Name: 環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶラットのエナメル器官微細解剖法。分泌期と成熟期のアメロブラストを分離し、エナメル形成の細胞分化段階を解析します。免疫組織化学を用いた定量的実験が可能で、歯科病理学研究に有用です。

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この仕事は、歯科医学の研究 (IFRO) の大学パリ ・ ディドロ、フランス国立衛生研究所と医学研究 (INSERM)、フランスの研究所によって賄われていた。

本研究で使用されるすべての動物は、ケアと農業 (A-75-06-12) フランスの省から実験動物の使用のためのガイドラインに従って維持されました。
1. 動物に対する毒性
<ol><li>このプロトコルを実行する前に必要な制度上の承認を取得、すべての動物のケアのガイドラインを遵守することを確認します。</li>
	<li>エナメル芽細胞分泌期および成熟期エナメル芽細胞に調査せずの影響をテストするためにさまざまな実験的グループの憲法を許可する研究プロトコルの設計を適用します。ここでは、フッ素 (NaF) の組み合わせでまたはない BPA (図 1 a)2への露出によって雄 Wistar ラットの 4 つのグループが構成されました。すべての動物の観察・解剖日 65 (図 1 b)。</li>
</ol>2. ラットから Hemi 下顎骨の解剖
<ol><li>必要に応じて別々 の頭に体の残りの部分から、斬首に続く、CO2窒息によるラットを安楽死させます。ラットは専用ボックス16で 5 分の CO2を公開します。</li>
	<li>#11 メスを使用して、下顎の前歯部に簡単にアクセスを得るために下の唇からすべてのスキンを削除します。</li>
	<li>同じメスでわずかな圧力で 2 つの前歯の間を切開を行い、下顎は 2 つの半分に分割されます。</li>
	<li>顎をデタッチするメスと一時的な下顎関節し、高級ピンセットでヘミ下顎骨を保持します。</li>
	<li>メスと周囲の軟部組織をカットし、筋肉、腱、靭帯、骨が完全にきれいになるまでスクレーパーを使用してを削除します。</li>
</ol>3. 切歯17,18の分離
<ol><li>慎重に刃を切歯の主要な長手方向軸と平行に配置することによって、骨を剃り落とします。頚部ループ近く切歯の終わりまで切歯 (近位端) の先端近傍の骨稜で開始します。切開モーションから近位遠位方向に進みます。</li>
	<li>遠位片側下顎骨の下顎を取り外して簡単に子宮頸のループまたはエナメル芽細胞 (図 2の赤い線) の分泌期を損なうことがなく、切歯が離陸を許可するメスと子宮頸のループに最初のカットを作る。</li>
	<li>モル、2 番目の下の 2 番目のカットを確認し、骨と切歯の内側表面の間メスを挿入します。すべての基底骨を持ち上げ、回転外側切歯とエナメル質を避けるために慎重にそれを取る器官のティッシュを損なう高級ピンセットを使用して。</li>
</ol>4. 両眼のレンズの下にエナメル器官のマイクロ郭清
<ol><li>生理食塩水リン酸緩衝 (PBS 1 X) 200 μ L ピペットを使用して切歯上にドロップします。高級ピンセットで切歯を上向き唇の表面に取る。メス、無色と組織のオレンジ色の部分の間をマークを確認します。このマークは、注目すべきその後 (図 2) は、基になる白斑に対応します。</li>
	<li>掘削機または同等のツールを分泌期 (無色) エナメル芽細胞と成熟期 (オレンジ) エナメル芽細胞の切歯の先端にメスのマークに対応する頂端にメスのマークから細胞の表面をこすり。</li>
	<li>以前説明した19としての転換期に対応する 2 mm の組織を削除します。間充織による汚染を避けるためにエナメル器官解剖時に、中切歯を開かないでください。</li>
	<li>前述の20としてすぐに切歯 (図 2) の頂端部に位置し頚部ループをカットします。</li>
	<li>10% ホルマリンまたは溶解溶液 (材料の表を参照) さらに捜査のためにそれを収集します。</li>
</ol>5. さらなる調査のための区切られたエナメル器官組織のコレクション
<ol><li>200 μ L の PBS 1 X バッファーを切歯にドロップします。</li>
	<li>#11 メス刃で慎重にデタッチ バッファーで徐々 に歯科の上皮細胞別に以前行ったメス マークの助けを借りて、ステージごとに。</li>
	<li>細胞 RNA とタンパク質の抽出は、蛋白質と Rna (材料の表を参照) を抽出できる換散溶液中の組織を置きます。 注: 組織ショベル管で均質な混合物を得るまでセルを研削、高品質 Rna を準備します。混合物は、前述した2,8,17製造元の手順に従って RNA および蛋白質の抽出の準備ができて。通常、約 5-10 μ g 合計各準備を Rna と 150 μ g タンパク質を入手します。</li>
	<li>組織学的解析、免疫組織染色 (IHC) との in situハイブリダイゼーション (っぽい)、2 h、4 ° c 1 × PBS でストアの 10% ホルマリンで細胞層を置きます。組織することができます埋め込むワックス ・ パラフィンの組織 10 月凍結切片の。</li>
	<li>EMP 抽出の高級ピンセットで切歯を取る。空気 (若干の脱水) に短い暴露後白い斑点はエナメル質の石灰化の開始を表す切歯の唇面の中央部の周り表示されます。このホワイト スポット対応に移行-/初期のエナメル芽細胞、成熟期だから指標として EMPs21の抽出のためそれを使用します。</li>
</ol>

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

エナメル質欠損の特性が、変化の理解を開発を助けるかもしれない変えられたエナメル芽細胞活性および/または混乱したエナメル芽細胞増殖・分化・成熟プロセス鉛不可逆的なエナメル質欠損し、順番、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞の活動。したがって、孤立したエナメル器官の研究は、エナメルの欠陥がどのような環境や遺伝、その起源につながる病理のイベントを明らかにする決定要因です。
この手法は、もともとヒラーらが記載されています。17 ・ ロビンソンら18日、エナメル器官分化の各段階に特定の効果を発揮する使用されます。それは、EMP 抽出19,24,25適応されています。我々 は現在エナメル器官の主要な部分を分離し、Rna とタンパク質 (おそらく内極細胞蛋白質) 量的・質的分析をさ...

環境毒性や不適切な生活習慣1,2,3,4への暴露から多く発達エナメル質の欠損があります。中断イベント、現在記載されている手順を使用してエナメル質形成の分子の特性、いくつかの有害物質への暴露の早いマーカーとして結果エナメル質欠損の使用を推進しの健康の歴史の再構成のために役立つことがあります。エナメル質が synthetized1,2周産期の期間それぞれの患者。エナメル合成は、エナメル芽細胞活動5によって 4 つの段階に分けることができます。最初のステップでは、前駆体細胞および pre-エナメル芽細胞増殖を再びグループ化します。2 番目の段階では、差別化されたエナメル芽細胞はエナメル基質タンパク質 (体)、主にアメロゲニン、エナメリン、アメロブラスチン、最終的なエナメル質の厚さを決定するを分泌します。したがって、EMP 合成の中断は、エナメル質の定量的欠陥につながります。におけるエナメル質の厚さの堆積後成熟段階を開始します。この段階で、幅と厚さにおけるアパタイト結晶の成長により重量最大 96% の生体組織は、最高の鉱化作用の割合に到達するエナメル質ができます。質的に成熟段階鉛中に発生する中断イベントはエナメルの欠陥です。最後に、エナメル、齧歯動物の色素沈着とも呼ばれる後の成熟の段階に入るし、歯噴火しエナメル質欠損 (もしあれば) 取り返しのつかない不可逆的なアポトーシスを受ける、欠陥の潜在的な回顧記録を提供エナメル芽細胞と強調しました。齧歯動物、エナメル、同様の一連のイベントがそれらをエナメルの一般的なプロセスを検討する適切なモデルの歯が成長し続ける特殊性で移動できます。したがって、エナメルの中断のエナメル質および/または中断イベントの時間ウィンドウの種類に応じて、数量の変更の結果します。その意味で、ダイオキシン類、鉛、および内分泌撹乱化学物質ビスフェノール A (BPA)、ゲニステイン、ビンクロゾリンなどへの暴露は、エナメル hypomineralizations1,2,3 を生成する示されています。 ,6,7,8。非対称白い不透明な斑点は、胎児期、出生1後最初の月の間に低用量 BPA 用量に暴露したラットの切歯に同定されました。これらのエナメル質欠損ラットと人間の臼歯切歯 hypomineralization (MIH) の類似した臨床的、構造的、生化学的特性を共有します。MIH は最近は、歯のエナメル質の病理病因まだ残る多くの因果関係の要因にもかかわらず不明9,10の9,10,11 に仮定されたこと ,12。
環境要因のための別の重要なエナメル hypomineralization 病理は歯の弗素症 (DF)、フッ化物の過剰吸収の結果である (> 0.1 mg/kg/日)13,14。フッ化物の主な情報源は、飲料水は、補足またはフッ化物で自然豊かです。フッ化物は、齲蝕予防にもしばしば処方が、予防的投与量はわずか 50% 毒性の 1 つよりも低い (0.05 mg/kg/日)。MIH と DF、環境要因への暴露から生じる 2 つの頻繁に病態が生じる内分泌かく乱化学物質2など他の有害物質とフッ化物の hypomineralizing 効果の増強により特徴付けられる必要がある共通の機能またはアモキシシリン15。
異なる分化段階でエナメルを含むラット エナメル器官の郭清のマイクロは、エナメル芽細胞の活動を妨害し、歯の噴火後診断されるエナメル質欠損を引き起こすことができる分子の作用のメカニズムを理解するのに役立ちます。つまり、環境毒性のためエナメル質遺伝子発現とエナメル マトリックス組成の変化の特性評価、有害物質への暴露の歴史の再構成ができ、環境安全の公共の監視が容易になります健康。

<table><tbody><tr><td>ビスフェノール A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン 10%</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagent</td><td>Euromedex, France</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen, Les Ulis, France</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Androgen receptor antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330。フ</td><td></td></tr><tr><td>ッ化ナトリウム(NaF)</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td><td>州S-1504</td><td></td></tr><tr><td>パラプラストレギュラー</td><td>ライカマイクロシステム、ナンテールセデックス、&nbsp;フランス</td><td>39601006</td>テキスト<td></td></tr><tr><td>組織OCT</td><td>VWR、Fontenay-sous-Bois、フランス</td>でwas / parafinと呼ばれています <td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Curved Scalpel Blade</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖ナイフ - ファイン/ストレートチップ</td><td>PHYMEP、パリ、フランス</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>サークルナイフ</td><td>PHYMEP、パリ、フランス</td><td>10059-15</td><td></td></tr>メス<tr><td>の刃n&deg;11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>双眼レンズ</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp;フランス</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

環境条件や生活の方法から生じるエナメル質欠損、彼らの高い有病率のため公衆衛生の懸念されます。これらの欠陥はエナメル合成エナメル エナメル器官であるという責任がある細胞の活性変化に起因します。、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞増殖、分化、死のイベントの具体的かつ正確なシーケンスに従ってください。ラットの切歯を継続的に成長、生理学的および病理学的条件でエナメル芽細胞活動と分化段階を研究する適切な実験的モデルです。ここでは、我々 はマイクロ分析環境有害物質に暴露したラットのエナメル器に信頼性の高い一貫した方法をについて説明します。ミクロ解剖歯科上皮には分泌と成熟期エナメル芽細胞in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学的アッセイなどの定性的な実験のためだけでなくなどの定量に使用できるにはが含まれてRT qPCR、RNA シーケンスおよび西部にしみが付くこと。

多くは欠陥をエナメル質など歯の弗素症12,13、フッ化物の過剰吸収による環境条件に起因またはエナメルの hypomineralization いくつかの内分泌かく乱化学物質の1、への露出により MIH のよう7,22。これらの発達のエナメル質の欠損は実験的ラット (図 1)1,2,7,23,24</su...

エナメル質の形成と変化を理解すると、エナメル芽細胞活性の検討が必要です。ここでは、さらに定量的および定性的な実験プロシージャで使用可能性があります分泌と成熟期エナメル芽細胞を含むエナメル器官のマイクロ分析する信頼性と一貫性のある手法について述べる。

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

この手順の全体的な目標は、ラットのエナメル質器官をマイクロ解剖し、エナメル質合成中の細胞分化の主な段階に従って歯の上皮を分離することです。この方法は、歯のフッ素症、大臼歯の切歯の高エナメル化、遺伝性エナメル質の起源の不完全性など、エナメル質の病状の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、事前の治療なしに免疫組織化学などの定量的実験を使用して歯科細胞をさらに分析する能力であり、この方法は、血液発生を混乱させることができる内因性および外因性分子の分子メカニズムに対する洞察を提供することができますが、免疫組織化学などの結果的な調査を行うことができます。実験ラットを安楽死させた後、11番のメスを使用して下唇からすべての皮膚を取り除き、下切歯に簡単にアクセスできるようにします。次に、同じメスで、2つの下切歯の間に切開を行います。軽い圧力をかけると、下顎骨が2つに分かれます。次に、メスで側頭-下顎関節を切開して顎を切り離し、細かいピンセットで半顎骨を保持します。次に、メスで周囲の軟部組織を切断し、骨が完全にきれいになるまでスクレーパーを使用してすべての筋肉、腱、靭帯を取り除きます。切歯を分離するには、切歯の長手方向軸に平行に刃を配置して骨を慎重に削り取ります。切歯の先端近くの骨の隆起部からシェービングを開始し、切歯のもう一方の端、頸部ループの近くに向かって作業します。次に、メスで頸部ループの遠位に切開を行い、半顎骨のゴニオンを取り除き、頸部ループやエナメル芽細胞の分泌期を損傷することなく切歯を簡単に取り外すことができます。次に、第二大臼歯の下に2番目の切り込みを入れ、骨と切歯の内側表面の間にメスを挿入します。基底骨がすべて持ち上げられたら、切歯を外側に回転させ、エナメル質臓器組織に損傷を与えないように細いピンセットを使用して慎重に取り除きます。これで、切歯全体が分離されました。解剖のために、切歯を60ミリメートルの皿またはプレートに200マイクロリットルのPBSで覆います。まず、前述のように、切歯の頂端部分のすぐ位置にある頸部ループを切断します。次に、唇面を上にして、細かいピンセットで切歯をつかみ、組織の無色部分の端にメスの印を付けます。このマークは、後で観察できる基礎となる白い斑点に対応しています。次に、掘削機または同等のツールを使用して、マークから頂端まで細胞表面を削り取ります。これは無色の分泌期のエナメル芽細胞に対応します。次に、オレンジ色の部分の始めに、成熟期のエメル芽球に対応したメスマークをつけ、メスマークから切歯の先端まで削り取ります。次に、移行期のエナメル芽細胞に対応する2ミリメートルの組織を切除します。エナメル質臓器の解剖中は切歯を開かないでください、これは解剖された組織を間葉で汚染します。最後に、さらなる調査のために組織を10%ホルマリンまたは溶解液に保存します。エナメル質マトリックスタンパク質抽出の場合は、唇面の中央部分の周りに白い斑点が見えるまで、切歯を溶液から短時間取り出します。このスポットは、エナメル質の石灰化の開始を表しており、初期段階のエナメル芽細胞への移行に対応しています。組織のこの領域を切り取り、必要に応じて治療します。除去した組織が細胞のRNAおよびタンパク質の抽出用である場合は、市販のキットを使用して抽出を行います。除去した組織を溶解液に移し、それを均質な混合物に粉砕します。組織学的解析、免疫組織化学、およびNC2ハイブリダイゼーションでは、採取した組織を室温で2時間10%ホルマリンに入れます。次に、組織をPBSに移し、摂氏4度で保存します。その後、組織はワックスパラフィンまたは組織OCTのいずれかに埋め込むことができます。雄のオジロネズミの4つのグループは、BPAと組み合わせたフッ化物への曝露または非曝露に応じて構成されました。記載されているように、すべての動物を65日目に観察および解剖しました。マイクロ解剖したエナメル組織の品質は、トリクロームマッソン染色を使用してチェックしました。顕微鏡観察では、典型的なエナメル質上皮細胞とエナメル芽細胞のパロサイドが見られます。間葉系汚染の欠如は、コラーゲングリーン染色の欠如によって証明されました。分泌期のエナメル芽細胞はエナメルを発現します。成熟期のエナメル芽細胞は、カリキン4を発現し、フェラチンも高レベルで含んでいるため、エナメル質のオレンジ色の原因となる鉄を大量に貯蔵する能力があります。これらのRNAは、間葉系細胞ではなく、アメル芽細胞によって優先的に発現されます。一方、コラーゲンは、エナメル芽細胞ではなく、間葉細胞によって発現されます。次に、免疫組織化学を使用して、分泌期または成熟期のアメル芽球における4つの特定のタンパク質をスコアリングしました。例えば、緑色で見られるアンドロゲン受容体は、成熟期のエナメル芽細胞に特異的に局在しています。このビデオを見た後、あなたはどのようにマイクロ解剖、分泌と成熟段階のエナメル質器官との間の成功した分離のためのげっ歯類のエナメル質器官のエナメル芽細胞についてのよく理解しているはずです。このアプローチは、エナメル質疾患の病理学的および生理学的に関与するin vivoの主要因子メカニズムを理解するのに非常に役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

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環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

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