血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

この手順の全体的な目標は、全血サンプルからの腫瘍由来循環リボ核酸の液滴デジタルPCRによる単離と特性評価です。この方法は、腫瘍診断分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、循環中のRNAや血液サンプルから腫瘍由来の遺伝子融合トランスシプトを検出する方法などです。

この手法の主な利点は、低頻度および血液サンプルに存在するRNAバリアントの安定化、抽出、および検出に高度に最適化された方法を使用していることです。血液ベースの検査は、従来の組織生検を補完するものであり、迅速な結果を提供できる低侵襲技術を利用するという利点があります。この方法は、臨床的に重要な変異やNSCLCに関する洞察を得ることができますが、全血中の循環RNA分子をアクセス可能で迅速に同定する必要がある他のシステムにも適用できます。

逆転写反応のための循環RNAは、テキストプロトコルに記載されているように、ドナーからの血液サンプルから単離されます。濃縮された循環 RNA サンプルを、ランダムプライマーを含む市販の逆転写反応キットを使用して cDNA に変換します。逆トランスシプターゼコントロールサンプルとRNAコントロールサンプルを含めてください。

逆転写反応が完了したら、市販のDNA濃縮器スピンカラムを使用して、反応ミックスからcDNAを単離します。このステップにより、酵素、プライマー、遊離デオキシヌクレオチド三リン酸の除去が容易になります。cDNAをPCR反応ですぐに使用しない場合は、摂氏マイナス80度で保存してください。

この手順を実行するときは、廃棄ラボコートとニトリル手袋を着用し、専用の試薬調製エリアを確保してください。連続した光はプローブに付着した蛍光色素を光退色する可能性があるため、プローブを光から保護するためにプローブを覆います。まず、この表に示されているように、最終反応量が20マイクロリットルになるようにPCRミックスを調製しますが、cDNAはまだ添加していません。

次に、蓋をして光から保護された混合物を、別の増幅前領域にあるPCRクリーンフードに輸送します。ミックスをPCRプレートに分配します。試験するcDNAをPCRミックスに加えます。

取り外し可能なプレートシーラーでプレートを覆います。プレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にサンプルを採取します。プレートシェーカーで、低い設定で10秒間混合します。

プレートを再度短時間遠心分離して、ウェルの底にサンプルを収集します。手動で液滴を生成する前に、プレートシーラーを取り外してください。サンプルをロードするとき、ピペットチップ内の気泡を最小限に抑え、後で液滴をカートリッジからプレートにゆっくりと移すことが重要です。

20マイクロリットルのPCRミックスを液滴発生カートリッジのサンプルウェルに慎重に移します。70マイクロリットルのドロップジェネレーションオイルを追加します。ゴム製のガスケットで覆い、カートリッジを手動の液滴発生器に移して液滴生成を開始します。

液滴の生成後、メーカーが推奨するヒントを使用して、液滴を新しいPCRプレートに移します。液滴を吸引して、先端の端を液滴カートリッジまたはプレートに触れないように、それぞれ5〜6秒かけてゆっくりと分注します。プレートをホイルプレートシーラーで密封します。

サーマルサイクラーで以下の設定を使用してPCRを行います。サーマルサイクラーの実行が完了したら、液滴リーダーを使用してプレートを読み取ります。コントロールとサンプルの位置を特定するリーダーソフトウェア用のプレートレイアウトを作成し、ソフトウェアにロードして読み取りを開始します。

プレートの読み取り結果は、市販のソフトウェアを使用して分析されます。まず、解析メニューに移動して、2次元または2Dの振幅プロットを表示します。液滴データを調べて、データの全体的な品質を評価します。

イベントメニューを使用して、受け入れられたイベントの合計数のデータを評価します。井戸ごとに 10 、 000 以上のイベントがあるはずです。そうでない場合は、追加の問題がないかデータを慎重に評価する必要があります。

次に、忌まわしい蛍光振幅のデータを確認します。反復サンプル間の振幅差と濃度差が大きい場合は、サンプルの取り扱いや混合が不十分であることを示しています。45度の軸上にスプレーパターンがある液滴クラスターに注意してください。これは、液滴の品質が悪いか、サンプルに問題があることを示しています。

最初に、ポジティブコントロール、逆転写酵素コントロールなし、および RNA コントロールなしのデータを調べます。すべてのコントロールサンプルを選択し、2Dプロットでクラスターの品質を調べて適切なしきい値を設定すると、液滴クラスター間の明確な分離が明らかになります。各アッセイバリアントについて、コントロールウェルに基づいて閾値を設定します。

十字線ツールを使用して 2D プロットにしきい値を設定し、x 軸で制御遺伝子集団から二重負の液滴集団を分離し、y 軸でバリアント遺伝子集団 (存在する場合) を分離します。1つのサンプルの各レプリカントウェルからいくつかのコピー。最後に、テスト結果を検出されたバリアント コピーの数として表します。

SDC4-ROS1融合およびCCDC6-RET融合を発現する細胞株を使用し、全ヒト野生型RNAのバックグラウンドで希釈し、各融合変異体で0.2%の変異頻度で検出限界を確立しました。標的細胞株由来のRNAを5%オフにした調製物は検出されず、アッセイの特異性が実証されました。分析的マルチプレックス RNA 標準試料を、高濃度、中濃度、低濃度で、同じ日に 3 回にわたって測定しました。

3日間連続で3回、2人の独立したオペレーターが運行します。この結果は、目的の融合転写産物と内部制御遺伝子GUSBの両方を正確に検出することを示しています。臨床サンプルの各バッハも、ポジティブコントロール、逆転写酵素なしコントロール、およびRNAテンプレートなしコントロールで実行されました。

Fusionバリアントはy軸に沿って表され、GUSBはx軸上に表示されます。バッチコントロールを21日間にわたって評価したところ、すべてのランでROS1およびRETについて、融合陽性のドロップレットとGUSBコントロール遺伝子のドロップレットが観察されました。逆転写酵素なしコントロール内の汚染、RNAなしコントロール内の汚染、液滴の共有と合体、および最適化が不十分なPCR条件またはPCR阻害がある場合、代表的な最適でない結果が示されています。

一度マスターすれば、このプロトコル全体を約12時間で完了させることができます。この手順を試行する際には、RNAおよびヒトの血液検体の取り扱いに関するベストプラクティスを使用することが重要です。RNAの単離に続いて、新規融合変異体の同定などの追加の質問に答えるために、次世代シーケンシングなどの他の方法を実行することができます。

このビデオを見れば、全血や血漿から循環中のRNAを分離し、回収したRNAを処理して、RETやROS1などの循環中のまれな変異体を特定する方法について十分に理解できるはずです。開発後、この技術は全血から臨床的に実行可能な突然変異を検出する道を開きました。そして、これらの方法を拡張して、循環している過剰発現転写産物を調べるようにしました。