細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

この手法は、血球がショウジョウバエの全体的な免疫応答にどのように寄与するかなど、細胞感染および微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、以前に感染した幼虫を使用して実験室で実行できることです。あるいは、感染していない幼虫の血球をex vivo感染に使用することもできます。

共焦点顕微鏡の複雑さと3Dモデル再構成のオプションのためにイメージング手順を学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。プロトコールを開始するには、実体顕微鏡下で10cm×10cmのパラフィンフィルムを2〜3枚重ねます。次に、キャピラリー極性ヒーターを最大55%に設定してガラスキャピラリーを準備します。

キャピラリーチューブを約10マイクロメートルの鋭い点にポールします。キャピラリーを鉱物油で埋め戻します。充填されたキャピラリーチューブをナノインジェクターに組み立てます。

そして、融合した毛細管の先端を鉗子で折って開きます。毛細血管チューブの先端からできるだけ多くのオイルを排出し、次にチューブにショウジョウバエ血球分離培地(DHIM)を充填します。血リンパ油の境界を簡単に視覚化するには、油とDHIMの間に気泡を含めます。

鉗子を使用して、食品バイアルの内壁から10匹の3番目のショウジョウバエの幼虫をそっと摘み取り、100マイクロメートルのストレーナーに入れます。幼虫に5ミリリットルの滅菌水を注ぎ、ストレーナーを5秒間振る。ストレーナをタスクワイプに置き、余分な水分を取り除きます。

幼虫を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、CO2ガスで5秒間麻酔をかけます。次に、幼虫を実体顕微鏡でパラフィンフィルムに載せ、背側を上にして置きます。ガラス毛細管を幼虫の後体に軽く置き、所定の位置に保持し、先の尖った鉗子を使用して後部のキューティクルを開かします。

血リンパがパラフィンフィルムに流れるのを待ちます。パラフィンフィルム上に、一度に20〜50匹の幼虫の血球を含む血リンパ液のプールを作ります。ナノインジェクターのガラスキャピラリーを使用して、プールされた血リンパを取ります。

500マイクロリットルのDHIMを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに血リンパを排出します。.ぶどうジュース寒天皿にイーストペーストを置きます。乾燥を避けるために、幼虫が移動できる寒天に細かい切り込み

パラフィンフィルムを使用して、保持鉗子を備えた0.001ミリメートルの先のとがったタングステン針を組み立てます。50マイクロリットルの高力価、mCherry発現C.Burnetiiを実体顕微鏡下のパラフィンフィルムにピペットで固定し、幼虫をバクテリアのプールに入れます。タングステン針で幼虫を刺します。

幼虫を寒天プレートに移します。残った病原体培地を寒天プレートに移し、パラフィンフィルムでプレートを密封します。感染後希望の時間まで、幼虫を湿った空気の中でプレートの上に置いてください。

C.Burnetiiに感染した幼虫を皿に24時間放置します。12mmの丸型カバーガラスを24ウェルプレートのウェルに入れます。500マイクロリットルのDHIMを井戸にピペットで入れます。

以前に感染した幼虫から血リンパを抽出して取り、次に血リンパを井戸に排出します。プレートを1000 Gで5分間遠心分離します。共焦点顕微鏡をDAPI、EGFP、およびmCherryの3色イメージング用に構成します。

サンプルを顕微鏡に置き、63x1.4の開口数対物レンズを使用してサンプルに焦点を合わせます。イメージングのための視野内で目的の血球を見つけます。次に、レーザー出力と検出器のゲインを調整して、サンプルの適切な露光を実現します。

複数のZ平面をチェックして、露光レベルがサンプル全体の厚さに対して適切であることを確認してください。次に、全血球のZ軸上の上部と下部の位置を見つけます。これらの位置を Z セクショニングの開始位置と終了位置として設定します。

スキャニングズームを使用して、血球を含む領域を画像化します。X Y 平面で 1024 x 1024 ピクセル、Z 次元で 0.3 マイクロメートル間隔など、適切な解像度で画像シリーズを収集します。Z切片画像シリーズファイルを共焦点顕微鏡に関連付けられたソフトウェアにインポートして、3Dモデル再構成を行います。

EGFP発現血球中のDAPIおよびmCherry発現C.Burnetiiで染色した核の共局在を示す細胞を選択します。画像シリーズをトリミングして、1 つのセルのみを含めます。3Dビューアオプションを選択すると、ソフトウェアの事前にパッケージ化されたアルゴリズムを使用して3Dモデルが再構築されます。

3D 表現に必要なイメージング タイプを、ブレンド、サーフェス、および混合オプションから選択します。この方法では、血球、核、およびC.Burnetiiを表面モデルを使用して示します。マウスボタンを押したままカーソルを画面上でドラッグすることにより、さまざまな表示位置から3D再構築されたセルを観察します。

モデル化された光源のセルの向きと位置を調整して、画像を最適化します。最後に、クリッピングおよびセクショニングコマンドを使用してモデル全体の断面を取得し、血球の内部内容を視覚化します。ヘモレクチンドライバーの制御下でEGFPを発現する生き血球を抽出した様子を複数の画像から可視化すると、DAPI陽性細胞のほとんどがEGFP陽性細胞であることが分かります。

Coxiella Burnetiiに感染した血液細胞の断面は、細胞内部にmCherryを発現する細菌の存在を確認します。画像を3Dモデルに再構成したところ、in vivoで感染した血球は細胞質の伸長が大きく、本質的に平坦であることが観察されました。ex vivoに感染した血球はより球形であった。

どちらのモデルの断面も、細胞内部にmCherryを発現するCoxiellaの存在を確認しています。抽出した血液細胞をIIV6に感染させ、qRT PCR解析に適用したところ、模擬細胞とIIV6感染細胞の間でIIV6-193R転写産物のレベルが有意に高いことが示されました。この手順を試みる際には、細胞が適切な栄養素を長時間欠かないように、すべての培地を事前に準備し、室温に平衡化することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、シングルセルRNAシークなどの他の方法を実行して、感染に対する全体的な宿主の応答などの追加の質問に答えることができます。この手法は、開発後、免疫学や微生物学の研究者がショウジョウバエや循環器系が開いている他の動物における病原体の侵入と宿主応答を調査するのに役立ちます。