝子/タンパク質分析用アプリケーション
<ol><li>その後 qRT PCR のための細胞を溶解 IIV6 とリステリア菌、感染または西部のしみの分析は前述21次の製造元の指示をしました。 注: qRT PCR のためのプライマーおよび西部のしみのための抗体の材料表を参照してください。</li>
	<li>Agarose のゲルの電気泳動で増幅産物の適切な長さを確保する前述の22と PCR の製品を分析します。</li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

宿主細胞が感染になる方法を理解、特に、以前テストされていない病原体および細胞型の組み合わせ4実験細胞、病原体の局在を明らかにすることが重要です。感染細胞反応カスケードを勉強して生産的な病原体の侵入を示すことができます、イメージングと細胞応答データの組み合わせ病原体の侵入、感染を示すことが欠かせません。一方、宿主細胞に病原体の侵入の 2D イメージを表示するレポートは、生産的な感染を示す傾向があります、宿主細胞の初期の病原体の侵入のタイミングに関するいくつかの質問が残ることがあります。したがって、z 断面の 2次元画像のスキャンから再建された 3 D モデルはこれらの質問に対処し、(図 4および5) の宿主細胞内病原体位置を示します。しかし、主な血液細胞の使用制限は細胞培養の長寿です。以前のレポート状態の細胞培養媒体の血球生存はわずか 8 h18、感染プロトコル、24 h、しかし長くないを試金を実行することができました。そのため、高いレベルのc.burnetii</em...

キイロショウジョウバエは免疫1の研究の確立されたモデル生物です。生得の免疫反応の間に血液細胞は病原体の挑戦への応答に重要な役割を果たします。血液細胞は、ウイルス、真菌や細菌感染2,3貪食作用を通じて病原体との闘いにおける重要な機能を持っていることと同様、寄生虫をカプセル化するために重要です。
最高病原微生物感染ホストの生得の免疫反応を理解し、病原体が伝染の間に宿主細胞に侵入する方法を視覚化することが重要です。この可視化は、侵入のメカニズムの理解に貢献しています。細胞応答し病原体の細胞内局在性の詳細と、これらのデータは感染症と微生物の相互作用、細胞細胞器官に対する宿主の反応についての手がかりを提供できます。したがって、顕微鏡によるイメージング後 3次元モデルの再構成は、宿主細胞に病原体の正確な位置を決定することができます。本研究ではコクシエラ中 (c.burnetii)、 Q 熱、プライマリショウジョウバエ血球に人間や動物の健康に深刻な脅威をもたらす人畜伝染病疾患の病原の侵略を可視化。最近、ショウジョウバエが 2 の 9 マイル相 II (NMII) クローンのc.burnetiiの 4 種、この株はショウジョウバエ4、複製することが、そのを示すバイオ セーフティ レベルに敏感であることを示したショウジョウバエ c.burnetii病因を研究するモデル生物として使用できます。
以前の研究では、ホストの生得の免疫反応を調べる血球を使用しています。血球は、形態学的観察5,6,7, 形態計測学的解析2,8、貪食分析2,3, qRT PCR2に使用されています。,9, 免疫沈降10,11、免疫蛍光分析10,12, 免疫染色13, イムノブロット3,10、 11および免疫組織化学の9,14。ショウジョウバエS2 細胞が様々 な体外実験の利用も、不死化および既存ウイルス感染の可能性は、動作15,16を変更します。S2 細胞などの不死化細胞ラインではなく一次電池の使用は、自然免疫の研究システムで全体の生物の代表的な。また、血液細胞の生体内での抽出の前に感染症は、他のホスト蛋白質および組織前のヴィヴォ感染前に血液細胞の抽出上の優位性と対話するセルをできます。血液細胞の生きている8,17,18,19を保つために時間の短い期間での血球の十分な数を取得するさまざまな方法の番号を利用されています。
本研究ではショウジョウバエ3rd病原微生物感染c.burnetii、リステリア菌(リステリア菌) や無脊椎動物の虹色の幼虫から血球を抽出する手法を提案します。ウイルス 6 (IIV6)。体内と体外の両方の血球感染症法について述べる。生体内でおよび前のヴィヴォ-感染した血液細胞の共焦点顕微鏡による可視化し、, c.burnetii侵略の 3 D モデルを構築するために使用します。また前のヴィヴォの抽出のプロトコルを使用して-感染した血液細胞は遺伝子および蛋白質の表現のために使用されたアッセイ。具体的には、IIV6 とリステリア感染症の程度を確認する総 RNA やタンパク質が分離された qRT PCR または西部のしみの分析のための細胞から。一緒に取られて、プロトコル 3rd幼虫と体内または体外に主な血液細胞が感染している証拠から急速に血球数を収集するメソッドを提供します、適切なプラットフォームの微生物病原体感染症研究および適用の下流解析顕微鏡、トランスクリプトミクス、プロテオミクスなど。

<table><tbody><tr><td>シュナイダーのショウジョウバエミディアム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1)、2.1.2)</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス&nbsp;(ハイクローン)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1)、2.1.2)</td></tr><tr><td>フィルター(0.22 & マイクロ;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>ストレーナー(100 & マイクロ;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td>Amscope SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr> キャ<tr><td>ピラリープーラー</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>スノーリバー製品</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>ナノインジェクター</td><td>ドラモンドサイエンティフィック社</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 送達装置</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4)、2.2)</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ</E>Mフルーツジュースプレート</td><td>コールドスプリングハーバープロトコル</td><td></td><td>2.1)</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full 寒天</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>メチルパラベン</td><td>アムレスコ</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>ウェルチの100%グレープジュース冷凍濃縮物、340 mL</td><td>アマゾン</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>ペトリ皿、10 x 35 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4)、2.2.2)</td></tr><tr><td>酵母、パン屋乾燥アクティブ</td><td>MPバイオメディカル0210140001</td><td></td><td>2.1)に水の2部を追加します酵母の1部(v / v)</td></tr><tr><td>タングステン針</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>保持鉗子</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインド</td>ール <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>退色防止封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>共焦点マイクロソープ</td><td>ライカ</td><td>TCS SP8-X 白色光共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3Dイメージング再構成ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>LASX 3D可視化モジュール</td><td>付き3.3)</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>無脊椎動物虹色ウイルス6(IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) は、50 & micro;g/ml ストレプトマイシン 30°C。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA 分解</td></tr><tr><td>cDNA 合成キット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708891</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td></td><td>RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR グリーン qRT-PCR 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>リアルタイム PCR システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエンティフィック 4351107, 7500 ソフトウェア v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>抗リステリア菌 抗体</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>ウエスタンブロット</td></tr><tr>抗<td>アクチン抗体</td><td>ウサギで産生 SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>抗ウサギIgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>ウェスタンブロット</td></tr></tbody></table>

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

ショウジョウバエ、病原菌の感染中に血球は感染で免疫応答に重要な役割を果たします。したがって、このプロトコルの目標は、ハエ、すなわち血液細胞の特定の免疫のコンパートメントの病原体の侵入を可視化する手法を開発することです。最大 3 × 10、ここで提示法を用いた6ライブ血球は、 ex vivo感染症のため 30 分で 200ショウジョウバエ3rd齢幼虫から入手できます。また、血球は感染した体内感染後 24 時間を追った血球抽出による 3rd幼虫の注射を通してできます。これらの感染した一次電池は修正され、ステンド グラス、共焦点顕微鏡を用いたイメージングします。その後、3 D 表現は、病原体の侵入を決定的に表示する画像から生成されました。また、qRT PCR のための質の高い RNA は mRNA 次の病原体の検出のため得ることができる感染症、および十分な蛋白質、西部のしみの分析のためのこれらの細胞から抽出されます。病原体の侵入の明確な和解と細菌やウイルスの病原体の種類と血球抽出のための効率的な方法を使用して、ショウジョウバエから十分なライブの血球を取得する感染症の確認法を提案する一緒に取られて、ex vivoとin vivoの感染実験の幼虫。

収集ex vivo感染症、血球を 3 × 10 まで生きて6血球は 200ショウジョウバエ3rd幼虫から抽出されました。本手法を開発するには、さまざまなテクニックの数を行った。個々 の幼生解離 1.5 h までと 8000 ~ セルの平均を得たこの法18、その大半はコレクションの終わりまで生きてなかった。次に、我々 は、血液を含んだ体液を抽出しよう、キューティクルと動きが鈍くなったガラス キャピラリー チューブ19, しかし、キャピラリーを使用して時間で幼虫から材料と体液ができませんでしたガラスによって効率的にとられるべき毛細血管。最後に、我々 は機械的に微細鉗子12、バッチごとの 20-50 幼虫の表皮を破壊、簡単取り込みの体液のプールを作った。これは、(表 1) の幼虫の数が多いから大量の血球の簡単なコレクションを...

このメソッドは、三次元 (3 D) モデルを昆虫細胞に病原体の侵入を視覚化する方法を示します。ショウジョウバエ幼虫から血液細胞は、細菌やウイルスの病原体、体外か体内に感染していた。感染した血球、固定され共焦点顕微鏡とそれに続く細胞三次元イメージングのステンド グラスします。

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

この手法は、血球がショウジョウバエの全体的な免疫応答にどのように寄与するかなど、細胞感染および微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、以前に感染した幼虫を使用して実験室で実行できることです。あるいは、感染していない幼虫の血球をex vivo感染に使用することもできます。共焦点顕微鏡の複雑さと3Dモデル再構成のオプションのためにイメージング手順を学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。プロトコールを開始するには、実体顕微鏡下で10cm×10cmのパラフィンフィルムを2〜3枚重ねます。次に、キャピラリー極性ヒーターを最大55%に設定してガラスキャピラリーを準備します。キャピラリーチューブを約10マイクロメートルの鋭い点にポールします。キャピラリーを鉱物油で埋め戻します。充填されたキャピラリーチューブをナノインジェクターに組み立てます。そして、融合した毛細管の先端を鉗子で折って開きます。毛細血管チューブの先端からできるだけ多くのオイルを排出し、次にチューブにショウジョウバエ血球分離培地(DHIM)を充填します。血リンパ油の境界を簡単に視覚化するには、油とDHIMの間に気泡を含めます。鉗子を使用して、食品バイアルの内壁から10匹の3番目のショウジョウバエの幼虫をそっと摘み取り、100マイクロメートルのストレーナーに入れます。幼虫に5ミリリットルの滅菌水を注ぎ、ストレーナーを5秒間振る。ストレーナをタスクワイプに置き、余分な水分を取り除きます。幼虫を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、CO2ガスで5秒間麻酔をかけます。次に、幼虫を実体顕微鏡でパラフィンフィルムに載せ、背側を上にして置きます。ガラス毛細管を幼虫の後体に軽く置き、所定の位置に保持し、先の尖った鉗子を使用して後部のキューティクルを開かします。血リンパがパラフィンフィルムに流れるのを待ちます。パラフィンフィルム上に、一度に20〜50匹の幼虫の血球を含む血リンパ液のプールを作ります。ナノインジェクターのガラスキャピラリーを使用して、プールされた血リンパを取ります。500マイクロリットルのDHIMを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに血リンパを排出します。.ぶどうジュース寒天皿にイーストペーストを置きます。乾燥を避けるために、幼虫が移動できる寒天に細かい切り込みを入れます。パラフィンフィルムを使用して、保持鉗子を備えた0.001ミリメートルの先のとがったタングステン針を組み立てます。50マイクロリットルの高力価、mCherry発現C.Burnetiiを実体顕微鏡下のパラフィンフィルムにピペットで固定し、幼虫をバクテリアのプールに入れます。タングステン針で幼虫を刺します。幼虫を寒天プレートに移します。残った病原体培地を寒天プレートに移し、パラフィンフィルムでプレートを密封します。感染後希望の時間まで、幼虫を湿った空気の中でプレートの上に置いてください。C.Burnetiiに感染した幼虫を皿に24時間放置します。12mmの丸型カバーガラスを24ウェルプレートのウェルに入れます。500マイクロリットルのDHIMを井戸にピペットで入れます。以前に感染した幼虫から血リンパを抽出して取り、次に血リンパを井戸に排出します。プレートを1000 Gで5分間遠心分離します。共焦点顕微鏡をDAPI、EGFP、およびmCherryの3色イメージング用に構成します。サンプルを顕微鏡に置き、63x1.4の開口数対物レンズを使用してサンプルに焦点を合わせます。イメージングのための視野内で目的の血球を見つけます。次に、レーザー出力と検出器のゲインを調整して、サンプルの適切な露光を実現します。複数のZ平面をチェックして、露光レベルがサンプル全体の厚さに対して適切であることを確認してください。次に、全血球のZ軸上の上部と下部の位置を見つけます。これらの位置を Z セクショニングの開始位置と終了位置として設定します。スキャニングズームを使用して、血球を含む領域を画像化します。X Y 平面で 1024 x 1024 ピクセル、Z 次元で 0.3 マイクロメートル間隔など、適切な解像度で画像シリーズを収集します。Z切片画像シリーズファイルを共焦点顕微鏡に関連付けられたソフトウェアにインポートして、3Dモデル再構成を行います。EGFP発現血球中のDAPIおよびmCherry発現C.Burnetiiで染色した核の共局在を示す細胞を選択します。画像シリーズをトリミングして、1 つのセルのみを含めます。3Dビューアオプションを選択すると、ソフトウェアの事前にパッケージ化されたアルゴリズムを使用して3Dモデルが再構築されます。3D 表現に必要なイメージング タイプを、ブレンド、サーフェス、および混合オプションから選択します。この方法では、血球、核、およびC.Burnetiiを表面モデルを使用して示します。マウスボタンを押したままカーソルを画面上でドラッグすることにより、さまざまな表示位置から3D再構築されたセルを観察します。モデル化された光源のセルの向きと位置を調整して、画像を最適化します。最後に、クリッピングおよびセクショニングコマンドを使用してモデル全体の断面を取得し、血球の内部内容を視覚化します。ヘモレクチンドライバーの制御下でEGFPを発現する生き血球を抽出した様子を複数の画像から可視化すると、DAPI陽性細胞のほとんどがEGFP陽性細胞であることが分かります。Coxiella Burnetiiに感染した血液細胞の断面は、細胞内部にmCherryを発現する細菌の存在を確認します。画像を3Dモデルに再構成したところ、in vivoで感染した血球は細胞質の伸長が大きく、本質的に平坦であることが観察されました。ex vivoに感染した血球はより球形であった。どちらのモデルの断面も、細胞内部にmCherryを発現するCoxiellaの存在を確認しています。抽出した血液細胞をIIV6に感染させ、qRT PCR解析に適用したところ、模擬細胞とIIV6感染細胞の間でIIV6-193R転写産物のレベルが有意に高いことが示されました。この手順を試みる際には、細胞が適切な栄養素を長時間欠かないように、すべての培地を事前に準備し、室温に平衡化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、シングルセルRNAシークなどの他の方法を実行して、感染に対する全体的な宿主の応答などの追加の質問に答えることができます。この手法は、開発後、免疫学や微生物学の研究者がショウジョウバエや循環器系が開いている他の動物における病原体の侵入と宿主応答を調査するのに役立ちます。

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ショウジョウバエの血リンパは、血液と間質液の両方として機能し、幼虫と成虫の段階で全身を循環します。このビデオでは、循環細胞を定量するために幼虫の血リンパを採取するプロトコルについて説明しています。...

キューティクルの混乱:ショウジョウバエの幼虫から血リンパを採取する方法

出典: Hiroyasu, A., D ら、微生物 感染と分析のための ショウジョウバエ 幼虫からの血球抽出。 J. Vis. Exp. (2018年)この動画では、 ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ幼虫における細菌感染の確立

出典: 広康A. 他。ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫から血液細胞を抽出し、微生物感染と分析を行う。 J. Vis. Exp. (2018年)このビデオは、Coxiella...

病原体感染ショ ウジョウバエ 血球の高解像度共焦点イメージング

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の造血ポケットにおける血球の再接着を評価する血球擾乱アッセイを示しています。機械的障害は常在する血球を放出し、循環血球数を上昇させます。回復後、常在する血液細胞の再付着が確認され、可逆性が示されます。...

造血ポケットへの血球再接着を評価するための血球障害アッセイ

Drosophila melanogasterは、自然免疫系と感染や病気の生理学的影響を研究するための優れたモデル生物です。このプロトコルでは、堅牢で定量的に再現性のある細菌感染をD.

全身細菌感染や免疫防御表現型<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの血液細胞、または血球は、常駐部位と循環の間を循環します。 幼虫では、常在性(固着性)血球は誘導性微小環境である造血ポケットに局在し、循環血球は血リンパ液中を自由に動きます。このプロトコルの目標は、これら 2...

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。...

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

このプロトコルでは、食細胞の認識および微生物感染症のクリアランスを定量化する大人のショウジョウバエの体内貪食アッセイについて説明します。...

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。

このプロトコルは、若年のショウジョウバエメラノガスター血球が食細胞細菌に対する能力を評価および定量するために使用される貪食のインビボアッセイを記述する。...

インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

ショウジョウバエのメラノガスター 成虫ハエは、宿主の抗菌自然免疫応答および微生物感染戦略の根底にある分子メカニズムを調べるためのモデル生物として広く利用されてきた。追加的または代替的なモデル系として D.メラノガスター 幼虫期を促進するための、幼虫注入技術が記載されている。...

キイロショウジョウバエ 幼虫注入プロトコル

学ぶ キイロショウジョウバエ幼虫の血球抽出法。病原体侵入の可視化と3Dモデル再構成により、昆虫の免疫応答メカニズムを詳細に解析できます。共焦点顕微鏡を用いた細胞感染研究の標準プロトコルです。

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

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