酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

このクロマチン免疫沈降プロトコルの全体的な目標は、出芽酵母ゲノム全体の定義された領域におけるヒストン修飾の存在量と局在を決定することです。この方法は、ヒストン修飾が遺伝子発現制御にどのように関連しているか、これらの修飾がさまざまな環境条件に応じてどのように変化するかなど、クロマチン制御における重要な疑問に答えるのに役立ちます。非常に汎用性の高いプロトコールで、一度に多くの異なるヒストン修飾や複数のE株を調べることができます。

この方法はヒストン修飾に関する洞察を提供しますが、エピトープタグや利用可能な抗体を使用して他のクロマチン結合タンパク質の研究にも適用できます。この手順は、酵母細胞を増殖させ、10ミリリットルのYPD培地に各適切な菌株の単一のコロニーを接種し、それを220rpmの振とうインキュベーターで一晩摂氏30度で増殖させることから始めます。培養物の600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定した翌日、新しいフラスコで培養物を100mLのYPDで0.2のOD600に希釈します。

細胞を摂氏30度で、220rpmの振とうインキュベーターで細胞を成長させ、中対数期に達するまで成長させます。培養物が中対数期に達したら、2.7ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを各フラスコの培地に直接加えて、最終濃度1%ホルムアルデヒドにします。フラスコを室温のシェーカーに移し、50rpmで15分間振とうします。

5ミリリットルの2.5モルグリシンを培地に加え、室温で50rpmで5分間振とうし続け、ホルムアルデヒドを急冷します。続いて、細胞をスピンダウンし、テキストプロトコルに記載されているように洗浄します。最後のスピン後に上清を取り除き、酵母溶解物の作成に進みます。

1ミリリットルの冷クロマチンアミノ沈殿液またはChIP溶解バッファーに、1ミリモルのPMSFと1:1000希釈の酵母プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えて細胞を再懸濁します。懸濁液を200マイクロリットルのガラスビーズが入った2.0ミリリットルのスクリューキャップチューブに移します。細胞をビーズ叩き装置に移し、摂氏4度で高速に攪拌します。

ビーズビートを30秒間、氷を1分間打ちます。ビーズビートを合計6回行い、30秒のビートビートごとに少なくとも1分間細胞を氷上に保持します。ゲルローディングチップを使用して、ライセートを1.5ミリリットルのチューブに移します。

ライセートを15,500gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを250マイクロリットルのマイクロコッカスヌクレアーゼ消化緩衝液に再懸濁します。各反応に2.5マイクロリットルのミクロコッカスヌクレアーゼを添加します。

4〜6回反転させて穏やかに混合し、すぐに摂氏37度の水浴で20分間インキュベートします。20分後、チューブを氷上に置いて反応を停止し、5ミリリットルの0.5モルEDTAを加えて最終濃度10ミリモルEDTAにし、反転して穏やかに混合します。15, 500 gで摂氏4度で15分間遠心分離します。

次に、各上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。最も一貫した結果を得るには、各アミノ沈殿に同じ濃度のタンパク質が使用されていることを確認することが重要です。アミノ沈殿またはIP反応の数に応じて、各マイクロコッカスヌクレアーゼ放出クロマチン画分とChIP溶解バッファーのマスターミックスを作成し、総タンパク質50μgを含む1ミリリットルを個々のチューブに割り当てます。

各IPミックスから100マイクロリットルを取り出して、インプットサンプルとして処理します。入力サンプルを摂氏20度で凍結して、後で使用できます。また、各免疫沈降に抗体に結合したビーズを同量使用することを確認することも重要です。

ワイドボードピペットチップを使用して、各IPサンプルに抗体をあらかじめ結合させた20マイクロリットルの磁性タンパク質AGビーズを追加します。サンプルを8rpm、摂氏4度で3時間回転させます。IPが完了したら、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズをチューブの側面に集めます。

ピペットを使用して上清を取り除きます。1ミリリットルのChIP溶解バッファーをビーズに加え、摂氏4度で8rpmで5分間回転させます。次に、チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除きます。

このようにして、ビーズを以下のバッファーで示された回数だけ連続して洗浄します。ChIP Lysis Buffer、High Salt Wash Buffer、LiCl/detergent Wash Buffer、および TE.最後のTE洗浄では、0.5ミリリットルのTEを使用してほとんどのビーズを新しいチューブに移し、次にさらに0.5ミリリットルのTEを使用してチューブを洗浄し、残りのビーズを移します。250マイクロリットルの新しく作成したChIP溶出バッファーを各チューブに加え、溶液を短時間ボルテックスします。

サンプルを室温で8rpmで15分間回転させます。チューブを磁気スタンドに置きます。上清を新しいチューブに慎重に移し、ビーズを避けます。

さらに250マイクロリットルのChIP溶出バッファーをビーズに加えます。サンプルを室温で8rpmで15分間回転させます。ビーズを乱さないように慎重に、上清を最初の溶出物を含むチューブに移します。

以前に収集したインプットサンプルを解凍し、各インプットサンプルに400マイクロリットルのChIP溶出バッファーを添加します。タンパク質DNA架橋を逆転させるには、インプットサンプルとIPサンプルの両方に、20マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム、5マイクロリットルのグリコーゲン、12.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを添加します。サンプルを摂氏65度の水浴で一晩インキュベートします。

この手順を開始するには、適切な量のQPCRミックス、フォワードプライマー、およびリバースプライマーを組み合わせて、プライマーの各セットに対してQPCRマスターミックスを作成します。1つの反応が0.5マイクロリットルのDNAと4.0マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を含む各DNAサンプルのDNAマスターミックスを作成します 384ウェルQPCRプレートの各ウェルに5.5マイクロリットルの適切なプライマーマスターミックスを追加します。プレートを200gで室温で1分間回転させます。

次に、4.5マイクロリットルの適切なDNAマスターミックスを各ウェルに加えます。プレートを密封し、室温で200gで1分間遠心します。95°Cで3分間、95°Cで10秒間、55°Cで30秒間の40サイクル、65°Cから95°Cまでの融解曲線を0.5°C刻みで5秒間、リアルタイムQPCRシステムを用いてQPCRを行います。

このプロトコールの重要な要素の1つは、クロマチンを可溶性フラグメントに消化するために使用されるミクロコッカスヌクレアーゼの濃度を最適化することです。この例は、クロマチンペレットをさまざまな量のミクロコッカスヌクレアーゼで消化した後に単離されたDNAのアガロースゲル電気泳動の結果であり、1マイクロリットルあたり20ユニットの2.5マイクロリットルの酵素が主にモノヌクレオソームを産生したことを示しています。この代表的なChIP実験では、野生型およびset1ノックアウト細胞において、ヒストンメチルマーカーH3K4me2およびヒストンH3に対する抗体を使用しました。

Set1ノックアウト細胞は、マークを触媒するメチルトランスフェラーゼを欠いていますバーは、示された低sciでのH3K4me2の相対濃縮を示しています。野生型株は、set1の直接の標的であることが知られている2つの遺伝子、PMA1およびERG11の5つのプライムエンドでH3K4me2の明確な濃縮を示しましたが、set1ノックアウト細胞ではシグナルは観察されませんでした。予想通り、TEL07LではH3K4me2マークの濃縮はなく、SPR3の発現もset1によって制御されていることが報告されていますが、これらの結果は、PMA1やERG11とは異なるメカニズムで制御が行われる可能性が高いことを示しています。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4日以内に行うことができます。この手順を試みる際には、適切なコントロールで特異性を得るために使用した抗体を慎重に試験することを忘れないようにすることが重要です。可能な場合は、陽性制御領域と陰性制御領域の両方をQPCRでプローブする必要があります。

この手順に続いて、ヒストン修飾の分布によってゲノムを決定するために、GPシーケンシングなどの他の方法も実行できます。このビデオを見れば、十分に制御された実験で、ユニークなゲノム領域におけるさまざまなヒストン修飾のレベルを一貫して検出する方法を十分に理解できるはずです。