Name: 酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ 酵母におけるヒストン修飾のクロマチン免疫沈降法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、ゲノム全体でのヒストン修飾の存在量と局在を定量化し、遺伝子発現制御のメカニズムを解明する。

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著者は、役に立つ議論のため緑のラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH の補助金 R03AG052018 と E.M.G. に R01GM124342 によって部分で支えられました

1. 事前バインド磁性ビーズに抗体
<ol>
	<li>タンパク質 A/G 磁気ビーズを混ぜるし、磁気ビーズ 1 つ免疫沈降 (IP) サンプルごとの 20 μ L を 1.5 mL チューブに転送します。 注: ときにビーズをピペッティング ワイド口径、低維持のヒントを使用します。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズとチューブを置き、側管の収集にビーズを許可します。上澄みを除去します。</li>
	<li>冷たいトリス緩衝生理食塩水 (TBS) (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM の NaCl) 1 mL にビードを 3 回洗浄しなさい。</li>
	<li>ビーズと抗体の適切な量に TBS の 200 μ L を追加します。4 ° C で一晩 8 rpm で回転します。 注: 多くのヒストン翻訳後修飾抗体抗体 IP あたり 1-3 μ g で十分です。ただし、滴定の実験は適切な濃度を判断する推奨されます。よ特徴付けられた、商業ヒストン翻訳後修飾抗体の推奨濃度は多いが正確とパブリッシュされたレポートや製品資料で見つけることができます。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズを配置し、上清を除去します。TBS の 1 mL で洗浄し</li>
	<li>IP サンプルあたり TBS の 20 μ L 加え、TBS の (ピペッティングのエラー) の場合追加 5 μ のビードを再停止しなさい 注: ビーズ格納できます 4 ° C で短期的な使用まで。</li>
</ol>
2 酵母を育てる
<ol>
	<li>適切なひずみの単一コロニー YPD (10% 酵母エキス、ペプトン 20%、20% ブドウ糖) 10 mL を接種して 220 rpm で揺れのインキュベーターで一晩 30 ° C で成長します。</li>
	<li>600 の光学濃度を測定分光光度計を用いた酵母培養の nm (外径600)。外径600文化を希釈 100 mL 新しいフラスコ YPD に 0.2 を =。</li>
	<li>中間ログ フェーズに達するまで 220 rpm で揺れのインキュベーターで 30 ° C で細胞を成長 (外径600 = 0.6 0.8)。</li>
</ol>
3生体内でタンパク質が DNA に架橋。
<ol>
	<li>文化が中間ログ段階に達したら、1% のホルムアルデヒドの最終的な集中のための媒体に直接 37% ホルムアルデヒドの 2.7 mL を追加します。25 の ° C (または温度) シェーカーにフラスコを転送し、15 分間 50 rpm で振る。</li>
	<li>メディアに 2.5 M のグリシンの 5 mL を追加し、ホルムアルデヒドを癒やすための 5 分間室温で 50 回転で振動を続けます。</li>
	<li>ボトルを遠心し、スピン 4 ° C で 5 分間 5800 x g でセルにセルを転送します。上清をデカントします。
	<ol>
		<li>冷たい TBS の 45 mL に再それらによってセルを洗浄し、懸濁液を 50 mL の円錐管に移します。4 ° C で 3 分間 2800 x g でチューブをスピンします。上澄みを除去します。</li>
		<li>風邪の 10 mL のセル換散バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、塩化ナトリウム 1% ノニデット オクチル phenoxypolyethoxylethanol (NP-40)、4 ° C で保存) のチップを洗ってください。</li>
		<li>4 ° C で 3 分間 2800 x g でセルをスピンします。上澄みを除去します。 注: セルが液体窒素で凍結、さらに処理まで-80 ° C で保存します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 酵母溶解液を作る
<ol>
	<li>1 mM 特異フッ化物 (PMSF) コールド チップ換散バッファーの 1 mL と酵母プロテアーゼ阻害剤カクテルの縮尺希釈で細胞を再懸濁します。懸濁液をガラス製のビーズの 200 μ L を含む 2.0 mL スクリュー キャップ チューブに転送します。</li>
	<li>4 ° C で高速撹拌装置を破ってビードにセルを転送し、ビーズが 30 の 6 回をビート s 各。氷を破って各ビード間少なくとも 1 分の上細胞を保ちます。</li>
	<li>ライセートのヒントなゲルを使用して 1.5 mL チューブに転送します。ライセートの 4 ° C で 20 分 15,500 × g で遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、250 μ L の MNase 消化バッファーでペレットを再懸濁します (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、10 mM の NaCl、3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 %np-40、4 ° C で保存) によって上下に軽くピペッティングします。</li>
	<li>MNase の 2.5 μ L を反応に追加します。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴で孵化させなさい。 注: MNase の新しい在庫を使用する場合、ダイジェスト条件を最適化する必要があります。プロトコルについて、手順 10 を参照してください。</li>
	<li>すぐに反応を停止し、0.5 M の EDTA を最終濃度 10 mM EDTA を 5 μ l 添加氷にチューブを置きます。逆解析による優しく混ぜます。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 15,500 x g で反応を遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。 注: 水溶性 (消化) クロマチンは上清になります。ペレットには、何か未消化と不溶性の細胞の残骸が含まれています。</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) ヒストンの修正
<ol>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用して各 MNase にリリースされたクロマチン フラクションのタンパク質濃度を決定します。各 8 ディスポーサブルキュベットに加えて、テストする各蛋白質のサンプルの 1 追加キュベットにブラッドフォード試薬 1 mL を追加します。
	<ol>
		<li>2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) の原液を準備します。</li>
		<li>ブラッドフォード試薬 1 mL に BSA の下記の濃度を達成するために適切なボリュームを追加: 0 μ g/mL、0.5 μ g/mL、1 μ g/mL、2 μ g/mL、4 μ g/mL、6 μ g/mL、8 μ g/mL、10 μ g/mL。追加のキュベットに MNase にリリースされたクロマチンの端数の 2 μ L を追加します。</li>
		<li>パラフィルムの小片をそれぞれキュベットの上部をカバーし、4-6 回キュヴェットを反転ソリューションをよく混合します。キュベット 15 分間室温で孵化させなさい。</li>
		<li>595 で吸光度を測定可視光分光光度計を使用して標準曲線と実験サンプルの nm。 注: 使用する BSA のないキュベット (0 μ g/mL) 空白の最初の測定を取る前に分光光度計。</li>
		<li>分光光度計に関連するソフトウェアや表計算ソフトに BSA の異なる濃度の吸光度値を使用して標準の曲線をプロットします。標準曲線と使用希釈倍率 (レバレッジ) に基づき、各クロマチン一部サンプルの蛋白質の集中を計算するのに吸光度の値を使用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>各 IP MNase にリリースされたクロマチン画分から 1 mL の最終的なボリュームに到達するチップ換散バッファーに総蛋白の 50 μ g を追加します。 注: ライセートあたり 1 つ以上の IP を設定する場合、ライセートのマスター ミックスを作る、チップの換散バッファーと IP の個々 のチューブに分注 1 mL。</li>
	<li>入力のサンプルとして処理する IP ミックスから 100 μ L を削除します。-20 ° C で入力サンプルを凍結手順 7.1 まで。 注: 任意の残りのクロマチンのサンプルも-20 ° C で凍結して使用できる後の IP のため必要な場合。</li>
	<li>あらかじめ各 IP サンプルに抗体と結合タンパク質 A/G の磁性体ビーズ 20 μ L を追加します。</li></ol>3 h (標準) の 8 回転でサンプルを回転または、4 ° C で (優先) する場合は一晩

6. IPs を洗浄し、ヒストン-DNA 複合体の溶出
<ol>
	<li>マグネット スタンドに管を配置し、ビーズ、チューブ側を収集します。ピペットを使用して上清を除去します。1 mL 以下のバッファーの連続してビード洗浄しなさい。
	<ol>
		<li>4 ° C で 5 分間 8 回転で回転、マグネット スタンドにビーズを置いて、培養上清を除去し、次のバッファーを追加する各洗浄を実行: 2 x - チップの換散バッファー、2 x - 高塩洗浄バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、500 mM の NaCl、1 mM EDTA、4 ° C で保存されている 1 %np-40)、1 x - LiCl/洗剤洗浄バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、250 mM LiCl、1 mM EDTA、1 の np-40、デオキシ コール酸ナトリウム 1%、4 ° C で保存)、1 x - TE (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、4 ° C で保存)、および 1 x - テ。</li>
		<li>最後のテ洗うと TE の 0.5 mL を使用してチューブを洗浄し、残りのビーズを転送テ、別 0.5 mL、ビーズのほとんどを転送する新しいチューブにビーズを転送します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>たてチップ溶出バッファー (1 %sds、1 mM NaHCO3) の 250 μ L を追加します。渦ソリューションを簡単に。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。</li>
	<li>マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズを収集します。慎重に上清を新しいチューブに転送し、ビーズを避けてください。 注: 溶出液には、免疫沈降されたタンパク質と関連する DNA が含まれています。</li>
	<li>ビーズにチップ溶出バッファーの別の 250 μ L を追加します。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。</li>
	<li>慎重に最初の溶出を含むチューブに上清を転送します。必要に応じて、ビーズを妨害を避けるためにすべての ip アドレスの小さいボリューム (240 μ L) を削除します。</li>
</ol>
7. 逆蛋白質・ DNA クロスリンク
<ol>
	<li>入力サンプルを解凍し、チップ溶出バッファーの 400 μ L を各入力に追加します。</li>
	<li>両方の入力と IP サンプル、反転またはチューブをフリックしても 20 mg/mL, プロテイナーゼ K ミックスの 12.5 μ L、5 μ L 20 mg/mL グリコーゲンの NaCl 5 M の 20 μ L を追加します。65 ° C の水浴のサンプルを一晩インキュベートします。</li>
</ol>
8. 浄化し、DNA を集中
<ol>
	<li>入力と IP サンプル 10 Mg/ml の RNase A の 10 μ L を追加します。30 分の 37 ° C の水浴中サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>水溶液中にフェノール: chlorofrom:isoamyl アルコール (25:24:1 PCI) の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でそれらを回しなさい。
	<ol>
		<li>新しい管へ水の層を削除します。PCI の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でチューブをスピンします。水層を新しいチューブに転送します。 注意: ヒューム フードにし PCI を使用するときに適切な保護具を着用します。制度のガイドラインの指示に従って、液体および固体廃棄物を処分します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M 酢酸ナトリウムと、DNA を沈殿させる冷たい 100% エタノール 1 mL 0.1 x ボリュームを追加します。4-6 回チューブを反転ソリューションをよく混合します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
	<ol>
		<li>4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>(乾燥) するまで約 20 分のためのフードのペレットを風乾します。ヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L で IP サンプルを再懸濁します、ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L の入力サンプルを再懸濁します。QPCR を実行するまで-20 ° C で DNA サンプルを格納します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 量的な PCR (qPCR) 濃縮ゲノム領域を検出するには
<ol>
	<li>プライマーの各セットの qPCR マスター ミックスを行います。2 x qPCR ミックスの 5 μ L、20 μ M 前方プライマー 0.25 μ、20 μ M 逆プライマーの 0.25 μ L 反応 1 つにはが含まれます。 注: 適切なプライマー設計と qPCR の実験用のテスト解説他14,,1516。</li>
	<li>各 DNA のサンプルの DNA マスター ミックスを作る。1 つの反作用には 0.5 μ L DNA にはヌクレアーゼ フリー水の 4.0 μ L が含まれています。</li>
	<li>QPCR 384 ウェル プレートの各ウェルに適切なプライマーのマスター ミックスの 5.5 μ L と適切な DNA のマスター ミックスの 4.5 μ L を追加します。 注意: 各ウェルにプライマー ミックスの 5.5 μ L を追加することから始まります。4.5 μ L の DNA ミックスを追加する前に、室温で 1 分 200 x g でプレートをスピンします。</li>
	<li>プレートと室温で 1 分 200 x g でスピンするシールを遵守します。</li>
	<li>QPCR リアルタイム qPCR システムを使用して次の条件を実行: 95 ° C、3 分。40 サイクル 95 ° C の 10 s、55 ° C、30 秒;融解曲線 65 ° C ~ 95 ° C 0.5 の ° C ずつ、5 s。</li>
	<li>各プライマー、qPCR で使用されている 5% の入力サンプルを基準にして IP サンプルのパーセントの入力を計算します。技術的な PCR トリプリケートの手段を使用して、計算を実行します。 注: かどうか実質的な変動が観察される PCR トリプリケートのマスター ミックス組成、ピペッティング エラーおよび 384 ウェル プレートで井戸間の交差汚染に注意を払って qPCR を繰り返すことをお勧めします。<ol>
		<li>生の Cq 値から希釈倍率を表すサイクル数を減算することによって 100% への入力の Cq 値を調整します。 注: 5% 入力は 20 倍、= 4.32 サイクル (2 20 = 4.32 を記録) の希釈倍率を表します。</li>
		<li>2 入力のパーセントを計算 ^ (Cq入力- CqIP) を乗じた。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. MNase ダイジェスト条件 (推奨する前に最初完全な半導体素子実験) を決定します。
<ol>
	<li>4.4 前のプロトコルを介して 2.1 の手順に従います。十分なクロマチンを含むペレットの MNase 消化の複数のサンプルのライセートを生成するプロトコルをスケール アップします。4.4 ステップで MNase 消化バッファーの 1.25 mL にペレットを再懸濁します。5 サンプル管のように各因数には MNase 消化バッファーで再停止されるクロマチン ペレットの 250 μ L が含まれます。</li>
	<li>追加 0、1.5、2.5、5 μ L MNase の各管に。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>すぐに氷の上管を配置し、0.5 M の EDTA を最終濃度が 10 mM の場合の 5 μ L を追加することによって反応を停止します。</li></ol>逆解析によるソリューションを優しく混ぜます。
	<li>4 ° C で 15 分間 15,500 x g でチューブを遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送。</li>
	<li>SDS を最終濃度 1% (10% 原液の 25 μ L) と NaHCO3 0.1 M 最終濃度 (1 M 原液の 25 μ L) 1.5 mL チューブのサンプルに追加します。</li>
	<li>20 mg/mL プロティナーゼ K の 12.5 μ L、5 μ L のグリコーゲン、NaCl 5 M の 20 μ L を 1.5 mL チューブにサンプルに追加します。65 ° C でそれらを一晩インキュベートします。</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA の 10 μ L を追加します。37 ° c 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>水溶液中に PCI の 300 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g で回転します。
	<ol>
		<li>新しい管へ水の層を削除します。PCI の 300 μ L を加え、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g で回転します。水層を新しいチューブに転送します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M 酢酸ナトリウム (通常 〜 30 μ L) と、DNA を沈殿させる冷たい 100% エタノール 1 mL 0.1 x ボリュームを追加します。4-6 回チューブを反転によく混ぜます。-80 ° C 1 時間または-20 ° C でチューブを一晩インキュベートします。
	<ol>
		<li>4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。</li>
		<li>ペレット フード約 20 分 (または完全に乾燥するまで) を空気乾燥させてください。ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ローディングの染料の DNA を追加し、2% アガロースゲルの 20 μ L を実行を可視化するゲルは DNA を消化します。</li>

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ここで説明したプロシージャ免疫沈降による酵母細胞の変更されたヒストンに関連付けられている DNA の効率的な復旧できます。これはローカル濃縮を決定する対象領域または特定のヒストンの修正の枯渇を増幅するプライマーを使用して qPCR が続きます。ほぼ 20 年前メソッドとして開発されているにもかかわらずチップのまま異なるゲノム領域で、多様な条件下でのヒストン変更状態を調査するため定義アッセイ。チップは、次世代シーケンス テクノロジーはゲノム規模6、7のヒストンの修正を問い合わせることに結合がコストとこれらのアプローチの必要なデータの解析は、いくつかの実験室の設定での使用を制限があります。さらに、これらのエピゲノムの実験はしばしばいくつかのゲノムの遺伝子ヒストン変更状態の観察を検証する qPCR に結合チップが続いています。物理的にヒストン マーク (または他の蛋白質) をゲノムの特定の場所にリンクし、異なる環境や生物学的条件の下でこの相互作用のダイナミクスを分析チップのユーティリティを提供するいくつかの対等な方法があります...

ヒストンの動的の翻訳後修飾 (PTM) は、転写、複製、DNA 修復1,2を含む多くの dna のプロセスに対して重要な規制メカニズムです。豊かさと変更されたヒストン併用、これらのプロセスの正確な局在を決定する機能がセルに異なる条件の下で、規制を理解したがって欠かせません。主茎では、DNA 蛋白質の相互作用の生化学的研究から特に体外法化学塗料の硬化剤、方法としてクロマチン免疫沈降 (チップ) の開発を評価する必要性と相まって、蛋白質 DNA 相互作用の体内とゲノム3,4、5の特定の領域での動的な性質。(QPCR) の量的な PCR とシーケンス テクノロジーの進歩もチップ実験で DNA 蛋白質の相互作用を解剖するための強力なツールとなって全体のゲノムの定量的な比較を実行する能力を拡大しています。複数のレベル。
現在、チップはゲノムのクロマチン パミンに興味を持って、研究グループの必要なメソッドとして変更されたヒストンおよび特定の genomic 位置の間で物理リンクに直接問い合わせることに匹敵するメソッドがないです。vivo。さまざまな科学的な質問の規模、コスト、これらのアプローチがアドレスがありますゲノム6,7中のヒストンの修正をマップする次世代シーケンシングを使用してこのメソッドのバリエーションはありますが、テクニカル リソースは、いくつかの研究グループの制限があります。さらに、対象となるチップ qPCR はこれらを補完するために必要な方法で両方を提供することによってアプローチを最適化チップ プロトコル シーケンスの前に、エピゲノムのデータセットの結果を検証します。質量分析法に基づくアプローチ8,9,10,11, をただし、浮上してもゲノム領域に関連付けられているマークがあるヒストンの完全な補完を識別するこれらアプローチに関するゲノムの領域を検出できる、技術的な専門知識と研究のすべてのグループに使用できなくなります計装を必要といくつかの制限があります。したがって、チップは豊かさとエピジェネティクス、クロマチンとゲノム機能の制御に興味があるすべての研究グループの多様な条件下でのヒストンの修正の分布を分析するための基本メソッドです。
ここでは、出芽酵母を用いたチップ モデル酵母 (出芽酵母)クロマチンでヒストン Ptm の分布を調査する手法について述べる。このアプローチは、酵母を開発し、多様なモデル システム12,13にも適用チップ プロトコルのコア コンポーネントの数に依存します。変更されたヒストンと DNA、細胞間の相互作用は、ホルムアルデヒドで架橋によって保持されます。次の試薬、クロマチン フラグメントによって可溶性に均一サイズの断片にミクロコッカスヌクレアーゼで消化。商業やラボで生成された抗体、変更されたヒストンの免疫沈降を実行され、任意の関連付けられた DNA を分離して、qPCR (図 1) を使用して特定のゲノム領域で濃縮を分析します。多くのヒストンの修正、この議定書から得られた DNA の量は qPCR で 25 以上の異なるゲノム遺伝子をテストするため十分です。
このチップ メソッドは、汎用性の高い複数の変異株や環境条件は、1 つのヒストン修飾の分布を監視または野生型細胞ゲノムの遺伝子の数で複数のヒストンの修正をテストするためです。さらに、プロトコルの多数のコンポーネントは、いずれか高いまたは卑しい-豊富なヒストンの検知を最適化するために容易に調節可能。最後に、出芽酵母で変更されたヒストンのチップを実行する他のシステムで主に使用される抗体の特異性の主要なコントロールを使用する機会を提供します。すなわち、酵母に変更、対象とヒストンの残基の点突然変異を運ぶ生成され、いくつかのケースでは、のみ特定のヒストン残渣の変更を促進する単一酵素 (e.gヒストンのリジン。メチル化酵素)。したがって、チップは、いずれか、ヒストン変異体や酵素削除系統程度抗体の非特異的結合が発生して偽陽性の結果を生成する可能性がありますを試金する実行できます。このコントロールは、新しく開発された抗体、特に貴重なも他のシステムで、使用前に保存されたヒストン修飾の抗体の特異性を検証に使用することがあります。このアプローチは、(モノ-、ジ -、tri-メチル化) などの別の修正状態の間で区別する抗体の特異性をテストするのには他の方法を補完する変更されたペプチドの配列をプローブとヒストンの西部のしみの実行を含むまたは定義された変更とヌクレオソーム。全体的にみて、出芽酵母におけるチップはヒストン Ptm ゲノム全体のダイナミクスを評価して、その調節を支配するメカニズムを解剖する有力な手法であります。

<table><tbody><tr><td>酵母抽出</td><td>物研究製品国際(RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>研究製品国際(RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr>デ<tr><td>キストロース</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒドSigma-Aldrich</td><td></td><td>F8775</td><td></td></tr>グリ<tr><td></td><td>シンフィッシャー科学AC12007-0050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-ノニルフェニル-ポリエチレングリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich に相当</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>酵母プロテアーゼ阻害剤</td>カクテル <td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 フェノール:24 クロロホルム:1 イソアミルアルコール</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>ミクロコッカスヌクレアーゼ</td><td>ワージントン生化学</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>リサーチプロダクツインターナショナル(RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R6513-50MG&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp;Bradford Assay 試薬</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;BSA標準液 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;H4</td><td>EMDミリポア</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;H4K16ac</td><td>EMD ミリポア</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;H3</td><td>アブカム</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;H3K4ME2</td><td>アクティブモチーフ</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;High Rox qPCR Mix</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Magnetic Beads</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>1.5mLチューブ用マグネットスタンド</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Wash Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;マイクロチューブ ホモジナイザー</td><td>ベンチマーク</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL スクリューキャップチューブ シールリング付き</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>キュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルPCRプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ジャイラトリーフロアシェーカー</td><td>ニューブランズウィック科学</td><td>モデルG10</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;リアルタイムPCR解析システム</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

アセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾ヒストン修飾 (Ptm) は、一連のセルによって受信した信号への応答でこれらのマークの削除を追加または酵素によって動的に調整されます。これらの PTM が遺伝子発現制御などのプロセスの規則への主貢献者および DNA 修復します。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、豊かさとセルに多様な摂動に対してゲノム全体にわたって多くのヒストン Ptm のローカリゼーションを解剖するため手段アプローチをされています。ここでは、出芽酵母酵母 (出芽酵母)からファーストクリーニング変更されたヒストンのチップを実行するための汎用性の高いメソッドを説明します。このメソッドはホルムアルデヒド治療イースト文化の DNA やタンパク質の架橋結合に依存しているミクロコッカスヌクレアーゼ、によってクロマチン フラグメントの可溶化とヒストン DNA の免疫沈降を破って、ビーズで酵母溶解液の生成複合体。興味のヒストン マークに関連付けられている DNA は、精製は、ゲノム全体の複数の座位で濃縮を評価する定量的 PCR 分析を受けます。野生型と変異酵母ヒストン マーク H3K4me2 と H4K16ac の局在化を探る代表的な実験、データ分析と解釈を示す説明します。このメソッドは、さまざまなヒストン Ptm に適していて、異なる突然変異系統またはそれに異なる条件下でのクロマチン動態の変化を調査するための優れたツールを作り、多様な環境ストレスの存在下で実行できます。

このプロトコルの 1 つの主要コンポーネントは、ステップ 10 で説明したよう、可溶性フラグメントにクロマチンを消化するために使用ミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) の濃度が最適化されます。これは興味のゲノム領域でのヒストンの修正の分布に関する高解像度データを取得するため重要です。MNase 滴定は、主にモノラル-ヌクレオソーム クロマチンの可溶性画分にディ ヌクレオソームの少量を達成するために最も適した濃度を決定する実行必要があります。これを視覚化することができます DNA を抽出することによりクロマチン含有ペレットの MNase 消化とアガロースを実行するゲルの電気泳動 (図 2)。ここで使用される MNase の準備のために 2.5 μ L 20 単位/μ L で酵素の生産主にモノラル-ヌクレオソームとチップのこの金額だったため。
このチップ プロシージャ (<strong cl...

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR 豊かさとゲノム全体ヒストン翻訳後修飾のローカリゼーションを調査する使用されます。

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

このクロマチン免疫沈降プロトコルの全体的な目標は、出芽酵母ゲノム全体の定義された領域におけるヒストン修飾の存在量と局在を決定することです。この方法は、ヒストン修飾が遺伝子発現制御にどのように関連しているか、これらの修飾がさまざまな環境条件に応じてどのように変化するかなど、クロマチン制御における重要な疑問に答えるのに役立ちます。非常に汎用性の高いプロトコールで、一度に多くの異なるヒストン修飾や複数のE株を調べることができます。この方法はヒストン修飾に関する洞察を提供しますが、エピトープタグや利用可能な抗体を使用して他のクロマチン結合タンパク質の研究にも適用できます。この手順は、酵母細胞を増殖させ、10ミリリットルのYPD培地に各適切な菌株の単一のコロニーを接種し、それを220rpmの振とうインキュベーターで一晩摂氏30度で増殖させることから始めます。培養物の600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定した翌日、新しいフラスコで培養物を100mLのYPDで0.2のOD600に希釈します。細胞を摂氏30度で、220rpmの振とうインキュベーターで細胞を成長させ、中対数期に達するまで成長させます。培養物が中対数期に達したら、2.7ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを各フラスコの培地に直接加えて、最終濃度1%ホルムアルデヒドにします。フラスコを室温のシェーカーに移し、50rpmで15分間振とうします。5ミリリットルの2.5モルグリシンを培地に加え、室温で50rpmで5分間振とうし続け、ホルムアルデヒドを急冷します。続いて、細胞をスピンダウンし、テキストプロトコルに記載されているように洗浄します。最後のスピン後に上清を取り除き、酵母溶解物の作成に進みます。1ミリリットルの冷クロマチンアミノ沈殿液またはChIP溶解バッファーに、1ミリモルのPMSFと1:1000希釈の酵母プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えて細胞を再懸濁します。懸濁液を200マイクロリットルのガラスビーズが入った2.0ミリリットルのスクリューキャップチューブに移します。細胞をビーズ叩き装置に移し、摂氏4度で高速に攪拌します。ビーズビートを30秒間、氷を1分間打ちます。ビーズビートを合計6回行い、30秒のビートビートごとに少なくとも1分間細胞を氷上に保持します。ゲルローディングチップを使用して、ライセートを1.5ミリリットルのチューブに移します。ライセートを15,500gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを250マイクロリットルのマイクロコッカスヌクレアーゼ消化緩衝液に再懸濁します。各反応に2.5マイクロリットルのミクロコッカスヌクレアーゼを添加します。4〜6回反転させて穏やかに混合し、すぐに摂氏37度の水浴で20分間インキュベートします。20分後、チューブを氷上に置いて反応を停止し、5ミリリットルの0.5モルEDTAを加えて最終濃度10ミリモルEDTAにし、反転して穏やかに混合します。15, 500 gで摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、各上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。最も一貫した結果を得るには、各アミノ沈殿に同じ濃度のタンパク質が使用されていることを確認することが重要です。アミノ沈殿またはIP反応の数に応じて、各マイクロコッカスヌクレアーゼ放出クロマチン画分とChIP溶解バッファーのマスターミックスを作成し、総タンパク質50μgを含む1ミリリットルを個々のチューブに割り当てます。各IPミックスから100マイクロリットルを取り出して、インプットサンプルとして処理します。入力サンプルを摂氏20度で凍結して、後で使用できます。また、各免疫沈降に抗体に結合したビーズを同量使用することを確認することも重要です。ワイドボードピペットチップを使用して、各IPサンプルに抗体をあらかじめ結合させた20マイクロリットルの磁性タンパク質AGビーズを追加します。サンプルを8rpm、摂氏4度で3時間回転させます。IPが完了したら、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズをチューブの側面に集めます。ピペットを使用して上清を取り除きます。1ミリリットルのChIP溶解バッファーをビーズに加え、摂氏4度で8rpmで5分間回転させます。次に、チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除きます。このようにして、ビーズを以下のバッファーで示された回数だけ連続して洗浄します。ChIP Lysis Buffer、High Salt Wash Buffer、LiCl/detergent Wash Buffer、および TE.最後のTE洗浄では、0.5ミリリットルのTEを使用してほとんどのビーズを新しいチューブに移し、次にさらに0.5ミリリットルのTEを使用してチューブを洗浄し、残りのビーズを移します。250マイクロリットルの新しく作成したChIP溶出バッファーを各チューブに加え、溶液を短時間ボルテックスします。サンプルを室温で8rpmで15分間回転させます。チューブを磁気スタンドに置きます。上清を新しいチューブに慎重に移し、ビーズを避けます。さらに250マイクロリットルのChIP溶出バッファーをビーズに加えます。サンプルを室温で8rpmで15分間回転させます。ビーズを乱さないように慎重に、上清を最初の溶出物を含むチューブに移します。以前に収集したインプットサンプルを解凍し、各インプットサンプルに400マイクロリットルのChIP溶出バッファーを添加します。タンパク質DNA架橋を逆転させるには、インプットサンプルとIPサンプルの両方に、20マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム、5マイクロリットルのグリコーゲン、12.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを添加します。サンプルを摂氏65度の水浴で一晩インキュベートします。この手順を開始するには、適切な量のQPCRミックス、フォワードプライマー、およびリバースプライマーを組み合わせて、プライマーの各セットに対してQPCRマスターミックスを作成します。1つの反応が0.5マイクロリットルのDNAと4.0マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を含む各DNAサンプルのDNAマスターミックスを作成します 384ウェルQPCRプレートの各ウェルに5.5マイクロリットルの適切なプライマーマスターミックスを追加します。プレートを200gで室温で1分間回転させます。次に、4.5マイクロリットルの適切なDNAマスターミックスを各ウェルに加えます。プレートを密封し、室温で200gで1分間遠心します。95°Cで3分間、95°Cで10秒間、55°Cで30秒間の40サイクル、65°Cから95°Cまでの融解曲線を0.5°C刻みで5秒間、リアルタイムQPCRシステムを用いてQPCRを行います。このプロトコールの重要な要素の1つは、クロマチンを可溶性フラグメントに消化するために使用されるミクロコッカスヌクレアーゼの濃度を最適化することです。この例は、クロマチンペレットをさまざまな量のミクロコッカスヌクレアーゼで消化した後に単離されたDNAのアガロースゲル電気泳動の結果であり、1マイクロリットルあたり20ユニットの2.5マイクロリットルの酵素が主にモノヌクレオソームを産生したことを示しています。この代表的なChIP実験では、野生型およびset1ノックアウト細胞において、ヒストンメチルマーカーH3K4me2およびヒストンH3に対する抗体を使用しました。Set1ノックアウト細胞は、マークを触媒するメチルトランスフェラーゼを欠いていますバーは、示された低sciでのH3K4me2の相対濃縮を示しています。野生型株は、set1の直接の標的であることが知られている2つの遺伝子、PMA1およびERG11の5つのプライムエンドでH3K4me2の明確な濃縮を示しましたが、set1ノックアウト細胞ではシグナルは観察されませんでした。予想通り、TEL07LではH3K4me2マークの濃縮はなく、SPR3の発現もset1によって制御されていることが報告されていますが、これらの結果は、PMA1やERG11とは異なるメカニズムで制御が行われる可能性が高いことを示しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4日以内に行うことができます。この手順を試みる際には、適切なコントロールで特異性を得るために使用した抗体を慎重に試験することを忘れないようにすることが重要です。可能な場合は、陽性制御領域と陰性制御領域の両方をQPCRでプローブする必要があります。この手順に続いて、ヒストン修飾の分布によってゲノムを決定するために、GPシーケンシングなどの他の方法も実行できます。このビデオを見れば、十分に制御された実験で、ユニークなゲノム領域におけるさまざまなヒストン修飾のレベルを一貫して検出する方法を十分に理解できるはずです。

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

このプロトコルは、クロマチン免疫沈降（ChIP）はシグナル伝達経路によって誘導される転写を調節するクロマチンテンプレートに動的な変化を研究するために使用される方法について説明します。...

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。...

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。...

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

このプロトコルは出芽のイースト、Saccharomycesのcerevisiaeからの原産のchromatinの文脈の興味の単一コピー遺伝子座を浄化するために場所特定の組換えに基づいて位置特定のchromatinの隔離方法を示す。...

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

学ぶ 酵母におけるヒストン修飾のクロマチン免疫沈降法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、ゲノム全体でのヒストン修飾の存在量と局在を定量化し、遺伝子発現制御のメカニズムを解明する。

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

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